牦牛IGFBP4對(duì)肝細(xì)胞增殖的調(diào)控及功能分析

傅 芳，唐小鳳，王 利*，李 鍵，官久強(qiáng)

(1.西南民族大學(xué) 青藏高原動(dòng)物遺傳資源保護(hù)與利用教育部和四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610041；2.四川省草原科學(xué)研究院，成都 611731)

IGFBPs是IGFs的重要組成之一，通過(guò)與IGF配體、IGF受體之間的相互作用，共同調(diào)節(jié)機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育，參與脊椎動(dòng)物生長(zhǎng)、新陳代謝、生殖和免疫等調(diào)控過(guò)程。IGFBP4作為構(gòu)成動(dòng)物GH/IGF生長(zhǎng)軸的重要成員，能促進(jìn)正常細(xì)胞增殖、分化、代謝等多種生理過(guò)程，同時(shí)能抑制癌細(xì)胞增殖和生存，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。IGFBP4主要在肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞合成，既可依賴于IGF又可獨(dú)立于IGF發(fā)揮其生物學(xué)作用。IGFBP4依賴作用表現(xiàn)在與IGF具有較強(qiáng)的親和力，可與IGF結(jié)合調(diào)節(jié)生物活性。在與非IGF系統(tǒng)蛋白相互作用下，IGFBP4可促進(jìn)細(xì)胞增殖、代謝，體現(xiàn)其獨(dú)立性，并可通過(guò)激活PI3K-Akt信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞分化。

牦牛()是我國(guó)青藏高原高山牧區(qū)特有的畜牧種質(zhì)資源，常年生活在氣候寒冷、高度缺氧、牧草缺少、強(qiáng)紫外線等極端生態(tài)環(huán)境中，是乳肉兼用高原型地方優(yōu)良品種，也是我國(guó)動(dòng)物遺傳資源中珍稀的畜種資源和基因庫(kù)。肝是哺乳動(dòng)物機(jī)體內(nèi)最大的消化腺及代謝器官，利用內(nèi)分泌因子不斷調(diào)節(jié)新陳代謝平衡，在各種營(yíng)養(yǎng)/有害物質(zhì)代謝、蛋白質(zhì)合成和消化液合成等過(guò)程中發(fā)揮重要功能。動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，外源性細(xì)胞色素P450等生物活性物質(zhì)可對(duì)肝的成熟和代謝進(jìn)行調(diào)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)，4參與了肝細(xì)胞的損傷再修復(fù)過(guò)程。迄今為止，關(guān)于IGFBP4的研究多集中在mRNA水平的表達(dá)調(diào)控，尚未見(jiàn)IGFBP4在牦牛肝生長(zhǎng)發(fā)育中作用的相關(guān)研究。

本研究以麥洼牦牛為試驗(yàn)對(duì)象，構(gòu)建pET-28a-BgIGFBP4原核表達(dá)載體，對(duì)其進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定，并探究IGFBP4蛋白對(duì)牦牛肝細(xì)胞及對(duì)小鼠生長(zhǎng)的影響，為進(jìn)一步研究IGFBP4在牦牛肝生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的作用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為深入研究IGFBP4的生物學(xué)功能提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

Gel Extraction Kit購(gòu)自美國(guó)Omega Bio-Tek公司；Ⅰ、Ⅰ限制性內(nèi)切酶、T4連接酶購(gòu)自日本TaKaRa公司；Protein Marker、大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京擎科公司；His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒、抗His標(biāo)簽鼠單克隆抗體購(gòu)自北京康為世紀(jì)公司；BCA Protein Assay Kit購(gòu)自北京天根公司；ECL發(fā)光試劑(C510043)、CCK8試劑盒(E606335)購(gòu)自上海生工公司；小鼠生長(zhǎng)激素(YX-E28736)、胰島素(YX-E20353)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(YX-E20260)ELISA檢測(cè)試劑盒、牦牛生長(zhǎng)激素(YX-E28725)、胰島素(YX-E28749)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(YX-E28788)ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自成都鵬世達(dá)公司。

穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(型號(hào)為DYY-6B)購(gòu)自北京市六一儀器廠；冷凍離心機(jī)(型號(hào)為5430R)購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司；凝膠成像系統(tǒng)(型號(hào)為Universal Hood II)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(型號(hào)為CFX96)、半干轉(zhuǎn)膜儀(型號(hào)為Trans-Blot TurboSystem)、免染蛋白印跡轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)(型號(hào)為ChemiDocImaging System)、酶標(biāo)儀(型號(hào)為iMark)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)BioSpec-nano購(gòu)自日本島津生命科學(xué)公司；二氧化碳培養(yǎng)箱(型號(hào)為3131)、細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(型號(hào)為CountessⅡ)購(gòu)自美國(guó)Thermo公司。

1.2 原核表達(dá)載體的構(gòu)建

將本實(shí)驗(yàn)室已擴(kuò)增得到的陽(yáng)性PCR產(chǎn)物回收、純化(引物序列為：F:GGGTACCATGCTGTCCCTCTGCCTC，R:CGGATCCTCACTCTCGGA-AGCTGTCAG)，再用Ⅰ、Ⅰ限制性內(nèi)切酶對(duì)回收產(chǎn)物和pET28a載體進(jìn)行雙酶切。酶切體系為：目的片段/pET28a載體12 μL，Ⅰ、Ⅰ各3 μL，1×K buffer 2 μL?；靹蚝?7 ℃金屬浴酶切6 h，再16 ℃金屬浴連接12 h。連接體系為：目的片段15.5 μL，pET28a載體1.5 μL，T4連接酶1 μL，T4連接酶buffer 2 μL。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，復(fù)蘇后涂布于含0.1% Kana(50 μg·mL)的LB培養(yǎng)基上37 ℃培養(yǎng)12 h，挑單菌落液體培養(yǎng)4 h。經(jīng)菌液PCR鑒定后，將陽(yáng)性克隆菌液送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

1.3 蛋白表達(dá)、純化及鑒定

將成功克隆的pET28a-BgIGFBP4菌株37 ℃培養(yǎng)至OD值在0.6～0.7時(shí)，分別加入0.25、0.5、1、1.5、2 mmol·LIPTG誘導(dǎo)，取pET28a空載、未誘導(dǎo)和誘導(dǎo)12 h的菌液進(jìn)行SDS-PAGE。將pET28a-BgIGFBP4菌株擴(kuò)大誘導(dǎo)300 mL，加入PBS超聲破碎菌體，離心后向沉淀中加入含8 mol·L尿素的Binding Buffer進(jìn)行溶解，將離心得到的上清過(guò)濾后負(fù)載上柱，收集洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE，并按照BCA Protein Assay Kit進(jìn)行濃度檢測(cè)。取純化得到的BgIGFBP4蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離后進(jìn)行His標(biāo)簽鑒定，以25 V轉(zhuǎn)膜30 min，5%脫脂奶粉封閉，先后孵育His標(biāo)簽一抗(4 ℃過(guò)夜，1∶4 000)和IgG-HRP二抗(室溫1 h，1∶10 000)，利用化學(xué)發(fā)光液進(jìn)行ECL顯色并拍照。

1.4 BgIGFBP4蛋白對(duì)牦牛肝細(xì)胞增殖活性及集落形成能力的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，每組5個(gè)重復(fù)。試驗(yàn)組用“1.3”中獲得的0.002、0.02、0.2、2、20 μg·mLBgIGFBP4蛋白處理牦牛肝細(xì)胞，用不加目的蛋白的正常培養(yǎng)細(xì)胞作為對(duì)照組、不含細(xì)胞的培養(yǎng)液作為空白組，置于37 ℃培養(yǎng)24 h后，添加CCK8試劑檢測(cè)其吸光度值。再選擇增殖活性最佳的處理濃度2 μg·mLBgIGFBP4處理牦牛肝細(xì)胞24、48、72 h，同上設(shè)置對(duì)照組和空白組置于37 ℃培養(yǎng)，再檢測(cè)吸光度值。

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的牦牛肝細(xì)胞，每組3個(gè)重復(fù)。試驗(yàn)組用2 μg·mLBgIGFBP4蛋白處理細(xì)胞，用不加目的蛋白的正常培養(yǎng)細(xì)胞作為對(duì)照組，置于37 ℃培養(yǎng)1周。當(dāng)觀察到肉眼可見(jiàn)的集落時(shí)，終止培養(yǎng)。結(jié)晶紫染色具體操作步驟同參考文獻(xiàn)[20]。最后計(jì)算集落形成率(%)：集落形成率=(集落數(shù)/接種細(xì)胞數(shù))×100。

1.5 BgIGFBP4蛋白對(duì)牦牛肝細(xì)胞生長(zhǎng)類激素含量的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的牦牛肝細(xì)胞，每組3個(gè)重復(fù)。試驗(yàn)組用2 μg·mLBgIGFBP4蛋白處理細(xì)胞，用不加目的蛋白的正常培養(yǎng)細(xì)胞作為對(duì)照組。置于37 ℃培養(yǎng)24、48、72 h后，收集對(duì)照組和試驗(yàn)組中細(xì)胞上清，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定牦牛肝細(xì)胞生長(zhǎng)激素(growth hormone，GH)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的含量變化。

1.6 BgIGFBP4蛋白對(duì)牦牛肝細(xì)胞PI3K-Akt信號(hào)通路相關(guān)生長(zhǎng)因子表達(dá)的影響

將“1.5”中培養(yǎng)的細(xì)胞去上清，收集對(duì)照組和試驗(yàn)組中細(xì)胞。每孔加入1 mL RNAiso Plus，用細(xì)胞刮板刮下細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，合成cDNA保存?zhèn)溆?。?作為內(nèi)參基因，qRT-PCR引物詳見(jiàn)表1。擴(kuò)增體系為：模板1 μL，上、下游引物各0.8 μL，ddHO 2.2 μL，酶5.2 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s，Tm 20 s，72 ℃ 20 s，共39次循環(huán)；熔解曲線65～95 ℃每5 s增加0.5 ℃。

表1 牦?；蛞镄蛄?/p>

1.7 BgIGFBP4蛋白對(duì)小鼠生長(zhǎng)性能的影響

為探究BgIGFBP4蛋白對(duì)小鼠生長(zhǎng)性能的影響，取30日齡((18±1)g)健康雄性KM小鼠。飼養(yǎng)環(huán)境符合試驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境設(shè)施要求：溫度(23 ±3)℃，相對(duì)濕度(50±15)%。在飼養(yǎng)過(guò)程中，墊料、籠等器具均進(jìn)行高壓真空滅菌，墊料48 h更換一次，自由飲水。試驗(yàn)組每2 d灌喂100 μL 50 μg·mLBgIGFBP4蛋白，對(duì)照組用等量的0.9%生理鹽水進(jìn)行灌喂，每組40只，共80只。試驗(yàn)前進(jìn)行饑餓處理12 h，試驗(yàn)周期28 d。每天早晨記錄小鼠采食量，試驗(yàn)28 d時(shí)空腹12 h后測(cè)定小鼠的體重，斷頭處死后剖取小鼠心、肝、脾、肺、腎和小腸稱重。計(jì)算試驗(yàn)期間小鼠的平均日增重、平均日采食量、料重比及器官指數(shù)。

1.8 BgIGFBP4蛋白對(duì)小鼠血清生長(zhǎng)類激素含量的影響

為探究BgIGFBP4蛋白對(duì)小鼠血清生長(zhǎng)類激素含量的影響，在試驗(yàn)28 d時(shí)隨機(jī)取試驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠3只，禁食禁水12 h后眼球采血，室溫靜置30 min后3 000 r·min離心10 min，測(cè)定小鼠血清GH、胰島素(insulin，INS)、VEGF的含量變化。

1.9 BgIGFBP4蛋白對(duì)小鼠肝PI3K-Akt信號(hào)通路相關(guān)生長(zhǎng)因子表達(dá)的影響

為探究BgIGFBP4蛋白對(duì)小鼠肝PI3K-Akt信號(hào)通路相關(guān)生長(zhǎng)因子表達(dá)的影響，在試驗(yàn)28 d時(shí)隨機(jī)取試驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠3只，提取肝總RNA并合成cDNA。以作為內(nèi)參基因，qRT-PCR引物詳見(jiàn)表2，擴(kuò)增體系、擴(kuò)增程序同上。

表2 小鼠基因引物序列

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果以最低表達(dá)量的Ct值作為不同組織間差異定量分析的參照，采用2法進(jìn)行分析；以上各數(shù)據(jù)均通過(guò)SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素ANOVA分析，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，<0.01表示差異極顯著，<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 BgIGFBP4蛋白表達(dá)、純化及鑒定

將誘導(dǎo)得到的菌液煮沸后進(jìn)行SDS-PAGE，在0.25、0.5、1、1.5、2 mmol·LIPTG 條件下誘導(dǎo)12 h表達(dá)出大小約28.86 ku的BgIGFBP4蛋白(27.86 ku目的蛋白+1 ku標(biāo)簽蛋白,圖1A)。將誘導(dǎo)得到的BgIGFBP4蛋白通過(guò)Ni柱富集，Elution Buffer洗脫獲得純化的BgIGFBP4蛋白(圖1B)。蛋白定量結(jié)果顯示，各管蛋白濃度分別為441.40、286.47、274.93 μg·mL。His標(biāo)簽鑒定結(jié)果顯示有特異性條帶出現(xiàn)(圖1C)，進(jìn)一步表明純化得到的確為重組BgIGFBP4蛋白。

M.蛋白相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；K.pET28a空載體；C.未誘導(dǎo)；1～5.0.25、0.5、1、1.5、2 mmol·L-1 IPTG誘導(dǎo)；6～8.蛋白純化物；9～10.His鑒定

2.2 BgIGFBP4蛋白對(duì)牦牛肝細(xì)胞增殖活性及集落形成能力的影響

添加不同濃度BgIGFBP4蛋白均能促進(jìn)牦牛肝細(xì)胞的增殖，且在2 μg·mL時(shí)增殖活性最佳(圖2A)。用2 μg·mLBgIGFBP4蛋白處理牦牛肝細(xì)胞不同時(shí)間，也能促進(jìn)牦牛肝細(xì)胞的增殖，并隨時(shí)間增加而增加(圖2B)。與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組用2 μg·mLBgIGFBP4蛋白處理牦牛肝細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞集落形成率顯著升高(<0.05，圖3)。

A.不同濃度處理24 h；B.2 μg·mL-1 BgIGFBP4蛋白處理不同時(shí)間

a.對(duì)照組；b.試驗(yàn)組。*表示不同試驗(yàn)組之間差異顯著(P<0.05)；下同

2.3 BgIGFBP4蛋白對(duì)牦牛肝細(xì)胞生長(zhǎng)類激素含量的影響

牦牛肝細(xì)胞生長(zhǎng)類激素含量檢測(cè)結(jié)果顯示，2 μg·mL的BgIGFBP4蛋白處理牦牛肝細(xì)胞48、72 h時(shí)，均能使牦牛肝細(xì)胞上清GH、VEGF含量顯著升高(<0.05，圖4)。

圖4 BgIGFBP4蛋白對(duì)牦牛肝細(xì)胞生長(zhǎng)類激素指標(biāo)的影響

2.4 BgIGFBP4蛋白對(duì)牦牛肝細(xì)胞PI3K-Akt信號(hào)通路相關(guān)生長(zhǎng)因子表達(dá)的影響

PI3K-Akt信號(hào)通路相關(guān)生長(zhǎng)因子轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)結(jié)果顯示，2 μg·mLBgIGFBP4蛋白處理牦牛肝細(xì)胞24、48、72 h時(shí)，PI3K-Akt信號(hào)通路中細(xì)胞增殖相關(guān)基因2、1、3R1、1、1、3的轉(zhuǎn)錄水平均顯著高于對(duì)照組(<0.05，圖5)。

圖5 BgIGFBP4蛋白對(duì)牦牛肝細(xì)胞PI3K-Akt信號(hào)通路相關(guān)生長(zhǎng)因子表達(dá)的影響

2.5 BgIGFBP4蛋白對(duì)小鼠生長(zhǎng)性能的影響

與對(duì)照組相比，試驗(yàn)28 d時(shí)試驗(yàn)組平均日增重顯著增加(<0.05)；試驗(yàn)組平均日采食量增加，但與對(duì)照組無(wú)顯著差異；與對(duì)照組相比，試驗(yàn)28 d時(shí)試驗(yàn)組料重比顯著降低(<0.05，圖6A)。與對(duì)照組相比，肝、脾、肺、腎、小腸等的器官指數(shù)顯著增加(<0.05)；試驗(yàn)組心臟指數(shù)增加，但與對(duì)照組無(wú)顯著差異(圖6B)。

圖6 BgIGFBP4蛋白對(duì)小鼠生長(zhǎng)性能的影響

2.6 BgIGFBP4蛋白對(duì)小鼠血清生長(zhǎng)類激素含量的影響

小鼠血清生長(zhǎng)類激素含量檢測(cè)結(jié)果顯示，每?jī)商旃辔?00 μL 50 μg·mLBgIGFBP4蛋白，試驗(yàn)組中小鼠血清GH、INS、VEGF含量在28 d時(shí)均顯著高于對(duì)照組(<0.05，圖7)。

圖7 BgIGFBP4蛋白對(duì)小鼠血清生長(zhǎng)類激素指標(biāo)的影響

2.7 BgIGFBP4蛋白對(duì)小鼠肝PI3K-Akt信號(hào)通路相關(guān)生長(zhǎng)因子表達(dá)的影響

PI3K-Akt信號(hào)通路相關(guān)生長(zhǎng)因子轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)結(jié)果顯示：每2 d灌喂100 μL 50 μg·mLBgIGFBP4蛋白28 d時(shí)，PI3K-Akt信號(hào)通路中細(xì)胞增殖相關(guān)基因2、1、3R1、1、1、3基因轉(zhuǎn)錄水平均顯著高于對(duì)照組(<0.05，圖8)。

圖8 BgIGFBP4蛋白對(duì)小鼠肝PI3K-Akt信號(hào)通路相關(guān)生長(zhǎng)因子表達(dá)的影響

3 討 論

3.1 BgIGFBP4蛋白促進(jìn)牦牛肝細(xì)胞增殖

IGFBP4是IGF系統(tǒng)的調(diào)節(jié)器，對(duì)IGF誘導(dǎo)的細(xì)胞生長(zhǎng)產(chǎn)生刺激和抑制作用。IGFBP4可與同家族其他生長(zhǎng)因子通過(guò)協(xié)同作用參與諸多生物過(guò)程如肝的生長(zhǎng)發(fā)育等，在人類和動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用。IGFBP4的高表達(dá)能夠延緩血管內(nèi)皮細(xì)胞的衰老進(jìn)程，其外源性蛋白也能促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)祖細(xì)胞增殖分化、骨骼的形成、神經(jīng)干細(xì)胞的增殖，并使神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元方向分化。推測(cè)IGFBP4在mRNA及蛋白水平表達(dá)趨勢(shì)一致，均能促進(jìn)細(xì)胞增殖。本試驗(yàn)結(jié)果與上述研究結(jié)果一致，重組BgIGFBP4蛋白能促進(jìn)牦牛肝細(xì)胞的增殖。

GH、INS和VEGF是調(diào)節(jié)動(dòng)物生長(zhǎng)的主要激素與生長(zhǎng)因子，可促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷徙及激活，從而促進(jìn)機(jī)體生長(zhǎng)，并在胚胎發(fā)生發(fā)育、骨生成、創(chuàng)傷愈合中起著重要作用。外源性添加GH能顯著增加肝細(xì)胞IGFBP4的表達(dá)，且IGFBP4表達(dá)水平受GH活性改變的影響，推測(cè)IGFBP4與GH表達(dá)量呈正相關(guān)。并且IGFBP4可增強(qiáng)VEGF誘導(dǎo)的血管生成。本試驗(yàn)結(jié)果表明，BgIGFBP4蛋白可通過(guò)刺激牦牛肝細(xì)胞生長(zhǎng)相關(guān)激素GH、VEGF分泌，進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞的增殖活性與機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育。

PI3K-Akt信號(hào)通路作為受體信號(hào)向細(xì)胞內(nèi)傳導(dǎo)的重要途徑之一，能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖分化，促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成，是一種信號(hào)級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)。IGFBP4可通過(guò)激活PI3K-Akt信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞分化。PI3K-Akt信號(hào)通路也是胰島素效應(yīng)信號(hào)傳導(dǎo)的主要途徑，與胰島素相關(guān)因子的代謝效應(yīng)高度相關(guān)。IGFBPs信號(hào)系統(tǒng)激活酪氨酸激酶受體(ERBB2)，導(dǎo)致胰島素受體底物(IRS1)磷酸化，從而激活磷脂酰肌醇3激酶受體(PI3KR1)，使蛋白激酶(AKT1)絲氨酸殘基磷酸化，被激活的AKT1從質(zhì)膜上釋放出來(lái)，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)、線粒體和細(xì)胞核內(nèi)，磷酸化各種底物(RAF1、MAPK3)，啟動(dòng)下游信號(hào)聯(lián)級(jí)反應(yīng)，從而調(diào)節(jié)糖原合成、糖異生和葡萄糖吸收，引發(fā)細(xì)胞增殖分化等生物效應(yīng)。PDGF、Gab1等外源蛋白可通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K-Akt信號(hào)通路促進(jìn)人晶狀體上皮細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)血管生成。本試驗(yàn)結(jié)果與上述報(bào)道基因(2、1、3R1、1、1、3)一致，BgIGFBP4蛋白可促進(jìn)PI3K-Akt信號(hào)通路中基因的表達(dá)，從而促進(jìn)牦牛肝細(xì)胞增殖。

3.2 BgIGFBP4蛋白促進(jìn)小鼠生長(zhǎng)發(fā)育

IGFBP4作為動(dòng)物正常生長(zhǎng)發(fā)育的重要生長(zhǎng)因子，IGFBP4缺陷小鼠體質(zhì)量比正常動(dòng)物輕10%～15%。敲除4小鼠的成脂分化能力明顯減弱，胚胎發(fā)育遲緩，個(gè)體體型明顯縮小。前人構(gòu)建了4過(guò)表達(dá)小鼠模型和東方紅鰭豚4轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)模型，初步證實(shí)4可影響腦部、胚胎及成體發(fā)育。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，重組BgIGFBP4蛋白處理小鼠后，平均日增重顯著增加、料重比顯著降低，肝等器官指數(shù)顯著增加，血清GH等生長(zhǎng)類激素含量顯著升高，PI3K-Akt信號(hào)通路中生長(zhǎng)相關(guān)因子轉(zhuǎn)錄水平顯著升高(<0.05)，提示BgIGFBP4蛋白可通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K-Akt信號(hào)通路促進(jìn)小鼠生長(zhǎng)。

4 結(jié) 論

本研究成功構(gòu)建了pET-28a-BgIGFBP4原核表達(dá)載體，并純化獲得了BgIGFBP4蛋白。根據(jù)體內(nèi)外試驗(yàn)證實(shí)了重組BgIGFBP4蛋白可通過(guò)PI3K-Akt信號(hào)通路促進(jìn)牦牛肝細(xì)胞增殖，并在動(dòng)物水平驗(yàn)證了BgIGFBP4對(duì)小鼠生長(zhǎng)的促進(jìn)作用，為進(jìn)一步深入研究IGFBP4的功能及其作用機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。