利用微衛(wèi)星分析康西草原馬匹種群的遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)

康周才讓，劉 宇，王 敏，李 穎，畢曉昆，李媛媛，凌 遙，趙春江*

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院,北京 100193; 2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)馬研究中心,北京 100193)

自古以來，康西草原是北京地區(qū)馬匹的主產(chǎn)區(qū),也是北京近郊的第一大草場。該地氣候冬冷夏涼，年平均氣溫8 ℃，是著名的避暑勝地。該地區(qū)土壤中含有豐富的礦物質(zhì)元素，土質(zhì)疏松，水源充足。當(dāng)?shù)氐牟輬龊娃r(nóng)副產(chǎn)品為養(yǎng)馬提供了有利的條件。在上個世紀(jì)早期，當(dāng)?shù)伛R匹主要供農(nóng)役和軍用。隨著時間的推移，該地區(qū)旅游業(yè)逐漸發(fā)展起來，馬匹的作用也發(fā)生了變化，更多向著騎乘娛樂方向發(fā)展。本地馬多被淘汰，當(dāng)?shù)伛R主為適應(yīng)游客的需求逐漸引進(jìn)國外的騎乘型馬，但由于缺乏品種登記信息，許多馬的品種來源不明，這給該群體的資源評價、進(jìn)一步培育和開發(fā)利用帶來了困難。近幾十年來，不斷成熟的分子生物學(xué)技術(shù)為馬品種起源分析和資源評估提供了有力的手段。本研究擬采用微衛(wèi)星DNA位點多態(tài)性分析技術(shù)對該地區(qū)馬匹進(jìn)行群體遺傳學(xué)研究。

微衛(wèi)星 DNA 作為多態(tài)性豐富且容易獲得的基因標(biāo)記，廣泛用于構(gòu)建物種的遺傳連鎖圖譜、基因鑒定、物種進(jìn)化、群體間親緣關(guān)系分析以及系譜鑒定等方面。該技術(shù)在馬的遺傳學(xué)研究中應(yīng)用也很廣泛，如為確定關(guān)中馬的遺傳多樣性和驗證其系譜記錄，有學(xué)者采用8個微衛(wèi)星標(biāo)記對67個關(guān)中馬個體進(jìn)行了基因分型；利用微衛(wèi)星DNA確定沙漠型阿位伯馬與埃及、波蘭阿拉伯馬之間的關(guān)系，并分析它們的起源和形成過程；在利用微衛(wèi)星DNA對馬爾查多馬群體結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究中揭示了群體間的基因流動，以及與其他馬品種的遺傳關(guān)系，為該馬品種的進(jìn)一步培育打下了基礎(chǔ)。除此之外，還有利用微衛(wèi)星DNA檢測技術(shù)對吉爾吉斯馬、約納古尼馬、宮古馬、利皮贊馬、比戈拉吉馬、野馬、西班牙矮馬和委內(nèi)瑞拉克里奧羅馬等的研究。國內(nèi)外利用微衛(wèi)星DNA分子標(biāo)記技術(shù)探索馬匹來源的研究眾多，也為本研究提供了參考依據(jù)。本研究以康西草原的馬群體為研究對象，擬研究其起源及群體結(jié)構(gòu)，為遺傳資源評估和將來進(jìn)一步的開發(fā)利用打下堅實的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究選擇6個馬群體，國內(nèi)品種為百色馬，國外品種包括溫血馬、阿哈捷金馬、阿拉伯馬和純血馬，分別從德國、俄羅斯(阿哈捷金馬、阿拉伯馬)、愛爾蘭引入我國，在北京周邊馬術(shù)俱樂部采集樣本。百色馬在我國的廣西省百色市采集血樣，6個馬種群的信息見表1。血液樣品低溫運(yùn)回于試驗室-80 ℃冰箱保存。

表1 6個馬種群的來源

1.2 DNA提取與微衛(wèi)星擴(kuò)增

本研究使用血液基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司,北京)進(jìn)行DNA提取, 采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA樣品質(zhì)量；超微量核酸蛋白測定儀(OD/OD)測定DNA濃度，并將濃度調(diào)至30 ng·μL。試驗采用國際動物遺傳協(xié)會(International Society For Animal Genetics)和聯(lián)合國糧農(nóng)組織(The Food And Agriculture Organization)聯(lián)合推薦的馬屬動物遺傳多態(tài)性的12個微衛(wèi)星標(biāo)記(HTG4、HTG10、HMS2、HMS3、HMS6、VHL20、ASB2、AHT5、AHT4、HMS7、ASB17、ASB23)。

微衛(wèi)星DNA位點擴(kuò)增試驗采用 ABI公司的馬親子鑒定試劑盒來操作，具體步驟詳見說明書，擴(kuò)增引物信息見表2。PCR-STR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳鑒定后采用毛細(xì)管電泳法測定擴(kuò)增的微衛(wèi)星片段大小。其中在自動測序儀(ABI PRISM遺傳分析儀3730Xl)進(jìn)行的基因掃描由北京諾賽基因組研究中心有限公司完成。返回數(shù)據(jù)利用PeakScannerSoftwarev1.0軟件讀取并記錄,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行校正,判斷片段大小。

表2 12個微衛(wèi)星位點的信息

1.3 數(shù)據(jù)分析

1.3.1 遺傳多樣性分析 利用GENALEX 6.0軟件計算各群體的等位基因數(shù)(number of alleles,)、有效等位基因數(shù)(effective number of alleles,)、期望雜合度(expected heterozygosity,)、多態(tài)信息含量(polymorphism information content,)、觀察雜合度(observed heterozygosity,)、Shannon信息指數(shù)(Shannon information index,)和等位基因豐富度等(allelic richness，)等遺傳參數(shù)。使用在線GENEPOP分析軟件的費(fèi)舍爾精確測試法求出各單位點的平均值，用以檢測在單位點水平各位點基因型頻率是否偏離哈迪-溫伯格平衡(Hardy-Weinberg equilibrium,HWE)以及是否處于連鎖不平衡(linkage disequilibrium,LD)的狀態(tài)。

1.3.2 遺傳分化和瓶頸分析 利用Arlequin 3.1.0.2軟件計算遺傳分化系數(shù)(genetic differentiation coefficient，)來評估群體間的遺傳分化程度，并用Bootstrap進(jìn)行1 000次重復(fù)抽樣以檢驗的置信水平。為探討遺傳距離與地理距離之間的相互關(guān)系，進(jìn)行了距離隔離模式分析(isolation by distance，IBD)。種群間的Nei’s遺傳距離由POPGENE3.2軟件計算獲得，地理距離則以各種群的實際經(jīng)緯度換算得到。利用SPSS軟件分析延慶地區(qū)馬群體與其他馬種群之間地理距離和遺傳距離之間的Mantel相關(guān)性分析。利用BOTTLENECK 1.2.02軟件用來分析各馬種群的瓶頸效應(yīng)。分析假設(shè)為一個無限等位基因模型(infinite allele model,IAM)，一個逐步突變模型(step-wise mutation mode,SMM)和兩階段模型(two phased model of mutation,TPM)，并使用雙尾Wilcoxon符號秩檢驗在5%的概率水平下對不同的模型進(jìn)行評估。

1.3.3 群體遺傳結(jié)構(gòu)分析 利用POPGENE3.2軟件計算各群體之間的遺傳距離。Bootstrap重復(fù)抽樣1 000次，對各分支自檢，確定置信水平。使用MEGA 7.0根據(jù)群體間Nei’s標(biāo)準(zhǔn)遺傳距離采用UPGMA進(jìn)行聚類分析。利用Structure 2.2軟件通過貝葉斯聚類方法分析種群遺傳結(jié)構(gòu)，采用的是馬爾科夫鏈蒙特卡洛算法(Markov chain monte car,MCMC)。K值選擇2～7，對每個值重復(fù)6次，預(yù)熱100 000次并舍棄，隨后進(jìn)行1 000 000次重復(fù)正式計算。為了進(jìn)一步描述不同地理種群間的遺傳結(jié)構(gòu)情況，使用GENETIX 4.02軟件中的相關(guān)因子分析程序(factor analysis，F(xiàn)CA)進(jìn)行群體的三維主成分聚類分析。

2 結(jié) 果

2.1 遺傳多樣性

對本研究中的6個馬群體的12個微衛(wèi)星DNA位點進(jìn)行多態(tài)性分析，共檢測到221個等位基因。有效等位基因數(shù)()介于3.649～5.397,平均為4.405。期望雜合度()最低為0.681，最高為0.798。觀測雜合度()介于0.632～0.780之間，多態(tài)信息含量()介于0.643～0.772,為高度多態(tài)(>0.5)。平均等位基因豐富度()為7.366，總體范圍在5.132～9.156之間。Shannon指數(shù)()在1.372～1.829之間(表3)。

表3 6個馬群體總遺傳參數(shù)

采用GENEPOP4.0 軟件通過馬爾可夫鏈方法檢測每個種群在各位點是否符合哈迪-溫伯格平衡(HWE)以及是否處于連鎖不平衡(LD)的狀態(tài)。6個馬匹種群 12個位點的哈溫平衡檢驗結(jié)果通過Bonferroni校正過后的值為0.006 5。大多數(shù)位點的值都大于校正值(=0.006 5)。其中康西草原馬群體的HTG4和HMS3位點、純血馬的HMS7和HMS2位點、阿拉伯馬的HMS2等單位點偏離了哈溫平衡(<0.006 5,表4)。進(jìn)一步對各位點進(jìn)行連鎖不平衡分析，同樣通過Bonferroni方法進(jìn)行校正。結(jié)果顯示，大多數(shù)位點處于連鎖平衡，而只有HMS3和AHT4之間處于連鎖不平衡的狀態(tài)(表5)。

表4 微衛(wèi)星DNA位點的哈迪-溫伯格平衡分析

表5 微衛(wèi)星DNA位點連鎖不平衡分析

2.2 群體分化和瓶頸效應(yīng)分析

各群體之間的在0.061～0.145，總體來說群體間分化程度較低(<0.15)。通過觀察康西草原馬群體與其他馬群體間的分化程度發(fā)現(xiàn),該群體與溫血馬之間的分化程度最小，為0.038，說明兩個群體之間最有可能存在基因交流(表6)。為了進(jìn)一步了解遺傳距離與地理距離的相關(guān)性，繪制了基于Nei’s遺傳距離與地理距離之間的Mantel相關(guān)分析圖(圖1)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者之間處于正相關(guān)，但是值并不顯著。根據(jù)微衛(wèi)星位點的等位基因頻率，基于3種不同的假設(shè)IAM、SMM、TPM三種模型進(jìn)行瓶頸效應(yīng)分析。結(jié)果顯示溫血馬、純血馬、百色馬以及康西草原馬種群在不同模型下都經(jīng)歷了不同程度瓶頸效應(yīng)的影響。其中康西草原馬種群在IAM模型下值極顯著(表7)，說明該群體在歷史上數(shù)量有大幅度的減少，可能發(fā)生過大規(guī)模的遷移。

表6 各群體間群體分化系數(shù)(Fst)

表7 6個馬匹種群瓶頸效應(yīng)分析

圖1 基于Nei’s遺傳距離與地理距離之間Mantel相關(guān)性檢驗

2.3 群體結(jié)構(gòu)分析

利用MEGA 7.0軟件構(gòu)建基于Nei’s標(biāo)準(zhǔn)遺傳距離的UPGMA樹狀圖。通過樹狀圖發(fā)現(xiàn)6個馬群體分為3組。其中溫血馬、康西草原地區(qū)馬群體以及純血馬聚為一類，阿拉伯馬和阿哈捷金馬聚為一類，百色馬單獨(dú)聚為一類(圖2)。基于Structure的貝葉斯聚類分析結(jié)果表明，經(jīng)過 6 次重復(fù)的分群測試，結(jié)果顯示當(dāng) K=3時，Delta K出現(xiàn)明顯拐點且取得最大值(圖3)，說明 6個種群可劃分3個亞群。第一個亞群為溫血馬、康西草原地區(qū)馬群體和純血馬；第二個亞群為阿拉伯馬和阿哈捷金馬；第三個亞群為百色馬(圖4)，這與UPGMA的結(jié)果相同。因子相關(guān)分析(FCA)顯示了與UPGMA樹狀圖和Structure貝葉斯聚類分析一致的結(jié)果(圖5)。

圖2 基于Nei’s標(biāo)準(zhǔn)遺傳距離UPGMA樹狀圖

圖3 Delta K在K=3時得到最大值

每個矩形代表一個群體

圖5 FCA因子分析定義的各群體空間表現(xiàn)圖示

3 討 論

微衛(wèi)星標(biāo)記已被證明是對遺傳多樣性和群體遺傳學(xué)研究有效的方法之一。目前，微衛(wèi)星DNA標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)成為檢測物種多樣性的重要手段，大量的微衛(wèi)星數(shù)據(jù)用于牛、羊、馬等物種的遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)分析。通過遺傳多樣性的評估可了解品種的遺傳結(jié)構(gòu)以及分析其進(jìn)化的歷史和潛力。動物種群的遺傳多樣性可以通過每個基因座的等位基因數(shù)量、等位基因豐富度和雜合度等參數(shù)來估計。當(dāng)然微衛(wèi)星的方法也用于解決其他問題。在本研究中通過12個微衛(wèi)星位點的多態(tài)性檢測，在6個種群中共檢測到221個等位基因。所有被測的6個馬種群遺傳多樣性水平都較高，各遺傳參數(shù)都略高于以往的一些馬品種上的研究，這可能與所采樣品的代表性有關(guān)。多態(tài)信息含量()是評價微衛(wèi)星位點的重要參考標(biāo)準(zhǔn), 若>0.5表明該位點具有高度多態(tài)性,若0.25<<0.5表明該位點具有中度多態(tài)性, 若<0.25表明該位點具有低度多態(tài)性。6個馬種群多態(tài)信息含量都在0.6以上。評價遺傳多樣性另一個最重要參數(shù)是等位基因雜合性，該參數(shù)提供有關(guān)種群結(jié)構(gòu)的信息，高值意味著等位基因多樣性更大。本研究中各群體觀測雜合度及期望雜合度均具有較高水平(>0.6,>0.6)。這些遺傳參數(shù)明顯高于之前的研究。導(dǎo)致遺傳參數(shù)都較高的原因與群體間的分化系數(shù)()有關(guān)系，較大基因流導(dǎo)致了群體內(nèi)基因的雜合度上升。

Wright認(rèn)為，當(dāng)<0.05 時，兩種群幾乎無分化；當(dāng) 0.05 <<0.15 時，種群中度分化；當(dāng)0.15<<0.25 時，種群發(fā)生明顯分化；當(dāng)>0.25 時，種群極度分化?？滴鞑菰貐^(qū)馬群體與其他各種群間的分化程度集中在0.038～0.145之間?？傮w上處于低分化的狀態(tài)(<0.05)，這與先前的研究利比贊品種、阿爾及利亞馬、印度品種和波蘭原始馬的值還要略低。分化低意味著有基因流存在。在品種培育過程中，從阿拉伯馬到純血馬、從純血馬到溫血馬都有過顯著的基因流，這與本研究的結(jié)果相符。延慶馬與溫血馬和純血馬分化程度也很低，表明了它們之間可能存在密切的遺傳關(guān)系。通過Mantel相關(guān)性分析揭示了地理距離和遺傳距離之間的關(guān)系，兩者處于正相關(guān)的關(guān)系(=0.502)。但兩者之間的關(guān)系不顯著性(>0.1)。這就說明地理距離并沒有成為康西草原馬群體與其他群體間的基因流動的阻礙，這可能與該地區(qū)馬主常年進(jìn)口大量國外馬息息相關(guān)。瓶頸效應(yīng)分析顯示康西草原馬群體在IAM模型下表現(xiàn)出了顯著性雜合子過剩的情況發(fā)生。當(dāng)?shù)芈糜螛I(yè)的發(fā)展導(dǎo)致運(yùn)動性能欠佳的本地品種逐漸失去用武之地，而性能優(yōu)良的國外騎乘馬受到當(dāng)?shù)氐臍g迎。這樣地方品種被馬主售賣，馬匹數(shù)量在歷史上有大幅度的減少，這可能是造成康西草原馬群體瓶頸效應(yīng)的主要原因。

UPGMA樹狀圖、相關(guān)因子分析(FCA)以及Structure貝葉斯聚類分析都顯示6個群體分為3大類。其中康西草原馬群體與溫血馬和純血馬聚為一類，說明他們之間的血緣關(guān)系最近。這就表明了這些馬的來源與溫血馬、純血馬這類騎乘馬密切相關(guān)。但這并不能認(rèn)為該馬群體與地方馬之間無血緣關(guān)系。通過群體分化系數(shù)()顯示百色馬與康西草原馬群體之間分化程度較低，說明該群體與地方馬之間也有基因交流存在，即該地區(qū)馬群體中有地方馬的血統(tǒng)。馬種群的遺傳結(jié)構(gòu)反映了包括長期進(jìn)化歷史在內(nèi)的各種過程的相互作用，一般地理隔離是造成群體分化的主要原因。地理距離與遺傳距離的Mantel相關(guān)分析顯示正相關(guān)表明了這一點。雖然由于交通運(yùn)輸?shù)谋憷沟眠z傳距離與地理距離關(guān)系并不顯著，但是地理距離遠(yuǎn)的馬之間也有可能存在一定的基因流動。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，康西草原馬群體具有較高的遺傳多樣性，該群體的來源與溫血馬和純血馬等國外優(yōu)良騎乘型馬品種的引入密切相關(guān)。本研究的結(jié)果對于延慶地區(qū)馬的育種具有重要的參考價值。

感謝北京市延慶區(qū)康西草原各大馬場馬主對采樣工作的支持。如上資助來源于家養(yǎng)動物種質(zhì)資源庫。