宮頸癌中影響預(yù)后的生物分子及免疫細(xì)胞浸潤(rùn)

蘇亞妮，楊明義，何昌軍，雷 俠，常 宇，胡云峰*

(1.延安大學(xué)附屬醫(yī)院放療科，陜西 延安 716000;2.延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院，陜西 延安 716000)

宮頸癌是一種常見的女性癌癥[1-2]，發(fā)病率和病死率很高。由于基因測(cè)序的蓬勃發(fā)展，基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(gene expression omnibus,GEO)在生物信息學(xué)分析中的作用越來越重要。抑制素βA(inhibin beta A，INHBA)是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β超家族的一個(gè)配體[3]。目前，發(fā)現(xiàn)INHBA的高表達(dá)與胃癌[4]、白血病[5]、前列腺癌[6]、頭頸部鱗癌[7]等多種癌癥有關(guān)。然而，尚無關(guān)于INHBA在宮頸癌中生物學(xué)功能的相關(guān)研究。免疫細(xì)胞浸潤(rùn)是指免疫細(xì)胞從血液中移向組織發(fā)揮抗腫瘤作用。浸潤(rùn)腫瘤的免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤的發(fā)展和抗癌治療的成功具有深遠(yuǎn)的影響。已有研究發(fā)現(xiàn)頭頸部鱗癌中免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)與INHBA相關(guān)，免疫浸潤(rùn)的B細(xì)胞影響預(yù)后[7]。然而，INHBA在宮頸癌中與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的關(guān)系少見報(bào)道。

1 資料與方法

1.1微陣列數(shù)據(jù) GEO(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)是當(dāng)今最大、最全面的公共數(shù)據(jù)資源。從GEO下載GSE9750基因表達(dá)數(shù)據(jù)集。GSE9750數(shù)據(jù)集中包含有42例宮頸癌樣本和24例正常宮頸組織樣本。平臺(tái)是GPL96Array芯片數(shù)據(jù)。

1.2鑒定差異表達(dá)基因(differentially expressed genes，DEGs) R是用于統(tǒng)計(jì)分析、繪圖的語言和操作環(huán)境，是一個(gè)自由、免費(fèi)、源代碼開放的軟件，是一個(gè)用于統(tǒng)計(jì)計(jì)算和統(tǒng)計(jì)繪圖的優(yōu)秀工具。Perl與腳本語言一樣，不需要編輯器和鏈接器來運(yùn)行代碼，只需寫出程序并告訴Perl來運(yùn)行。將從GEO下載的GSE9750數(shù)據(jù)集用Perl進(jìn)行注釋，將基因ID轉(zhuǎn)換成基因symbol；并用Perl對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分組整理。R進(jìn)行數(shù)據(jù)的批次校正，R的“l(fā)imma”包鑒定DEGs，篩選標(biāo)準(zhǔn)：P<0.05、logFC≥1/logFC≤-1。

1.3DEGs的基因本體論(gene ontology, GO)和京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)富集分析 GO由基因本體聯(lián)盟管理和更新，GO數(shù)據(jù)庫建立一套描述基因及其產(chǎn)物功能的標(biāo)準(zhǔn)詞匯體系/術(shù)語(term)。GO富集分析是找出目標(biāo)基因集中最顯著的GO term。KEGG是一個(gè)整合了基因組、化學(xué)和系統(tǒng)功能信息的數(shù)據(jù)庫，是一個(gè)生物系統(tǒng)的計(jì)算機(jī)模擬。R的 “clusterProfiler”包對(duì)DEGs進(jìn)行GO和KEGG富集，選取標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05。

1.4蛋白-蛋白互作(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 STRING(http://string-db.org)是一個(gè)在線搜索已知蛋白互作關(guān)系的數(shù)據(jù)庫，可以對(duì)互作基因網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行預(yù)測(cè)，為了解疾病產(chǎn)生或發(fā)展的機(jī)制提供更加深入的科學(xué)依據(jù)。利用STRING構(gòu)建INHBA的PPI網(wǎng)絡(luò)，綜合評(píng)分>0.4的交互作用被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.5INHBA在宮頸癌的表達(dá)和預(yù)后 基因表達(dá)譜交互式分析(gene expression profiling interactive analysis，GEPIA)數(shù)據(jù)庫匯集了癌癥基因組圖譜(the cancer genome atlas，TCGA)和基因型和基因表達(dá)量關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)庫(the genotype-tissue expression，GTEx)數(shù)據(jù)庫中306例宮頸癌及13例正常宮頸上皮的測(cè)序數(shù)據(jù)。我們用GEPIA數(shù)據(jù)庫分析INHBA在宮頸癌的表達(dá)和預(yù)后情況。

1.6宮頸癌中樣本的免疫細(xì)胞浸潤(rùn) GSE9750數(shù)據(jù)集的表達(dá)矩陣在R中經(jīng)“e1071”、“parallel”和“preprocessCore”包用“CIBERSORT”軟件獲得免疫細(xì)胞表達(dá)矩陣。Perl篩選免疫細(xì)胞矩陣中P<0.05的樣本，并用R進(jìn)行可視化。

1.7細(xì)胞類型表達(dá)水平分析 GEPIA上通過交互箱線圖將選擇的每個(gè)細(xì)胞類型的基因表達(dá)可視化，并進(jìn)行細(xì)胞類型水平差異表達(dá)分析。與比例分析類似，輸入目標(biāo)基因即可得到該基因在所選腫瘤中，各種免疫細(xì)胞中的表達(dá)水平。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用R軟件(4.1.1版本)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1宮頸癌的潛在生物學(xué)分子

2.1.1DEGs的鑒定 R的 “l(fā)imma”包鑒定出1 485個(gè)DEGs,包括752個(gè)上調(diào)DEGs和733個(gè)下調(diào)DEGs。R對(duì)DEGs可視化火山圖(圖1A)和熱圖(圖1B)。

圖1 差異表達(dá)基因

2.1.2DEGs的GO富集分析 R的“clusterProfiler”包進(jìn)行GO富集，選取標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05。GO顯著富集情況見表1。

表1 差異基因的GO富集分析

2.1.3DEGs的KEGG富集分析 R的“clusterProfiler”包進(jìn)行KEGG富集，選取標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05。KEGG顯著富集見表2。

表2 差異基因的KEGG 富集分析

2.1.4PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建STRING構(gòu)建 INHBA的PPI網(wǎng)絡(luò)，共11個(gè)節(jié)點(diǎn)，43條邊,平均節(jié)點(diǎn)度7.82,PPI富集P=3.04e-14。PPI富集相互作用的蛋白有ACVR1、ENG、ACVRL1、ACVR2B、FSTL3、ACVR1B、INHA、ACVR1C、FST、ACVR2A(圖2)。

圖2 INHBA基因PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

2.1.5INHBA在宮頸癌中表達(dá)增高并導(dǎo)致不良預(yù)后 INHBA在GEPIA數(shù)據(jù)庫的分析發(fā)現(xiàn)相對(duì)于正常樣本來說，INHBA在宮頸癌中表達(dá)升高(P<0.05，圖3A)。根據(jù)KM生存分析，低表達(dá)INHBA組的預(yù)后較好(P=0.01，圖3B)。

圖3 INHBA在宮頸癌的表達(dá)增高并導(dǎo)致不良預(yù)后

2.2宮頸癌免疫細(xì)胞浸潤(rùn)

2.2.1宮頸癌中免疫浸潤(rùn)細(xì)胞相關(guān)性分析 R的“corrplot”包制作相關(guān)性熱圖(圖4)，結(jié)果顯示未活化的CD4+記憶性T細(xì)胞和未活化的樹突狀細(xì)胞呈正相關(guān)(相關(guān)系數(shù)=0.64)，兩者具有協(xié)同效應(yīng)。未活化的樹突狀細(xì)胞和漿細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)(相關(guān)系數(shù)=0.49)，兩者具有拮抗作用。

圖4 宮頸癌中免疫細(xì)胞的相關(guān)性熱圖

2.2.2免疫浸潤(rùn)細(xì)胞在宮頸癌和宮頸正常上皮中的表達(dá)情況 對(duì)篩選后的免疫細(xì)胞矩陣用R的“vioplot”包進(jìn)一步可視化小提琴圖，發(fā)現(xiàn)初始CD4+T細(xì)胞(P=0.001)、未活化的自然殺傷細(xì)胞(P=0.047)、M0巨噬細(xì)胞(P<0.001)、M1巨噬細(xì)胞(P=0.007)在宮頸癌樣本中表達(dá)升高，而未活化的CD4+記憶性T細(xì)胞(P<0.001)、單核細(xì)胞(P<0.001)、未活化的樹突狀細(xì)胞(P<0.001)在宮頸癌樣本中表達(dá)明顯降低(圖5)。

圖5 免疫浸潤(rùn)細(xì)胞在宮頸癌和宮頸正常上皮中的表達(dá)情況

2.2.3細(xì)胞類型表達(dá)水平分析 通過交互箱線圖將選擇的每個(gè)細(xì)胞類型的基因表達(dá)可視化，并進(jìn)行細(xì)胞類型分析INHBA在宮頸癌各種免疫細(xì)胞中的表達(dá)水平。結(jié)果表明,在宮頸癌中INHBA基因在成纖維細(xì)胞中含量最高,在自然殺傷細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞含量最低(圖6)。

圖6 宮頸癌中各種免疫細(xì)胞中INHBA的表達(dá)水平

3 討 論

宮頸癌是女性的殺手，在女性腫瘤中占有很大的地位，對(duì)女性的身心健康有嚴(yán)重影響。然而其發(fā)病機(jī)制尚不明確。生物信息學(xué)為鑒定疾病的生物標(biāo)志物及相關(guān)途徑提供了一種強(qiáng)有力的方法，進(jìn)一步推動(dòng)了疾病病因及發(fā)病機(jī)制的研究。本研究通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)INHBA在宮頸癌中高表達(dá)。通路顯著富集于細(xì)胞周期、DNA復(fù)制、P53信號(hào)通路、卵母細(xì)胞減數(shù)分裂、白細(xì)胞介素17信號(hào)通路、細(xì)胞衰老等。免疫細(xì)胞分析顯示，初始CD4+T細(xì)胞，未活化的自然殺傷細(xì)胞，M0巨噬細(xì)胞和M1巨噬細(xì)胞在宮頸癌樣品中表達(dá)明顯升高。而未活化的CD4+記憶性T細(xì)胞、單核細(xì)胞、未活化的樹突狀細(xì)胞在宮頸癌樣本中表達(dá)明顯降低。

研究發(fā)現(xiàn)INHBA在頭頸部鱗癌中的過表達(dá)對(duì)轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控具有深遠(yuǎn)的影響，與蛋白質(zhì)翻譯密切相關(guān)[7]。此外，INHBA的高表達(dá)與疾病的惡性程度有關(guān)，其在胃癌[4]、食管癌[8]、前列腺癌[6]、頭頸部鱗癌[7]、白血病[5]、鼻咽癌[9]、卵巢癌[10]和結(jié)直腸癌[11-12]等腫瘤中的表達(dá)明顯升高。本研究結(jié)果顯示，宮頸癌組織中的INHBA表達(dá)顯著高于正常組織，INHBA可能在宮頸癌中發(fā)揮癌基因作用。研究發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸癌患者中，INHBA高表達(dá)組患者的生存周期顯著低于低表達(dá)組[3]。在頭頸部鱗癌中，免疫浸潤(rùn)的B細(xì)胞影響預(yù)后，并可能與INHBA的表達(dá)情況有關(guān)[7]。INHBA高表達(dá)不僅是急性髓系白血病的不良預(yù)后因素,而且與急性髓系白血病的臨床特征相關(guān)[5]。在食管鱗癌中INHBA高表達(dá)提示不良預(yù)后[8]。INHBA對(duì)胃癌[13]、乳腺癌[14]和結(jié)直腸癌[11]的預(yù)后都有一定的指導(dǎo)意義。INHBA在卵巢癌中特異性表達(dá)，高表達(dá)患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)增高[10]。INHBA也與鼻咽癌的預(yù)后相關(guān)[9]。INHBA在大腸癌中顯著上調(diào)，INHBA的高表達(dá)與大腸癌患者的不良預(yù)后密切相關(guān)[15]。雖然INHBA與多種腫瘤的預(yù)后相關(guān)，但其在宮頸癌中與預(yù)后的關(guān)系還不明確。本研究發(fā)現(xiàn)INHBA高表達(dá)導(dǎo)致宮頸癌的預(yù)后不良，將是一個(gè)新的研究方向。

研究發(fā)現(xiàn)INHBA在頭頸部鱗癌中的表達(dá)與免疫浸潤(rùn)細(xì)胞(B細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞)的豐度之間具有相關(guān)性，免疫浸潤(rùn)的B細(xì)胞與INHBA在頭頸部鱗癌中表達(dá)與生存有關(guān)，說明B細(xì)胞顯著影響預(yù)后，值得進(jìn)一步研究和探索[7]?？梢娒庖呓?rùn)的B細(xì)胞在頭頸部鱗癌中的預(yù)后價(jià)值可能與INHBA相關(guān)[7]。此外，研究表明INHBA在頭頸部鱗癌的過表達(dá)與轉(zhuǎn)錄后蛋白質(zhì)翻譯密切相關(guān)，與INHBA相關(guān)的微核糖核酸的分子功能主要在轉(zhuǎn)錄因子活性和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性上得到增強(qiáng)。但I(xiàn)NHBA與宮頸癌免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的相關(guān)性目前尚無明確的報(bào)道。本研究結(jié)果表明初始CD4+T細(xì)胞、未活化的自然殺傷細(xì)胞、M0巨噬細(xì)胞和M1巨噬細(xì)胞在宮頸癌樣本中表達(dá)升高。而未活化的CD4+記憶性T細(xì)胞、單核細(xì)胞和未活化的樹突狀細(xì)胞在宮頸癌樣本中表達(dá)降低。未活化的CD4+記憶性T細(xì)胞和未活化的樹突狀細(xì)胞呈正相關(guān)，兩者具有協(xié)同效應(yīng)。未活化的樹突狀細(xì)胞和漿細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)，兩者具有拮抗作用。但免疫細(xì)胞之間的協(xié)同和拮抗關(guān)系的具體機(jī)制還有待進(jìn)一步探索。

本研究探討INHBA在宮頸癌中的預(yù)后情況以及宮頸癌中的免疫浸潤(rùn)細(xì)胞，對(duì)宮頸癌的預(yù)后研究及臨床治療具有一定的指導(dǎo)意義。