非洲豬瘟病毒無標簽p30-ELISA抗體檢測方法的建立及應用

于學祥,陳曉雨,李棟凡,孫 琪,庫旭鋼,范盛先,楊漢春,何啟蓋*

(1.華中農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院, 武漢 430070；2.農(nóng)業(yè)微生物學國家重點實驗室, 武漢 430070；3.生豬健康養(yǎng)殖協(xié)同創(chuàng)新中心，武漢 430070；4.中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，北京 100193)

非洲豬瘟(African swine fever, ASF)是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)引起豬的一種高度傳染性疾病，臨床癥狀以急性、熱性、出血性、高發(fā)病率和高死亡率為特征。該病屬于世界動物衛(wèi)生組織(OIE)要求法定報告的動物疫病，我國動物病原微生物名錄中將其列為一類動物病原。本病2018年傳入我國，給我國養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失。無論在非洲豬瘟新發(fā)地區(qū)還是流行地區(qū)，疫情的暴發(fā)和流行都會對當?shù)禺a(chǎn)生嚴重的社會經(jīng)濟影響。ASF具有迅速傳播的潛力，并且由于目前尚無相關疫苗，因此該病的防控依賴于疾病的快速診斷、無害化處理感染動物以及發(fā)病動物。

目前，我國出現(xiàn)了非洲豬瘟變異毒株，其毒力相對較弱，感染豬的臨床癥狀不典型，有時呈間接性排毒，而豬在感染后7～9 d即可在血清中檢測到抗體，且抗體陽性可持續(xù)終生。目前，血清抗體的檢測方法主要是ELISA，此方法操作簡單、快速，易于標準化。研究表明p30、p54和p72、p35、pK205R、CD2v蛋白具有較高的免疫原性，用于制備的ELISA檢測試劑盒均具有較好的敏感性和特異性。但以上方法應用的抗原蛋白均含有標簽蛋白，從而造成檢測假陽性的情況。因此，建立敏感且特異性更強的ELISA抗體檢測方法，在精準檢測和撲殺感染豬中具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

ASFV陽性核酸提取于區(qū)域性排查陽性樣品，非洲豬瘟陽性和陰性血清均由中國動物衛(wèi)生與流行病學中心非洲豬瘟國家參考實驗室饋贈，非洲豬瘟動物實驗感染血清由哈爾濱獸醫(yī)研究所饋贈，非洲豬瘟陽性標準血清購于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，ASFV為本實驗室分離保存。pET-30a質粒由本實驗室保存。DH5α、Transetta(DE3)感受態(tài)細胞和EasyPure Plasmid MiniPrep Kit(質粒小提試劑盒，EM101)等購自北京全式金生物技術有限公司；Biomiga Gel/PCR Extraction Kit(膠/PCR產(chǎn)物回收試劑盒，DC3511)購自美國Biomiga公司；牛血清白蛋白(BSA)購自美國MP Biomedicals公司；PVDF膜 0.45 μm(IPVH00010)，0.22 μm濾器和透析袋購自Millipore公司；DL2000 DNA Marker、T4 DNA Ligase(2001A)、限制性內切酶Ⅰ和Ⅰ均購自寶生物工程(大連)有限公司(TaKaRa)，重組腸激酶購自上海李記生物科技有限公司，羊抗豬IgG二抗購自武漢三鷹生物技術有限公司(Proteintech)；非洲豬瘟抗體檢測試劑盒購自西班牙INGENASA公司；其余化學試劑均為國藥產(chǎn)試劑。

豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、口蹄疫病毒、偽狂犬病病毒、豬圓環(huán)病毒病2型、豬流行性腹瀉病毒等的陽性血清均為實驗室保存。

1.2 引物設計

參照GenBank數(shù)據(jù)庫中ASFV-CP204L序列(GenBank No.: MK333180.1)，根據(jù)基因序列設計上游引物F的序列：5′-GGCTATGGATTTTATTTTAAATAT-3′，下游引物R的序列：5′-CCGTT-TTTTTTTTAAAAGTTTA-3′。單下劃線處分別是Ⅰ和Ⅰ的酶切位點序列，雙下劃線處為腸激酶(enterokinase)序列，并加入保護性堿基。上述引物由上海生物工程股份有限公司合成。預計擴增片段大小為616 bp，包含ASFV-p30的整個開放閱讀框和一個enterokinase序列。

1.3 重組質粒pET30a-CP204L的構建

以ASFV陽性核酸為模板擴增CP204L基因，反應體系：2×rDNA聚合酶25 μL，上下游引物(10 pmol·μL)各1 μL，模板3 μL，ddHO 20 μL;PCR反應條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，53.6 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，16 ℃保存。PCR產(chǎn)物電泳后用膠回收試劑盒純化30基因片段。將原核表達載體pET-30a與擴增的30基因片段分別用Ⅰ和Ⅰ進行雙酶切，并回收純化。將回收得到的產(chǎn)物于4 ℃過夜連接并進行轉化，PCR擴增鑒定克隆菌。將PCR陽性菌提取質粒進行雙酶切鑒定，并送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序分析。

1.4 重組ASFV p30蛋白的表達與純化鑒定

將測序正確的重組質粒pET-30a-CP204L轉化到Transetta(DE3)表達感受態(tài)細胞，16 h后挑取陽性菌落，于含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，提取質粒再進行雙酶切檢測，將驗證正確的菌液冷凍保存于-80 ℃。

培養(yǎng)鑒定正確的重組菌，加入IPTG誘導表達結束后離心收集菌體，將菌體高壓破碎2～3次至菌液澄清明亮，4 ℃ 10 000 r·min離心5 min，棄上清，再用以下溶液洗滌包涵體，去除雜蛋白。洗滌液1: Buffer A+1%Triton-X100，4 ℃靜置15 min；洗滌液2: Buffer A+2 mol·L尿素，4 ℃靜置20 min；洗滌液3: Buffer A+4 mol·L尿素，4 ℃靜置10 min。每步均離心留取沉淀做下一步。用19.7 mL Buffer A重懸蛋白沉淀，同時加入19.7 μL的DTT溶液?；靹蚝蠹尤?.3 mL 20%的SKL貯存液，劇烈攪動，使其緩慢溶解，4 ℃過夜。之后4 ℃ 12 000 r·min離心15 min，取上清，加入20% PEG4000 210 μL至總濃度為0.2%，另外加入50 mmol·L(0.03 g·mL)氧化型谷胱甘肽420 μL和50 mmol·L(0.03 g·mL)還原型谷胱甘肽420 μL，4 ℃靜置1～2 h。將蛋白裝入透析袋中，使用TE Buffer溶液于4 ℃下透析48～72 h。

將透析好的蛋白使用Ni-NTA親和層析柱純化，純化后使用腸激酶切除兩端的His標簽，使用透析袋透析后獲得p30蛋白。取腸激酶酶切前后的蛋白樣品進行SDS-PAGE驗證，并分別使用His單抗和ASFV陽性豬血清作為一抗，進行Western blot鑒定。

1.5 間接ELISA檢測方法的建立

1.5.1 抗原最佳包被濃度和待檢血清稀釋度的選擇 采用方陣滴定法，以碳酸鹽緩沖液(0.05 mol·L, pH 9.6)為包被液，將純化的p30蛋白稀釋至終濃度分別為2、1、0.5、0.25、0.125、0.062 5 μg·mL，每個濃度包被1列，每孔100 μL，4 ℃包被12 h。PBST洗滌5次后拍干。每孔加入100 μL 的1%脫脂牛奶溶液，37 ℃封閉1 h，取出洗滌，方法同上。將陰陽性血清按照1∶20、1∶40、1∶80和1∶160梯度倍比稀釋后加入ELISA包被板中，100 μL·孔，37 ℃作用30 min，取出洗滌5次。拍干后加入1∶12 000倍稀釋的HRP標記的羊抗豬IgG酶標二抗，100 μL·孔，37 ℃反應30 min，取出洗滌，方法同上。拍干后加入TMB底物液，100 μL·孔，25 ℃避光反應10 min。每孔加入50 μL氟化鈉終止反應，測定OD值。以陽性血清OD值接近1，P/N值最大孔的抗原濃度和血清稀釋度作為最佳抗原包被濃度和血清稀釋度。

1.5.2 抗原最佳包被條件的選擇 以最適抗原濃度包被酶標板之后，分別按照不同條件處理酶標板：4 ℃包被12 h；37 ℃孵育60 min之后，4 ℃包被12 h和37 ℃孵育120 min。比較各組陽、陰性血清的P/N值，以選擇最佳包被時間和包被溫度。

1.5.3 最佳封閉條件的選擇 取包被好的酶標板，選擇6組封閉液：0.5% BSA、1% BSA、2%BSA、1%脫脂牛奶、2%脫脂牛奶、5%脫脂牛奶，每組封閉液做3個重復，100 μL·孔。選擇3組封閉時間：37 ℃孵育時間分別為60、90和120 min。待封閉完成后。計算其P/N值，選擇最佳封閉液和封閉時間。

1.5.4 最佳反應時間的選擇 血清按照確定的最佳稀釋度加入包被的酶標板，37 ℃ 分別孵育30、45、60、90 min。將酶標抗體(二抗)按照推薦的稀釋倍數(shù)1∶12 000加入酶標板后，37 ℃分別作用30、45、60、90 min。加入TMB底物液，100 μL·孔，25 ℃避光分別反應5、10、15 min，之后加入終止液50 μL·孔，于酶標儀630 nm波長讀數(shù)，計算出對應的P/N值，選擇最佳底物顯色時間。

1.5.5 臨界值的確定 檢測經(jīng)INGENASA非洲豬瘟抗體檢測試劑盒確定陰陽性的240份樣品，其中，89份陽性樣品來自于臨床樣品，151份陰性樣品來自于2017年保存血清。檢測結果通過SPSS進行ROC曲線分析，計算ROC曲線下的面積(AUC)，找到ROC曲線下面積最大時對應的Cut-off值，即為最佳陽性判定值。

1.5.6 批間、批內重復試驗 批內重復試驗：將同一批次純化的蛋白包被ELISA板，取6份不同抗體水平的陽性血清樣品和2份陰性血清樣品，于3個不同時間點分別進行ELISA檢測；批間重復試驗：用不同批次制備的3批蛋白抗原分別包被ELISA板，對以上血清樣品分別檢測。分別計算批內和批間重復試驗的標準差、平均值和變異系數(shù)。

1.5.7 實驗室敏感性試驗 用建立的間接ELISA 方法檢測購于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所的ASFV陽性標準血清(202101批)和中國動物衛(wèi)生與流行病學中心國家非洲豬瘟參考實驗室饋贈的陰性血清，各血清樣品均倍比稀釋至1 024倍，可檢測到的最高稀釋濃度即該方法的最高敏感度。

1.5.8 實驗室特異性試驗 用本方法分別檢測PCV2陽性血清(PCV2)、豬瘟陽性血清(CSFV)、豬偽狂犬野毒陽性血清(PRV-gE)和豬繁殖與呼吸綜合征病毒陽性血清(PRRSV)，同時設陰、陽性對照，進行特異性試驗分析。

1.6 動物感染血清檢測

使用本方法與本實驗室基于p72蛋白制備的抗體檢測試方法分別檢測中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所饋贈的感染ASFV不同時間點的收集的血清，評價本方法臨床敏感性及抗體變化情況。

1.7 對比試驗

使用本試劑盒與INGENASA非洲豬瘟抗體檢測試劑盒對比檢測180份臨床樣品，計算陰性和陽性符合率；對2個方法檢測不一致的血清樣品在華中農(nóng)業(yè)大學生物安全三級實驗室種使用間接免疫熒光試驗(IFA)方法確定血清陰陽性，最終判定本方法的陰陽性符合率。

IFA試驗具體步驟：將原代肺泡巨噬細胞(PAM)細胞培養(yǎng)于48孔培養(yǎng)板，待細胞穩(wěn)定貼壁12 h后，按照0.1 MOI接種 ASFV，36 h后用4%的多聚甲醛固定 30 min，然后用 PBS 洗滌 3 次，每次 5 min。分別加入待檢血清和已知陰陽性血清，37 ℃溫育 60 min，PBS 洗3次，加入FITC標記的羊抗豬 IgG，37 ℃溫育 60 min，PBS洗3次，在倒置熒光顯微鏡下觀察結果。IFA試驗在華中農(nóng)業(yè)大學生物安全三級實驗室(ABSL-3)完成。

1.8 臨床血清樣品檢測

使用本試驗建立的方法檢測2020年收集的644份臨床樣品，其中母豬血清樣品264份，后備母豬血清樣品131份，仔豬樣品81份，保育豬樣品53份，育肥豬樣品115份。

2 結 果

2.1 ASFV CP204L基因的擴增

從陽性模板PCR擴增特異性基因CP204L，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，目的片段大小為616 bp(圖1A)，與預期結果一致。

2.2 重組質粒雙酶切鑒定

將CP204L基因片段連接至pET-30a質粒中，重組表達質粒經(jīng)限制性內切酶Ⅰ和Ⅰ 雙酶切后，獲得616 bp的目的片段和約為5 400 bp的pET-30a載體片段，經(jīng)測序可見核苷酸序列結果正確，表明重組質粒pET-30a-CP204L構建正確。經(jīng)測序比較與Pig/HLJ/2018毒株的CP204L基因(GenBank No.: MK333180.1)完全一致。

2.3 重組蛋白的表達及鑒定

SDS-PAGE結果顯示，pET-30a-p30重組質粒經(jīng)轉化Transetta(DE3)感受態(tài)細胞后，誘導表達高壓破碎后對上清和包涵體分別制樣，經(jīng)PAGE驗證，該蛋白主要表達于包涵體中，相對分子質量約為36 ku，與預期大小相符。經(jīng)純化后得到相對分子質量約為36 ku的ASFV p30蛋白(圖1)。

A.ASFV p30蛋白的表達；B.ASFV p30蛋白的純化鑒定；M.蛋白質相對分子質量標準; 1.高壓破碎后菌體沉淀;2.高壓破碎后上清;3、5.pET-30a空載誘導后產(chǎn)物；4.純化后的ASFV p30蛋白

2.4 重組蛋白的純化和Western blot分析

使用腸激酶酶切前后的蛋白經(jīng)PAGE和Western blot分析，結果顯示(圖2)，酶切后的重組蛋白不能與His抗體發(fā)生反應，但可以和ASFV陽性豬血清發(fā)生較強反應，說明酶切后的p30蛋白具有良好的反應原性，His標簽已經(jīng)切除。

A.SDS-PAGE驗證；B.Western blot His標簽檢測；C.p30蛋白ASFV陽性血清Western blot驗證；M.蛋白質相對分子質量標準;1、6、7.pET-30a空載誘導后產(chǎn)物; 2、4、8.腸激酶酶切前的p30蛋白; 3、5、9.腸激酶酶切后的p30蛋白

2.5 間接ELISA條件的確定

2.5.1 重組蛋白包被濃度和樣品稀釋度的確定 通過方陣滴定檢測可知，當酶切后的p30蛋白抗原包被濃度為1 μg·mL，血清1∶40稀釋時，此時P/N值最大，且此陽性血清OD值>1。所以采用1 μg·mL為最適包被濃度，血清1∶40稀釋時為最適稀釋倍數(shù)，如表1所示。

表1 基于OD630 nm確定最佳抗原包被濃度和血清稀釋度

2.5.2 抗原最佳包被和封閉條件的選擇 試驗結果表明，抗原4 ℃包被12 h時P/N值最大，使用2%的脫脂奶粉封閉60 min時P/N值最大，因此確定最佳包被條件是4 ℃ 12 h，最佳的封閉條件使用2 %的脫脂奶粉封閉60 min。

2.5.3 最佳反應條件的選擇 試驗結果表明，樣品在37 ℃孵育30 min、酶標二抗37 ℃孵育30 min、TMB避光顯色10 min條件下P/N值最大，所以最佳的反應條件為一抗37 ℃孵育30 min，酶標二抗37 ℃孵育30 min，TMB底物避光顯色10 min。

2.5.4 臨界值的確定 使用本方法檢測89份陽性和151份陰性共計240份樣品，檢測結果通過SPSS進行ROC曲線分析(圖3)，計算ROC曲線下的面積(AUC)，確定當Cut-off值確定為0.398 5時，ROC曲線下面積最大，為0.998，此時敏感性為98.9%，特異性為98.0%。

圖3 基于陰陽性血清的臨界值ROC曲線圖

2.5.5 批內批間重復試驗 批內重復試驗顯示，變異系數(shù)為1.06%～3.74%，批間重復試驗顯示，變異系數(shù)為2.51%～8.47%。批間和批內試驗變異系數(shù)均小于10%，表明該方法重復性良好。

2.5.6 敏感性試驗 用建立的間接ELISA方法檢測不同稀釋度的ASF標準陽性血清和陰性血清，同時設陽性、陰性對照。結果如表2所示，該ELISA方法檢測標準陽性血清的最大稀釋度為1∶512，陰性血清在所有稀釋度下結果均為陰性。

表2 敏感性試驗

2.5.7 特異性試驗 用建立的間接ELISA 方法分別檢測PCV2、CSFV、PRV-gE、PRRSV等病毒的陽性血清，同時設陽性、陰性對照。結果表明該ELISA方法檢測其他病毒陽性血清均為陰性，無假陽性反應，表明此ASFV-p30-ELISA方法具有良好特異性。

2.6 動物感染血清檢測

使用本研究建立的基于p30蛋白和本實驗室基于p72蛋白建立的兩種間接ELISA方法分別檢測中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所饋贈的感染ASFV不同時間點的豬血清，在第10天時有80%(4/5)的感染動物針對p30蛋白抗體轉陽，在第20天時所有感染動物抗體全部轉陽(圖4)；而針對p72蛋白(圖5)，在第15天才有40%(2/5)的感染動物抗體轉陽，在第20天還有20%(1/5)的感染動物p72蛋白抗體為陰性，表明p30蛋白相對于p72蛋白更適用于早期檢測。

圖4 動物感染模型中p30蛋白抗體監(jiān)測情況

圖5 動物感染模型中p72抗體監(jiān)測情況

2.7 對比試驗

使用本試劑盒與INGENASA非洲豬瘟抗體檢測試劑盒對比檢測180份臨床樣品，對比可見(表3)兩種試劑盒總體符合率達97.78%，共有4份樣品存在檢測結果差異，經(jīng)IFA檢測可見在陰陽性對照均成立時，4份樣品均未見有陽性信號。說明本方法敏感性較高，且特異性較好。

表3 與商品化試劑盒的對比試驗

2.8 臨床血清樣品檢測

本研究累計收集豬血清樣品644份，用本試驗建立的間接ELISA抗體檢測，總體陽性率為7.61%，其中，后備母豬中未檢測到陽性，母豬、仔豬、保育豬和育肥豬抗體陽性率分別為3.03%、4.94%、7.55%和28.7%(圖6)。

圖6 各階段豬群抗體陽性率

3 討 論

非洲豬瘟對養(yǎng)豬業(yè)的危害極其嚴重，自2018年8月ASFV傳入我國以來，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴重的損失，致死率可達100%，因此主要采取撲殺病豬和無害化處理的方式控制該病。目前國內出現(xiàn)部分弱毒株，其引起的臨床癥狀不明顯，但發(fā)病周期長，豬可在感染后7～9 d產(chǎn)生抗體，國際上商品化抗體檢測試劑盒種類較少，國內同樣缺乏成熟可靠的抗體檢測方法，因此，急需建立一種用于ASFV的快速高效的抗體檢測方法。目前，針對該病的抗體檢測方法國內外多選用p72、p30、p54等具有較高免疫原性和反應原性的蛋白作為抗原，其中p72蛋白較多應用于國內外的研究中，該蛋白是ASFV的主要結構蛋白，其免疫原性好、保守性強、表達量高，西班牙INGENASA公司生產(chǎn)的ASF抗體檢測試劑盒便是基于p72蛋白，但該蛋白在病毒感染晚期才表達，相對檢出時間較晚，故基于p72蛋白的抗體檢測方法不利于臨床早期檢測。P54蛋白雖較p72蛋白在感染ASFV后表達較早，但在不同地區(qū)毒株的p54蛋白在氨基酸序列上存在一定的差異，易造成假陰性的產(chǎn)生，故通常不作為非洲豬瘟的檢測抗原。相較于p54和p72蛋白，p30蛋白產(chǎn)生時間較早，使用p30蛋白作為抗原比p72作為抗原檢測時間可提前7 d，且能夠在病毒與細胞吸附之前或之后中和病毒，同樣是重要的病毒早期診斷靶點，中國動物衛(wèi)生與流行病學中心起草的GB/T18648-2020《非洲豬瘟診斷技術》也推薦使用p30蛋白作為間接ELISA的檢測抗原，所以本研究選用p30蛋白作為檢測抗原。

本研究采用pET-30a作為載體表達p30蛋白，原核系統(tǒng)具有操作簡便、表達量高的優(yōu)點，雖然表達的重組蛋白以包涵體形式存在，但經(jīng)包涵體的變性、復性和鎳柱純化后，大大減少了雜蛋白的含量。為避免表達蛋白兩端his標簽和載體蛋白對檢測造成假陽性情況，有研究為減少his標簽引起的假陽性反應，用Sepharose300凝膠過濾層析柱和DEAE Sepharose Fast Flow 陰離子交換柱分離純化無his組氨酸標簽的p30蛋白，可得到純度較高的無標簽p30蛋白，使用該蛋白作為包被蛋白開展ELISA方法研究，結果表明該蛋白較具有his標簽的蛋白效果更好，但該方法純化的蛋白純度較低，且純化方式較為復雜。而本研究在表達蛋白時在p30蛋白兩端均加上了enterokinase序列，該序列用重組腸激酶切除后，再使用透析袋可除去多余蛋白，最后可得到純度較高的p30蛋白，為使用該蛋白作為檢測抗原奠定了良好的基礎。本研究建立的方法與INGENASA商品化試劑盒比較，總體符合率達97.78%，其中，共有4份血清樣品檢測結果不一致，經(jīng)IFA檢測4份血清均為陰性，可見本方法敏感性和特異性均高于INGENASA試劑盒，表明本研究建立的方法可應用于臨床實踐。

在中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所饋贈的動物感染模型中，感染后第10 天有80%檢測到抗體產(chǎn)生，而在第20 天時試驗動物抗體才全部轉陽，此結果與OIE及FAO報道一致，結果顯示，p30蛋白的抗體產(chǎn)生時間明顯早于p72蛋白抗體的產(chǎn)生時間，表明p30蛋白相對于p72蛋白更適用于早期檢測。大量臨床樣品檢測結果可見，豬場中總體陽性率為7.61%，其中后備母豬未檢測到抗體陽性，育肥豬抗體陽性率高達28.7%，經(jīng)調查分析豬場背景信息，抗體陽性的豬場均出現(xiàn)或曾經(jīng)出現(xiàn)異常豬，本次檢測結束后抗體陽性豬場的豬按照OIE要求進行了無害化處理，表明目前養(yǎng)殖環(huán)節(jié)中商品豬的ASF防控工作急需加強。由于國內弱毒力毒株的出現(xiàn)，常導致豬感染后臨床癥狀不典型，所以抗體檢測方法也可作為疑似病例診斷和豬場引種檢測感染情況的有效手段。

4 結 論

建立了可用于檢測ASFV抗體的ELISA方法，該方法特異性好、靈敏度高、重復性良好，與進口試劑盒的符合率達到97.78%，本方法檢測發(fā)現(xiàn)，豬感染第10天可產(chǎn)生特異性抗體。本研究為臨床檢測ASFV抗體提供了手段。