酵母對(duì)亞急性瘤胃酸中毒綿羊緩解效果及作用機(jī)制研究

韓郭皓，高曉莎，段晉偉，張慧琴，鄭 巖，何金鑫，丁建安，霍乃蕊，裴彩霞，李紅麗，古少鵬*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，太谷 030801；2.朔州職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程系，朔州 036002；3.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，太谷 030801)

反芻動(dòng)物養(yǎng)殖中，為達(dá)最大生產(chǎn)性能常飼喂大量高精飼糧，高精飼糧在瘤胃內(nèi)發(fā)酵導(dǎo)致酸性有機(jī)物大量產(chǎn)生并積累，瘤胃pH長(zhǎng)期處于較低水平，引起亞急性瘤胃酸中毒(subacute ruminal acidosis，SARA)。SARA臨床癥狀常不明顯，預(yù)防和診斷比較困難，常造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。瘤胃pH是判斷SARA的關(guān)鍵指標(biāo)，瘤胃pH于5.2～5.6持續(xù)3 h以上可診斷發(fā)生SARA。目前，SARA發(fā)生機(jī)制包括乳酸中毒學(xué)說以及內(nèi)毒素組胺中毒學(xué)說。近年來，許多學(xué)者都致力于尋找一種高效、無毒副作用緩解瘤胃酸中毒的方法，如使用包括緩沖劑、電子受體、乳酸菌臨床疫苗和莫能菌素等方法來阻止或緩解瘤胃中毒的發(fā)生和發(fā)展。但上述方法效果欠佳，在一些大型牧場(chǎng)，SARA仍是當(dāng)前反芻動(dòng)物養(yǎng)殖中的主要疾病之一。

酵母在反芻動(dòng)物飼養(yǎng)中可以起到促進(jìn)瘤胃發(fā)育、促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化和吸收、調(diào)控瘤胃菌群結(jié)構(gòu)、加強(qiáng)機(jī)體免疫力等作用。研究表明，釀酒酵母CNCM I-4407可緩解荷斯坦奶牛SARA，提升瘤胃pH、降低瘤胃液乳酸積累、改善瘤胃菌群。但釀酒酵母CNCM I-1077并未顯著提升高精料飼喂夏洛萊牛的瘤胃pH。不同結(jié)果可能與酵母菌種有關(guān)，因而尋找具有改善反芻動(dòng)物瘤胃代謝，且有良好瘤胃內(nèi)環(huán)境適應(yīng)能力的酵母菌種十分重要。從瘤胃中分離和篩選的酵母具有更適應(yīng)瘤胃內(nèi)環(huán)境和更易在瘤胃內(nèi)生長(zhǎng)定殖的特點(diǎn)，可作為防治SARA的益生菌菌種，在反芻動(dòng)物健康養(yǎng)殖中有重要的應(yīng)用價(jià)值。

在本課題組前期研究中，成功分離鑒定并篩選出兩株牛瘤胃源褶皺假絲酵母()，經(jīng)體外發(fā)酵試驗(yàn)證實(shí)具有一定防治反芻動(dòng)物SARA作用。為進(jìn)一步闡明瘤胃源酵母對(duì)SARA的防治效果，本研究通過對(duì)SARA綿羊灌服上述兩株瘤胃源褶皺假絲酵母和1株釀酒酵母，研究3種酵母對(duì)瘤胃菌群、瘤胃與血液異常代謝產(chǎn)物和血?dú)庵笜?biāo)影響，進(jìn)一步探究酵母對(duì)SARA綿羊緩解效果及其機(jī)制，為研制防治反芻動(dòng)物SARA微生態(tài)制劑提供菌株和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 酵母

褶皺假絲酵母N07、褶皺假絲酵母N09、釀酒酵母ACCC 21162為本實(shí)驗(yàn)室保存菌種。褶皺假絲酵母N07和褶皺假絲酵母N09的18S rRNA序列信息保存于GenBank，登錄號(hào)分別為MW888912和MW888913。酵母液體培養(yǎng)基成分為：紅糖5%、酵母提取物2%、硫酸銨1%、氯化鉀0.2%。菌株接種后，置于39 ℃，180 r·min的蘇州培英THZ-C型恒溫震蕩器中培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)后的酵母菌數(shù)達(dá)到1×10CFU·mL。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取60只2月齡同期斷奶、平均體重(20.50±2.21)kg杜泊羊(♂)×湖羊(♀)F代作為試驗(yàn)動(dòng)物，公母各半。預(yù)飼期30 d，飼喂精粗比50∶50基礎(chǔ)飼糧。通過遞增飼糧精粗比誘導(dǎo)綿羊發(fā)生SARA，飼糧精粗比依次為70∶30、80∶20、90∶10和100∶0，各比例飼糧飼喂7 d，第28天確認(rèn)40只綿羊發(fā)生SARA。將40只SARA綿羊隨機(jī)分為4組，分別為：SARA模型組(SARA，=10)、釀酒酵母組(SC，=10)、褶皺假絲酵母一組(DR1，=10)和褶皺假絲酵母二組(DR2，=10)，均飼喂精粗比為90∶10飼糧，各酵母組于每日晨飼后分別灌服釀酒酵母ACCC 21162、褶皺假絲酵母N09、褶皺假絲酵母N07培養(yǎng)液100 mL。另設(shè)置對(duì)照組(CON，=10)，飼喂精粗比50∶50飼糧。試驗(yàn)設(shè)計(jì)如圖1所示。每日06:00和17:00飼喂，各飼糧組成見表1。

表1 飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

圖1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3 樣品收集與測(cè)定

灌服酵母期第1、3、7天晨飼后3 h以及第10天晨飼后1、2、3、4、5、6、8 h使用科立博A1164K型瘤胃液口腔采樣器抽取瘤胃液，每只50 mL，四層紗布過濾保存。灌服酵母期第10天，晨飼前用BD Preset采血器和含促凝劑的采血管采集頸靜脈血液。

1.4 生物信息與統(tǒng)計(jì)分析

各樣本菌群測(cè)序數(shù)據(jù)根據(jù)原始序列數(shù)據(jù)的條形碼序列和PCR擴(kuò)增引物序列分離得到。使用FLASH 1.2.7獲得高質(zhì)量的標(biāo)簽數(shù)據(jù)。Qiime 1.9.1用于標(biāo)簽截取和標(biāo)簽長(zhǎng)度過濾。Vsearch 2.8.1用于去除嵌合序列并獲得有效標(biāo)簽。利用Uparse 7.0.1001基于97%的序列一致性，將這些序列組合成可操作的分類單元(OTUs)。Mothur方法和SILVA 132的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫(kù)用于物種注釋分析。使用Qiime 1.9.1和R 2.15.3進(jìn)行alpha多樣性分析和beta多樣性分析。

使用SPSS 26軟件的單因素方差分析和DUNCAN檢驗(yàn)法的多重比較進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，相關(guān)性分析采用雙變量Pearson相關(guān)分析。<0.05時(shí)有顯著差異。數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)”表示。

2 結(jié) 果

2.1 酵母對(duì)SARA綿羊瘤胃pH的影響

由表2和表3可知，隨灌服酵母時(shí)間延長(zhǎng)，灌服酵母組瘤胃pH逐漸升高，第3天(<0.05)和第7天(<0.01)灌服酵母組pH均顯著高于SARA組；第10天測(cè)定的7個(gè)時(shí)間點(diǎn)灌服酵母組pH均極顯著高于SARA組(<0.01)，說明SARA狀態(tài)得到有效緩解。

表2 酵母對(duì)SARA綿羊瘤胃pH的影響

表3 灌服酵母期第10天瘤胃液pH

2.2 酵母對(duì)SARA綿羊瘤胃異常代謝的影響

由表4可知，灌服酵母組第10 天瘤胃液乳酸和組胺含量顯著低于SARA組(<0.05)，DR1組和DR2組瘤胃液組胺含量極顯著低于SARA組(<0.01)，灌服酵母組瘤胃液內(nèi)毒素較SARA組有所下降，但差異不顯著(>0.05)。

表4 不同酵母對(duì)綿羊瘤胃液乳酸、組胺、內(nèi)毒素的影響

2.3 酵母對(duì)SARA綿羊瘤胃菌群的影響

由表5可知，各組間菌群Chao 1指數(shù)和Shannon指數(shù)差異不顯著(>0.05)，灌服酵母組瘤胃菌群Chao 1指數(shù)較SARA組有所提升，其中SC組最高；SC和DR2組Shannon指數(shù)較SARA組有所提升，其中DR2組最高。

表5 不同酵母對(duì)綿羊瘤胃菌群Alpha多樣性的影響

由圖2可知，門水平下，主要菌門為擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、軟壁菌門(Tenericutes)。SC組和CON組最優(yōu)菌門為擬桿菌門，SARA、DR1、DR2組最優(yōu)菌門為厚壁菌門。與SARA組相比，SC、DR1、DR2組擬桿菌門(55.48%、29.46%、24.95%)相對(duì)豐度增加，厚壁菌門(38.69%、63.52%、60.55%)相對(duì)豐度減少。

圖2 不同酵母組綿羊瘤胃10個(gè)最豐富細(xì)菌門(A)和屬(B)的相對(duì)豐度

屬水平下，主要菌屬為瘤胃菌科未確定屬(unidentified)、普雷沃氏菌科未確定菌屬(unidentified)、羅氏菌屬()、乳桿菌屬()、毛螺菌科未確定菌屬(unidentified)、解琥珀酸菌屬()。SC組最優(yōu)菌屬為乳桿菌屬，CON組最優(yōu)菌屬為普雷沃氏菌科未確定菌屬，SARA、DR1、DR2組最優(yōu)菌屬為瘤胃菌科未確定屬。與SARA組相比，SC組乳桿菌屬(10.29%)、普雷沃氏菌科未確定菌屬(2.57%)相對(duì)豐度升高；羅氏菌屬(5.89%)和瘤胃菌科未確定屬(3.89%)相對(duì)豐度降低。與SARA組相比，DR1組乳桿菌屬(7.03%)、羅氏菌屬(9.66%)、普雷沃氏菌科未確定菌屬(2.23%)相對(duì)豐度升高；瘤胃菌科未確定屬(24.73%)和解琥珀酸菌屬(1.94%)相對(duì)豐度降低。與SARA組相比，DR2組普雷沃氏菌科未確定菌屬(5.41%)相對(duì)豐度升高，羅氏菌屬(1.75%)、乳桿菌屬(2.19%)、瘤胃菌科未確定屬(20.42%)相對(duì)豐度降低。

由圖3可知，SARA組相對(duì)豐度顯著增加(<0.05)，DR1組相對(duì)豐度顯著增加(<0.05)。

A.LDA值分布圖；B.分支進(jìn)化圖

2.4 酵母對(duì)SARA綿羊血液代謝的影響

表6 不同酵母對(duì)綿羊血?dú)夥治龅挠绊?/p>

表7 不同酵母對(duì)綿羊血清異常代謝的影響

2.5 瘤胃液、血液和瘤胃菌群主要指標(biāo)間相關(guān)性分析

由圖4可知，瘤胃液pH與血清內(nèi)毒素、血清組胺呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)(<0.05)，瘤胃液pH與瘤胃液內(nèi)毒素、瘤胃液組胺、瘤胃液乳酸呈現(xiàn)極顯著負(fù)相關(guān)(<0.01)，瘤胃液pH與血液實(shí)際碳酸氫鹽呈現(xiàn)顯著正相關(guān)(<0.05)；瘤胃液乳酸與菌群Chao 1指標(biāo)呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)(<0.05)，瘤胃液乳酸與血清內(nèi)毒素、血液乳酸呈現(xiàn)顯著正相關(guān)(<0.05)，瘤胃液乳酸與血清組胺、瘤胃液內(nèi)毒素、瘤胃液組胺呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)(<0.01)；血液實(shí)際碳酸氫鹽與瘤胃液組胺、瘤胃液內(nèi)毒素、血液乳酸呈現(xiàn)極顯著負(fù)相關(guān)(<0.01)。

*.P<0.05；**.P<0.01

3 討 論

反芻動(dòng)物瘤胃內(nèi)環(huán)境和微生物生態(tài)體系處于一個(gè)動(dòng)態(tài)的平衡狀態(tài)。瘤胃pH是最基本、最直接、最重要的生理指標(biāo)。Alzahal等研究表明，活性釀酒酵母Y1242有助于提升反芻動(dòng)物瘤胃pH。本研究顯示3株酵母均可有效提升瘤胃pH，與上述研究結(jié)果一致。

瘤胃穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境為微生物活動(dòng)及繁殖提供了良好的生存條件，瘤胃菌群通過參與瘤胃內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝而影響瘤胃代謝。反芻動(dòng)物長(zhǎng)期采食高精料飼糧會(huì)導(dǎo)致瘤胃內(nèi)環(huán)境和瘤胃菌群失衡，乳酸菌產(chǎn)生增加，導(dǎo)致瘤胃乳酸產(chǎn)生增多，乳酸積累，引起瘤胃酸中毒。本研究中，3種酵母均顯著降低了瘤胃乳酸積累。相反地，Vyas等在牛飲食中添加活性干酵母并沒有觀察到瘤胃乳酸顯著下降。不同結(jié)果可能與酵母菌種及飼糧組成相關(guān)。本研究顯示，Chao 1與瘤胃乳酸濃度呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)，瘤胃乳酸積累導(dǎo)致瘤胃內(nèi)環(huán)境長(zhǎng)期處于酸性狀態(tài)，瘤胃內(nèi)環(huán)境變化引起瘤胃細(xì)菌大量死亡，菌群豐富度降低。本研究顯示，3種酵母均有助于維持瘤胃菌群數(shù)量，這可能因酵母代謝了瘤胃內(nèi)異常發(fā)酵產(chǎn)生的乳酸，起到了維持瘤胃內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的作用。本研究顯示，灌服酵母可提升瘤胃菌群豐富度和多樣性，與Cao等的研究結(jié)果相似。瘤胃內(nèi)毒素和瘤胃組胺呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)，SARA導(dǎo)致瘤胃內(nèi)大量細(xì)菌死亡，死亡后的革蘭陰性菌細(xì)胞壁釋放出大量?jī)?nèi)毒素進(jìn)入瘤胃，同時(shí)促進(jìn)1種炎癥介質(zhì)組胺的產(chǎn)生。本研究中的3種酵母均降低了瘤胃組胺和內(nèi)毒素含量，與Peng等研究一致，提示酵母可通過改善瘤胃內(nèi)環(huán)境緩解酸中毒狀態(tài)，減少瘤胃內(nèi)細(xì)菌的死亡。褶皺假絲酵母N07組瘤胃組胺和內(nèi)毒素含量最低，在減輕瘤胃炎癥方面顯示了優(yōu)勢(shì)。而Diaz等報(bào)道在羔羊飼料中添加1種商業(yè)活性釀酒酵母后對(duì)瘤胃內(nèi)毒素含量并沒有產(chǎn)生顯著的影響。不同結(jié)果可能與動(dòng)物品種和酵母菌種相關(guān)。

本研究中，灌服酵母組瘤胃液和血清內(nèi)毒素、血清組胺與SARA組差異不顯著，可能與綿羊發(fā)生SARA后仍以高精料飼喂、灌服酵母持續(xù)時(shí)間較短等因素有關(guān)。本課題組前期對(duì)處于SARA誘導(dǎo)過程的綿羊灌服3株酵母，發(fā)現(xiàn)灌服酵母組瘤胃液和血清內(nèi)毒素均顯著低于SARA組，表明防治綿羊SARA發(fā)生應(yīng)以預(yù)防為主，防重于治。

4 結(jié) 論

本研究中3株酵母均可通過提升瘤胃菌群豐富度，降低瘤胃液和血液乳酸積累，減輕瘤胃炎癥，提升機(jī)體堿儲(chǔ)備，起到緩解綿羊SARA的作用，可為防治反芻動(dòng)物SARA微生態(tài)制劑提供優(yōu)良菌株和理論依據(jù)。