非洲豬瘟病毒p72蛋白阻斷ELISA檢測(cè)方法的建立

張路捷，高雁怩，夏婷婷，白 娟，姜 平*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物細(xì)菌學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210095；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物傳染病實(shí)驗(yàn)室，南京 210095)

非洲豬瘟(African swine fever, ASF)是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)引起的一種急性、高度致死性的烈性傳染病。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為法定報(bào)告動(dòng)物疫病，同時(shí)也是我國(guó)重點(diǎn)防范的一類動(dòng)物疫病。該病于2018年8月在我國(guó)首次報(bào)道，對(duì)我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失。ASFV為二十面體對(duì)稱的雙鏈DNA病毒，是非洲豬瘟病毒科()、非洲豬瘟病毒屬()的唯一成員，該病毒基因組長(zhǎng)度為170～190 kb，有150～167個(gè)開放閱讀框。ASFV的p72、p54和p30等結(jié)構(gòu)蛋白均具有良好的抗原性和免疫原性，是ELISA等血清學(xué)診斷的重要靶點(diǎn)。目前，我國(guó)對(duì)該病的防控主要依賴于早期診斷、嚴(yán)格的運(yùn)輸控制及其他生物安全措施。

ASF病原學(xué)診斷技術(shù)主要包括病毒分離、紅細(xì)胞吸附試驗(yàn)、PCR、real-time PCR、重組酶聚合酶擴(kuò)增(RPA)等；血清學(xué)診斷技術(shù)主要有熒光抗體技術(shù)、ELISA、膠體金快速免疫層析法(GICA)等。OIE將ELISA作為診斷ASF的首選血清學(xué)方法。國(guó)外已研發(fā)出幾種ASFV診斷試劑盒，比如p72蛋白間接ELISA診斷試劑盒(Ingenasa, 西班牙)和p30阻斷ELISA診斷試劑盒(IDvet, 法國(guó))。我國(guó)已研制成功ASFV p30蛋白抗體檢測(cè)試劑盒。本研究采用ASFV Pig/HLJ/2018毒株重組p72蛋白及其單克隆抗體6E5，成功建立了阻斷ELISA方法，該方法具有較高的敏感性和良好的特異性，為我國(guó)ASFV感染診斷和流行病學(xué)調(diào)查提供了有效方法。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、菌株及主要試劑

宿主菌BL21(DE3)、pET-28a-p72(1-329 aa)重組質(zhì)粒、ASFV p72蛋白單克隆抗體6E5由本實(shí)驗(yàn)室制備、鑒定及保存。ASFV陽(yáng)性血清、陰性血清及ASFV Pig/HLJ/2018滅活病毒液由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所提供，其中，臨床ASFV陽(yáng)性血清來(lái)自黑龍江省的農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公布病例。豬偽狂犬病病毒(PRV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬瘟病毒(CSFV)、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)、A型塞內(nèi)卡病毒(SVA)、豬口蹄疫病毒(FMDV)、大腸桿菌(，)、多殺性巴氏桿菌(，PM)、副豬格拉瑟菌(，GPs)和胸膜肺炎放線桿菌(，APP)參考陽(yáng)性血清均由本實(shí)驗(yàn)室收集保存。羊抗鼠IgG(H+L)-HRP、TMB溶液購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。HRP-葡萄球菌A蛋白(SPA)(HRP-SPA)購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。經(jīng)歐盟ASFV參考實(shí)驗(yàn)室認(rèn)證的ID ScreenAfrican Swine Fever Competition ELISA試劑盒購(gòu)自法國(guó)IDvet公司。

1.2 重組p72蛋白的表達(dá)與純化

將重組質(zhì)粒pET-28a-p72(1—329 aa)轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)中，加入終濃度為1 mmol·LIPTG誘導(dǎo)表達(dá)6 h，超聲破碎，4 ℃ 12 000 r·min離心10 min，將沉淀與上清分別進(jìn)行SDS-PAGE鑒定。重組p72蛋白經(jīng)尿素透析法純化。將純化的蛋白進(jìn)行Western blot鑒定。重組p72蛋白經(jīng)BCA法測(cè)定蛋白濃度后，保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 單克隆抗體的制備、純化及辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記

6E5單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，由本實(shí)驗(yàn)室制備，小鼠單抗的亞型屬于IgG1型。

利用6E5雜交瘤細(xì)胞制備腹水，采用Western blot鑒定其與滅活的AFSV病毒液反應(yīng)特性。將腹水送至南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行純化和HRP標(biāo)記。酶量0.905 mg·mL，IgG量1.923 mg·mL，克分子比值(E/P)1.882，標(biāo)記率59.89%，ELISA抗體效價(jià)為1∶51 200。將純化后的單抗進(jìn)行SDS-PAGE鑒定，并置于-80 ℃長(zhǎng)期保存。

1.4 阻斷ELISA最佳反應(yīng)條件的選擇

用pH 9.6碳酸鹽抗原包被液將重組p72蛋白稀釋至終濃度為1.0、0.5、0.1 μg·mL，包被ELISA酶標(biāo)板，每孔100 μL，于37 ℃ 2 h，4 ℃ 12 h，然后用PBST洗滌5次，每次1 min。分別用含5%脫脂乳、2%明膠、1%BSA和0.1%BSA的PBST溶液進(jìn)行封閉，每孔200 μL，于37 ℃ 2 h，洗滌同上。將ASFV陽(yáng)性血清和陰性血清用PBST進(jìn)行1∶2、1∶4、1∶8稀釋，每孔100 μL，于37 ℃ 1 h。洗滌后將酶標(biāo)單抗HRP-6E5用PBST進(jìn)行1∶2 000、1∶3 000、1∶4 000、1∶5 000稀釋，每孔100 μL，于37 ℃作用1 h。洗滌同上，加入TMB底物，于37 ℃避光顯色10 min，顯色完成后每孔加入50 μL 2 mol·L硫酸終止顯色。用酶標(biāo)儀在450 nm處讀取吸光度(OD)值。根據(jù)血清OD值計(jì)算阻斷率，確定最佳反應(yīng)條件。計(jì)算公式：

阻斷率=[(陰性對(duì)照OD值-待檢血清OD值)/陰性對(duì)照OD值]×100%。

1.5 阻斷ELISA臨界值的確定

1.6 敏感性試驗(yàn)

用本研究建立的阻斷ELISA方法檢測(cè)50份ASFV陽(yáng)性血清(經(jīng)IDvet公司生產(chǎn)的ASFV抗體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)驗(yàn)證)，以判定該方法的敏感性。

1.7 分析特異性試驗(yàn)

用本研究建立的阻斷ELISA方法檢測(cè)已知的ASFV、PRV、PRRSV、CSFV、PCV2、SVA、FMDV、、PM、GPs和APP抗體陽(yáng)性血清，以確定該方法的特異性。

1.8 重復(fù)性試驗(yàn)

1.8.1 批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn) 用同一批次表達(dá)的重組p72蛋白包被酶標(biāo)板檢測(cè)20份陽(yáng)性樣品和10份陰性樣品，每份樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)，計(jì)算批內(nèi)變異系數(shù)(coefficient of variation, CV)。

1.8.2 批間重復(fù)性試驗(yàn) 用3個(gè)不同批次表達(dá)的重組p72蛋白包被酶標(biāo)板檢測(cè)20份陽(yáng)性樣品和10份陰性樣品，計(jì)算批間變異系數(shù)，評(píng)價(jià)該方法的重復(fù)性。

1.9 臨床血清樣品檢測(cè)與符合率試驗(yàn)

用本研究建立的阻斷ELISA方法和IDvet公司生產(chǎn)的ASFV抗體檢測(cè)試劑盒同時(shí)檢測(cè)447份臨床豬血清樣品，計(jì)算相對(duì)敏感性、相對(duì)特異性和符合率。計(jì)算公式：

相對(duì)敏感性(%)=[陽(yáng)性樣品數(shù)/(陽(yáng)性樣品數(shù)+假陰性樣品數(shù))]×100；

相對(duì)特異性(%)=[陰性樣品數(shù)/(陰性樣品數(shù)+假陽(yáng)性樣品數(shù))]×100；

符合率(%)=[(陽(yáng)性樣品數(shù)+陰性樣品數(shù))/檢測(cè)總數(shù)]×100。

2 結(jié) 果

2.1 目的基因的克隆、表達(dá)與純化

將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，進(jìn)行超聲裂解，分別將上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE鑒定。結(jié)果顯示，只有誘導(dǎo)沉淀組在40 ku處出現(xiàn)明顯條帶，大小與預(yù)期相符(圖1A)，說(shuō)明重組p72蛋白主要以包涵體的形式表達(dá)。通過(guò)尿素透析法純化重組p72蛋白。將純化后的目的蛋白進(jìn)行Western blot鑒定，ASFV陽(yáng)性血清用PBST進(jìn)行1∶100倍稀釋作為一抗，HRP-SPA用PBST進(jìn)行1∶10 000倍稀釋作為二抗，結(jié)果顯示在40 ku處出現(xiàn)特異性條帶(圖1B)，表明重組p72蛋白具有良好的反應(yīng)原性。

M.蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.誘導(dǎo)上清；2.誘導(dǎo)沉淀；3.重組p72蛋白純化后；4.BL21菌體裂解物對(duì)照；5.重組p72蛋白純化后；6.BL21菌體裂解物對(duì)照

2.2 單克隆抗體的鑒定、純化與HRP標(biāo)記

Western blot結(jié)果顯示(圖2A), 6E5單克隆抗體能與滅活的ASFV發(fā)生特異性反應(yīng)，在72 ku處有特異性的目的條帶。純化的6E5腹水SDS-PAGE鑒定結(jié)果(圖2B)顯示，該抗體具有50 ku(重鏈)和25 ku(輕鏈)兩個(gè)明顯條帶。HRP標(biāo)記抗體(HRP-6E5)ELISA工作濃度為1∶4 000。

M.蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.ASFV Pig/HLJ/2018滅活病毒液；2.豬肺泡巨噬細(xì)胞裂解物對(duì)照；3.小鼠腹水單抗6E5；4.純化的小鼠腹水單抗6E5

2.3 阻斷ELISA最佳反應(yīng)條件的確定

通過(guò)對(duì)阻斷ELISA方法的優(yōu)化，最終確定：最佳抗原包被濃度為0.5 μg·mL；血清稀釋度為1∶1(表1)，反應(yīng)條件為37 ℃ 1 h；最佳封閉劑為1% BSA(表2)，反應(yīng)條件為37 ℃ 2 h；酶標(biāo)抗體稀釋度為1∶4 000(表3)，反應(yīng)條件為37 ℃ 1 h；TMB底物37 ℃ 10 min。

表1 抗原包被濃度和血清稀釋度的確定

表2 最佳封閉液的確定

表3 酶標(biāo)單抗稀釋度的確定

2.4 臨界值確定

圖3 ASFV陰性血清阻斷率頻率分布分析

2.5 敏感性試驗(yàn)結(jié)果

選取50份ASFV陽(yáng)性血清樣品用本研究建立的阻斷ELISA方法進(jìn)行敏感性試驗(yàn)，結(jié)果顯示，3份血清PI值為35.75%～37.49%，判為陰性，其余47份血清PI值58.01%～95.00%，判為陽(yáng)性，表明該方法敏感性為94.0%。

2.6 特異性試驗(yàn)結(jié)果

采用本研究建立的阻斷ELISA方法檢測(cè)ASFV、PRV、PRRSV、CSFV、PCV2、SVA、FMDV、、PM、GPs和APP抗體陽(yáng)性血清，結(jié)果如表4所示，除ASFV陽(yáng)性血清檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性外，其他均為陰性，證明該方法具有良好的特異性。

表4 阻斷ELISA特異性試驗(yàn)結(jié)果

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

選取20份ASFV陽(yáng)性血清和10份ASFV陰性血清用本研究建立的阻斷ELISA方法進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示：批內(nèi)變異系數(shù)為0.78%～11.14%，批間變異系數(shù)為1.17%～11.56%，表明該方法具有良好的重復(fù)性。

2.8 符合率試驗(yàn)結(jié)果

用本研究建立的阻斷ELISA方法與IDvet公司生產(chǎn)的ASFV抗體檢測(cè)試劑同時(shí)檢測(cè)447份豬血清樣品。結(jié)果如表5所示，該方法與商品化試劑盒的相對(duì)敏感性為95.3%；相對(duì)特異性為94.5%；總符合率為94.9%。

表5 阻斷ELISA與商品化試劑盒符合率試驗(yàn)結(jié)果

3 討 論

自2018年8月我國(guó)遼寧省沈陽(yáng)市報(bào)告了首例ASF病例以來(lái)，該病迅速在全國(guó)范圍內(nèi)擴(kuò)散，嚴(yán)重影響了我國(guó)的跨國(guó)貿(mào)易、食品安全及畜牧業(yè)的發(fā)展。由于ASF的臨床癥狀與經(jīng)典豬瘟(CSF)、豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)十分相似，無(wú)法通過(guò)臨床癥狀和病理變化進(jìn)行鑒別診斷。因此，該病的確診主要依靠實(shí)驗(yàn)室診斷。在病毒血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)中，ELISA抗體檢測(cè)方法具有快速、敏感、便捷和批量化等優(yōu)點(diǎn)，適用于大規(guī)模樣品檢測(cè)，故建立一種可靠的ELISA方法，對(duì)我國(guó)ASF疫情防控十分必要。

我國(guó)學(xué)者對(duì)ASFV抗體檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行了一些研究，比如靳雯雯等建立的ASFV VP73蛋白間接ELISA方法具有良好的特異性和敏感性，檢測(cè)能力與進(jìn)口試劑盒相當(dāng)；曹琛福構(gòu)建的p54蛋白競(jìng)爭(zhēng)ELISA抗體檢測(cè)方法與西班牙Ingenasa試劑盒符合率為98.13%；張蕾等根據(jù)p30、p54和p72蛋白設(shè)計(jì)了3條合成肽，建立了ASFV間接ELISA抗體檢測(cè)方法，與進(jìn)口商品化試劑盒的符合為92.9%。目前，針對(duì)ASFV p72蛋白的阻斷ELISA抗體檢測(cè)方法研究不多。ASFV檢測(cè)抗原主要有p72、p30和p54蛋白等，其中，p72蛋白是ASFV中主要的結(jié)構(gòu)蛋白，其氨基酸序列高度保守，在病毒復(fù)制周期中持續(xù)存在能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生較高滴度的抗體，是ASFV血清抗體阻斷方法的理想靶標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)室前期制備了12株抗p72蛋白的單克隆抗體，并通過(guò)阻斷ELISA方法篩選鑒定出一株阻斷效果良好的單克隆抗體6E5。本研究利用ASFV p72蛋白單克隆抗體6E5成功建立了ASF阻斷ELISA抗體檢測(cè)方法。該方法與PRV、PRRSV、CSFV、PCV2、SVA、FMDV、、PM、GPs和APP的參考陽(yáng)性血清均不發(fā)生交叉反應(yīng)，證明該方法具有較高的特異性。該方法的批內(nèi)、批間試驗(yàn)變異系數(shù)均小于規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)的15%，表明該方法的重復(fù)性良好。該方法與ID ScreenAfrican Swine Fever Competition ELISA試劑盒同時(shí)檢測(cè)447份豬臨床血清樣品，兩者總符合率為94.9%。綜上所述，本研究建立的ASF阻斷ELISA抗體檢測(cè)方法具有較好的敏感性和特異性，可用于臨床血清學(xué)檢測(cè)。

本研究采用的ASFV陽(yáng)性血清和陰性血清來(lái)源于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所，臨床血清樣品來(lái)源于規(guī)?；i場(chǎng)。由于陽(yáng)性血清樣品的豬感染AFSV的時(shí)間等背景不夠清晰，因此該方法能否用于病毒感染的早期診斷尚需進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

利用ASFV重組p72蛋白及其單克隆抗體6E5，成功建立了ASFV p72蛋白阻斷ELISA檢測(cè)方法，該方法具有良好的敏感性、特異性和重復(fù)性，為臨床ASFV血清流行病學(xué)調(diào)查提供了技術(shù)手段。