高壓脈沖電場(chǎng)咖啡液滅菌實(shí)驗(yàn)及跨膜電壓仿真研究

李 峰，劉 昊，董 會(huì)，魏建華

(1.上海電力大學(xué)電氣工程學(xué)院，上海 200090； 2.中國(guó)工程物理研究院，四川 綿陽 621000)

1 引言

高壓脈沖電場(chǎng)(High voltage Pulsed Electric Field，HPEF)滅菌技術(shù)，具有處理時(shí)間短、能耗低、滅菌效率高、溫升小、不會(huì)破壞液體食品的風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)成分等優(yōu)勢(shì)，廣泛用于液體食品的加工。該技術(shù)通過施加高壓脈沖電場(chǎng)，在微生物細(xì)胞膜上形成跨膜電壓，致使細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)受損，最終達(dá)到滅菌的目的。

早在1967年，英國(guó)學(xué)者就發(fā)現(xiàn)25 kV/cm的直流脈沖能有效致死營(yíng)養(yǎng)菌和酵母菌[1]。在PEF滅菌技術(shù)中，通過研究電場(chǎng)強(qiáng)度和脈沖作用時(shí)間等可以探索微生物滅活規(guī)律。文獻(xiàn)[2]研究了高壓脈沖電場(chǎng)對(duì)胡蘿卜汁等液體食品的非熱滅菌效果，滅菌效果相當(dāng)可觀，并分析了影響滅菌效果的因素以及滅菌機(jī)理。張婕等人基于高壓脈沖電場(chǎng)滅菌技術(shù)對(duì)生牛乳進(jìn)行處理，分析了影響處理效果的因素，研究證實(shí)增大脈沖寬度能夠降低牛奶中單細(xì)胞微生物的數(shù)目，處理完成后牛奶溫度上升幅度較小[3]。盡管對(duì)于高壓脈沖電場(chǎng)滅菌技術(shù)的研究較多，但是目前仍然處于初級(jí)階段，現(xiàn)有的技術(shù)還不夠成熟，其在工業(yè)上的應(yīng)用主要集中于果汁、牛奶等液體食品中?？Х茸鳛槭澜缟献盍餍械娘嬃现唬絹碓绞艿饺藗兊南矏?，然而針對(duì)咖啡液的高壓脈沖電場(chǎng)滅菌技術(shù)研究非常少，需要深入研究相應(yīng)的滅菌規(guī)律和滅菌工藝，為該技術(shù)在咖啡滅菌應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)和技術(shù)支撐。

良好的高壓脈沖電場(chǎng)處理系統(tǒng)是殺菌技術(shù)得以應(yīng)用的前提，設(shè)計(jì)的關(guān)鍵是高壓脈沖發(fā)生器和處理腔。本文設(shè)計(jì)并搭建了一套高壓脈沖電場(chǎng)滅菌裝置，對(duì)其輸出電壓波形進(jìn)行了仿真。在此基礎(chǔ)上，研究了其對(duì)咖啡液酵母菌的滅菌效果，探索了脈沖電壓、充電電容、脈沖時(shí)間對(duì)滅菌效果的影響規(guī)律，推導(dǎo)了單個(gè)酵母菌細(xì)胞在脈沖電場(chǎng)中的跨膜電壓計(jì)算公式，并利用有限元法建立了單個(gè)酵母菌細(xì)胞跨膜電壓仿真模型，得到酵母菌在高壓脈沖電場(chǎng)下的跨膜電壓分布規(guī)律，為工藝改進(jìn)及實(shí)際生產(chǎn)提供了指導(dǎo)。

2 實(shí)驗(yàn)方法及實(shí)驗(yàn)設(shè)備

2.1 實(shí)驗(yàn)方法

本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)并制作了一套高壓脈沖電場(chǎng)滅菌裝置，可產(chǎn)生波形為指數(shù)衰減波的脈沖電場(chǎng)，將脈沖電場(chǎng)施加在植入了酵母菌的咖啡液上，探究高壓脈沖電場(chǎng)滅菌技術(shù)在咖啡液中的可行性。影響高壓脈沖電場(chǎng)滅菌率的主要參數(shù)為脈沖電壓、脈沖寬度、脈沖作用時(shí)間，以此為基礎(chǔ)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)探究。

本實(shí)驗(yàn)使用的高壓脈沖電場(chǎng)滅菌裝置主要由高壓脈沖電源回路、處理腔、蠕動(dòng)泵、物料罐、檢測(cè)裝置組成[4,5]。

通過蠕動(dòng)泵將咖啡液物料管中的試品送入循環(huán)系統(tǒng)中，試品通過處理腔時(shí)，在高壓脈沖電源的作用下滅菌，再流回物料管，滅菌進(jìn)行到一定時(shí)間時(shí)，在循環(huán)系統(tǒng)的取料口進(jìn)行取樣檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)接線簡(jiǎn)圖如圖1所示。

圖1 實(shí)驗(yàn)接線簡(jiǎn)圖Fig.1 Schematic diagram of experimental wiring

2.2 滅菌效果檢測(cè)方法

在檢測(cè)滅菌效果時(shí)，依據(jù)GB/T 4789.15—2016標(biāo)準(zhǔn)實(shí)現(xiàn)酵母菌群的計(jì)數(shù)過程，采用平板計(jì)數(shù)法，使用37XB-PC光學(xué)生物顯微鏡進(jìn)行計(jì)數(shù)。滅菌效果用酵母菌細(xì)胞殘活率S來表示，公式如下[6]：

(1)

式中，N為脈沖電場(chǎng)處理后樣品中的菌落數(shù)；N0為脈沖電場(chǎng)處理前樣品中的菌落數(shù)。

2.3 高壓脈沖發(fā)生器

高壓脈沖發(fā)生器是高壓脈沖裝置的核心，為滅菌系統(tǒng)提供電源。從結(jié)構(gòu)上看，可以劃分為多個(gè)部分，包括升壓變壓器、整流模塊、調(diào)壓器和觸發(fā)開關(guān)[7]。根據(jù)脈沖波形的不同可分為方波、指數(shù)衰減波、振蕩衰減波等。綜合考慮到性能以及成本的要求，本電路結(jié)構(gòu)如圖2所示，輸出波形為指數(shù)衰減波。

圖2 高壓脈沖電源工作原理電路圖Fig.2 Working principle circuit diagram of high voltage pulse power supply

圖2中，AC為工頻交流電源，T為升壓變壓器,D1～D4為四個(gè)2 CL/40 kV/5 A型號(hào)的高壓二極管，R為阻值10 kΩ的充電電路保護(hù)電阻，C1為充電電容兼做濾波電容，S1為旋轉(zhuǎn)火花開關(guān)，虛線框內(nèi)為處理腔，可以等效為并聯(lián)的電容CX和電阻RX。

工頻電源經(jīng)過升壓變壓器T升壓之后，再通過四個(gè)高壓二極管D1～D4組成的高壓整流硅堆整流，向高壓電容器C1充電，電容器上儲(chǔ)存的電能在旋轉(zhuǎn)火花開關(guān)S1閉合的瞬間，向處理腔中的咖啡液放電，從而形成高壓脈沖電場(chǎng)，脈沖電壓的幅值等于充電電壓最大值[8]。

將實(shí)驗(yàn)元器件參數(shù)輸入到Matlab仿真模型中，得到的高壓脈沖電源輸出電壓波形如圖3所示，使用示波器實(shí)測(cè)得到的高壓脈沖電源輸出電壓波形如圖4所示。仿真結(jié)果顯示波形為指數(shù)衰減波，實(shí)測(cè)波形與仿真波形相一致，滿足設(shè)計(jì)要求。

圖3 高壓脈沖輸出仿真波形圖Fig.3 Simulation waveform of high voltage pulse output

圖4 高壓脈沖輸出實(shí)測(cè)波形圖Fig.4 Measured waveform of high voltage pulse output

2.4 處理腔

處理腔可以將電源形成的高壓脈沖電場(chǎng)施加到流經(jīng)其中的咖啡液上，以達(dá)到滅殺咖啡液中酵母菌的效果。

處理腔在結(jié)構(gòu)上可分為平板電極處理腔、針板電極處理腔和同軸圓柱電極處理腔。根據(jù)處理液體是否循環(huán)流動(dòng)，可分為靜置處理腔和動(dòng)態(tài)處理腔[9]。平板電極處理腔制造簡(jiǎn)單，但比較難獲得較高場(chǎng)強(qiáng)，對(duì)高壓脈沖電源的要求較高；而針板處理腔有效處理區(qū)域較小，處理效率低。綜合考慮成本及處理效率問題，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)并制造了動(dòng)態(tài)同軸圓柱電極處理腔[10,11]，其結(jié)構(gòu)如圖5所示。

圖5 同軸圓柱處理腔Fig.5 Coaxial cylindrical processing cavity

同軸圓柱電極處理腔的電場(chǎng)屬于稍不均勻電場(chǎng)，在實(shí)驗(yàn)電壓下不會(huì)出現(xiàn)火花放電，能夠有效防止電極電解對(duì)于咖啡液的污染，保證較高的食品質(zhì)量。

由于咖啡液電導(dǎo)率較高，處理腔的電極應(yīng)采用高強(qiáng)度、高電導(dǎo)性材料；絕緣部分應(yīng)采用絕緣強(qiáng)度高、耐高溫且支撐性強(qiáng)的材料。所以電極材料采用不銹鋼，絕緣密封材料為聚四氟乙烯。處理腔內(nèi)電極半徑為8 mm，外電極內(nèi)半徑為12 mm，有效處理長(zhǎng)度為100 mm。進(jìn)料口和出料口位于外電極上相反的兩側(cè)，內(nèi)半徑3 mm，外半徑4 mm，使整個(gè)處理腔可以通過硅膠軟管接入到循環(huán)系統(tǒng)中。

2.5 實(shí)驗(yàn)參數(shù)

本次研究中利用了不同的脈沖電壓幅值和充電電容對(duì)咖啡液進(jìn)行滅菌處理，相關(guān)的參數(shù)見表1。

表1 高壓脈沖實(shí)驗(yàn)參數(shù)Tab.1 High voltage pulse experimental parameters

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

3.1 脈沖電壓幅值對(duì)處理效果的影響

對(duì)接種酵母菌的咖啡液，保持充電電容和實(shí)驗(yàn)時(shí)間不變，施加不同幅值波形為指數(shù)衰減波的脈沖電壓。觀察實(shí)驗(yàn)前后咖啡液中的酵母菌菌群，經(jīng)過高壓脈沖電場(chǎng)滅菌后的殘活率如圖6所示。

圖6 電壓對(duì)酵母菌殘活率的影響Fig.6 Effects of voltages on yeast viability

由圖6可知，隨著脈沖電壓的增大，咖啡液中的酵母菌細(xì)胞殘活率降低。

脈沖電壓幅值主要影響處理腔電場(chǎng)強(qiáng)度，處理腔電場(chǎng)強(qiáng)度與脈沖電壓幅值之間的關(guān)系為：

(2)

式中，E為處理腔電場(chǎng)強(qiáng)度；U為脈沖電壓幅值；a、b分別為內(nèi)電極半徑和外電極內(nèi)半徑；r為所求位置與軸心的距離[12]。

通過計(jì)算可得到不同脈沖電壓下的處理腔電場(chǎng)強(qiáng)度(見表2)，結(jié)果表明，對(duì)于固定處理腔，施加的脈沖電壓越大，對(duì)應(yīng)的電場(chǎng)強(qiáng)度也就越大。根據(jù)文獻(xiàn)[12]，酵母菌殘活率隨著電場(chǎng)強(qiáng)度增大而降低。所以理論上脈沖電壓越大，滅菌效果會(huì)越好。

表2 電場(chǎng)強(qiáng)度與脈沖電壓幅值的關(guān)系Tab.2 Relationship between electric field strength and pulse voltage

3.2 充電電容對(duì)滅菌效果的影響

保持脈沖電壓幅值與實(shí)驗(yàn)時(shí)間不變，使用不同的充電電容進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。經(jīng)過高壓脈沖電場(chǎng)滅菌后酵母菌的殘活率如圖7所示。

圖7 充電電容對(duì)酵母菌殘活率的影響Fig.7 Effect of charging capacitance on residual viability of yeast

結(jié)果表明：在相同的脈沖電壓下，充電電容越高，酵母菌殘活率越低。

充電電容主要影響單次充電所儲(chǔ)存的能量，該能量可以通過式(3)計(jì)算得到：

(3)

式中，C1為儲(chǔ)能電容的容量；Um為充電電壓的最大值；EC為電容充電儲(chǔ)存總能量。充電完成后，電容儲(chǔ)存的能量通過旋轉(zhuǎn)開關(guān)后施加到處理腔上，處理腔的釋放能量與放電電壓的時(shí)間關(guān)系為：

(4)

式中，EO為單次釋放的能量；t為放電時(shí)間；ZX為處理腔阻抗。釋放能量時(shí)，儲(chǔ)能電容的放電效率為[13]：

(5)

實(shí)驗(yàn)中，由于電容需要多次充放電，所以不考慮放電電壓約束的影響，放電效率近似等于100%，可以認(rèn)為總能量在一次放電過程中全部釋放。充電電壓不變的情況下，電容C1容量越大，儲(chǔ)存的能量EC越多，單次釋放的能量EO也就越多。處理腔阻抗恒定，所以釋放的能量越多，能量在處理腔上的釋放時(shí)間t越長(zhǎng)，對(duì)酵母菌產(chǎn)生的累積效應(yīng)越明顯，滅菌效果越好。

3.3 實(shí)驗(yàn)時(shí)間對(duì)處理效果的影響

使用10 kV的脈沖電壓，1 μF的充電電容，對(duì)試品處理40 min，從10 min開始，每隔5 min進(jìn)行取樣檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖8所示。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：施加高壓脈沖電場(chǎng)的時(shí)間越長(zhǎng)，酵母菌殘活率越低，并且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，殘活率降低的速度越來越慢。

在脈沖頻率一定的情況下，實(shí)驗(yàn)時(shí)間越長(zhǎng)，施加的脈沖數(shù)目越多，高壓脈沖電場(chǎng)對(duì)酵母菌細(xì)胞膜跨膜電壓的累積效應(yīng)越明顯。即脈沖數(shù)目累積得越多，滅菌效果越好。隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間的延長(zhǎng)，咖啡液中存活的酵母菌濃度會(huì)降低，根據(jù)文獻(xiàn)[14]，酵母菌濃度越低越難滅活，所以殘活率降低的速度會(huì)越來越慢。

分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果可得，增大充電電容、延長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)時(shí)間是通過時(shí)間的累積效應(yīng)促進(jìn)滅菌，并且都存在一定的邊際效應(yīng)。所以脈沖電壓對(duì)酵母菌殘活率的影響最明顯且最值得研究。

4 高壓脈沖電場(chǎng)下的酵母菌跨膜電壓

根據(jù)第3節(jié)分析，脈沖電壓是酵母菌失活最主要的影響因素，符合電崩解理論對(duì)高壓脈沖電場(chǎng)滅菌技術(shù)的機(jī)理解釋[15]。

4.1 電崩解理論

圖9為電崩解過程示意圖，電崩解理論認(rèn)為，在高壓脈沖電場(chǎng)的作用下，酵母菌細(xì)胞膜內(nèi)外兩側(cè)產(chǎn)生了電勢(shì)差，即跨膜電壓。在跨膜電壓的作用下，細(xì)胞膜的厚度減小，并且外部電場(chǎng)的電壓越大，其厚度減小越明顯。如果跨膜電壓增大到某個(gè)閾值，細(xì)胞膜會(huì)被擊穿，由此導(dǎo)致崩解孔的形成。但是該過程具有一定的可逆性，即在崩解孔面積較小時(shí)，外加電場(chǎng)消失，崩解孔能夠愈合。崩解孔面積在細(xì)胞膜表面積中占比過大，或者崩解孔的面積較小，但是長(zhǎng)期受到脈沖電場(chǎng)影響的情況，都不具備可逆性。發(fā)生不可逆擊穿之后，細(xì)胞膜內(nèi)外的物質(zhì)將會(huì)自由地交換，最終使細(xì)胞死亡。研究表明，跨膜電壓大于1 V時(shí)，酵母菌便會(huì)死亡[16]。

圖9 電崩解過程示意圖Fig.9 Schematic diagram of electric disintegration process

4.2 酵母菌跨膜電壓分析

4.2.1 酵母菌跨膜電壓數(shù)學(xué)模型

基于電崩解理論，對(duì)酵母菌的跨膜電壓進(jìn)行分析計(jì)算，為了降低分析的復(fù)雜度，采用正球形的酵母菌模型如圖10所示。在構(gòu)建模型時(shí)，對(duì)酵母菌細(xì)胞各個(gè)部分的參數(shù)進(jìn)行合理設(shè)置，其中細(xì)胞膜內(nèi)、外半徑依次表示為rz、rc，細(xì)胞質(zhì)的介電常數(shù)和電導(dǎo)率為εz、σz，細(xì)胞膜的介電常數(shù)和電導(dǎo)率為εm、σm，咖啡液的介電常數(shù)和電導(dǎo)率為εc、σc，電場(chǎng)方向與細(xì)胞膜上點(diǎn)的法線夾角為θ。

圖10 酵母菌單細(xì)胞理想模型Fig.10 Ideal single cell model of yeast

在研究過程中假設(shè)細(xì)胞質(zhì)以及細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)屬于線性、各向同性材料，細(xì)胞膜相對(duì)介電常數(shù)較小，可以等效為絕緣球殼，所以各個(gè)點(diǎn)的電勢(shì)符合Laplace方程，在球坐標(biāo)系下的具體形式如下所示[17]:

(6)

以細(xì)胞中心O為原點(diǎn)，高壓脈沖電場(chǎng)的方向?yàn)閺淖笙蛴?，利用分離變量法將式(6)轉(zhuǎn)換為L(zhǎng)egendre方程，根據(jù)膜電勢(shì)的實(shí)際情況，結(jié)合Legendre方程的解可以得到酵母菌各個(gè)位置上的電勢(shì)：

(1)當(dāng)0

(7)

(2)當(dāng)rz≤r≤rc時(shí)

(8)

(3)當(dāng)rc

(9)

式中，Pn為勒讓德函數(shù)；An、Bn、Cn、Dn為和n有關(guān)的系數(shù)，結(jié)合式(2)進(jìn)行求解。根據(jù)參考文獻(xiàn)[18]中的求解過程，即可得到各個(gè)位置的電勢(shì)?？缒る妷簽榧?xì)胞膜內(nèi)側(cè)電勢(shì)Фz、外側(cè)電勢(shì)Фc形成的電勢(shì)差，可以表示為ΔФm。解得電極間距為d的處理腔中，位于距離軸心r的單個(gè)酵母菌跨膜電壓如下所示：

ΔΦm=

(10)

4.2.2 酵母菌跨膜電壓仿真模型

為了仿真分析酵母菌跨膜電壓，本實(shí)驗(yàn)使用Comsol Multiphysics仿真軟件，根據(jù)式(10)構(gòu)建仿真模型，仿真計(jì)算參數(shù)[19]見表3。

表3 酵母菌細(xì)胞參數(shù)Tab.3 Yeast cell parameters

酵母菌細(xì)胞等效為正球形，所以使用二維模型即可準(zhǔn)確反應(yīng)跨膜電壓分布情況。

取處理腔軸心垂直方向的截面，其中H為高壓電極，N為接地電極，在高壓電極上施加6 kV的脈沖電壓，仿真得到電場(chǎng)強(qiáng)度分布如圖11所示[20]。

圖11 脈沖電壓6 kV處理腔電場(chǎng)強(qiáng)度分布Fig.11 Electric field intensity distribution of 6 kV applied voltage treatment chamber

由處理腔電場(chǎng)強(qiáng)度分布可知，緊靠接地電極處電場(chǎng)強(qiáng)度最小，如果位于最小場(chǎng)強(qiáng)處的某個(gè)酵母菌，跨膜電壓能達(dá)到發(fā)生電崩解的臨界值，即可說明在處理腔其他任意位置的酵母菌，跨膜電壓都大于臨界值，高壓脈沖電場(chǎng)可以有效滅殺酵母菌。

為了獲得與圖10中相同方向的電場(chǎng)，酵母菌細(xì)胞位置選擇在處理腔內(nèi)部右側(cè)，且緊靠接地電極，選取的酵母菌位置如圖12所示。在此位置上的酵母菌單細(xì)胞，細(xì)胞膜的電場(chǎng)強(qiáng)度分布如圖13所示。

圖12 酵母菌在處理腔中的位置Fig.12 Position of yeast in treatment chamber

圖13 酵母菌細(xì)胞膜電場(chǎng)強(qiáng)度分布Fig.13 Electric field intensity distribution of yeast cell membrane

在二維平面上，酵母菌細(xì)胞等效為兩個(gè)半徑不等的同心圓，內(nèi)、外半徑分別為rz、rc，細(xì)胞膜內(nèi)外側(cè)電勢(shì)分別為Фz、Фc。

4.2.3 高壓脈沖電場(chǎng)滅菌的可行性

以細(xì)胞膜上A點(diǎn)為起始點(diǎn)，順時(shí)針旋轉(zhuǎn)θ度，0°<θ<360°，計(jì)算所有角度上Фz、Фc差的絕對(duì)值，得到的值即為跨膜電壓ΔФm。單個(gè)酵母菌細(xì)胞跨膜電壓分布如圖14所示。

圖14 酵母菌細(xì)胞跨膜電壓分布曲線Fig.14 Transmembrane voltage distribution curve of yeast cells

通過模擬仿真結(jié)果可得，位于處理腔接地電極附近的酵母菌細(xì)胞，最大跨膜電壓仍可達(dá)1.772 V。即在處理腔的任意位置，酵母菌在高壓脈沖電場(chǎng)下的跨膜電壓都大于1 V，細(xì)胞膜發(fā)生不可逆擊穿，酵母菌細(xì)胞死亡[21]。說明本文中搭建的高壓脈沖電場(chǎng)滅菌裝置可以應(yīng)用于咖啡液滅殺酵母菌。

4.2.4 脈沖電壓幅值與酵母菌殘活率的關(guān)系

改變脈沖電壓幅值，計(jì)算同一位置上單個(gè)酵母菌的最大跨膜電壓，計(jì)算結(jié)果如圖15所示。

圖15 跨膜電壓與脈沖電壓關(guān)系Fig.15 Relationship between transmembrane voltage and pulse voltage

脈沖電壓越大，固定位置上單個(gè)酵母菌的跨膜電壓越大。根據(jù)電崩解理論，跨膜電壓越大，細(xì)胞膜越容易發(fā)生不可逆擊穿，酵母菌越容易致死，酵母菌殘活率越低[22]?？梢缘玫浇Y(jié)論，脈沖電壓越大，酵母菌殘活率越低，和實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。

通過仿真可以分析不同位置、不同脈沖電壓、不同體積的酵母菌跨膜電壓分布規(guī)律，仿真結(jié)果與實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符合。利用仿真指導(dǎo)后續(xù)實(shí)驗(yàn)，可以降低實(shí)驗(yàn)的時(shí)間和經(jīng)濟(jì)成本。

5 結(jié)論

(1)采用高壓脈沖電場(chǎng)技術(shù)，可以滅殺咖啡液中的酵母菌。實(shí)驗(yàn)表明：酵母菌的殘活率隨脈沖電壓的增大而降低，隨充電電容的增大而降低，隨脈沖時(shí)間的增加而降低。

(2)酵母菌在高壓脈沖電場(chǎng)作用下死亡，是因?yàn)榭缒る妷旱拇嬖?。利用分離變量法求解Laplace方程可以求得單個(gè)酵母菌跨膜電壓公式，以此為基礎(chǔ)可以進(jìn)行仿真分析。

(3)利用Comsol建立酵母菌細(xì)胞電場(chǎng)模型，可求得不同脈沖電壓下酵母菌細(xì)胞的跨膜電壓，仿真結(jié)果與實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，可以通過仿真對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行指導(dǎo)和改進(jìn)。