利用全基因組選擇信號方法鑒別影響豬肉滴水損失的候選基因

陶 偉，侯黎明，王彬彬，劉 航，李開軍，尹彥鎮(zhèn)，郭 皓，牛培培，張總平，李 強(qiáng)，黃瑞華,4*，李平華,4*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)養(yǎng)豬研究所，南京 210095；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)淮安研究院，淮安 223001；3.淮安市淮陰新淮種豬場，淮安 223322；4.江蘇現(xiàn)代農(nóng)業(yè)(生豬)產(chǎn)業(yè)體系集成創(chuàng)新中心，南京 210095)

滴水損失(drip loss, DL)是評價(jià)豬肌肉品質(zhì)的重要經(jīng)濟(jì)性狀，它是指在豬只屠宰后，由于肌肉組織的生理狀態(tài)發(fā)生改變，肌肉束縛水能力下降，肌肉內(nèi)的水分受到重力作用自然緩慢滲出而造成的重量損失。過高的滴水損失不僅會使肉制品加工行業(yè)由于鮮肉重量減少而遭受直接的經(jīng)濟(jì)損失，而且也會影響消費(fèi)者購買欲望。如何改善豬肉的品質(zhì)，降低肌肉的滴水損失是養(yǎng)殖行業(yè)和肉制品加工行業(yè)共同面臨的挑戰(zhàn)。目前，我國受非洲豬瘟疫情影響，國內(nèi)各個(gè)省份之間的豬肉供應(yīng)從“調(diào)豬”向“調(diào)肉”的方向改變，這意味著未來豬胴體需經(jīng)歷長時(shí)間的運(yùn)輸才能到達(dá)消費(fèi)市場，這無疑將對豬胴體滴水損失性狀提出更高的要求。

滴水損失作為肉品質(zhì)評價(jià)系統(tǒng)的重要組成部分，主要由遺傳和環(huán)境因素調(diào)控。早期一些研究發(fā)現(xiàn)，滴水損失為中低等遺傳力數(shù)量性狀(h=0.08～0.30)。準(zhǔn)確的測定豬肉滴水損失性狀需要對豬進(jìn)行屠宰，測定代價(jià)高，并且受到屠宰工藝、測定方法、測定時(shí)間等多種因素影響，因此傳統(tǒng)育種方法很難高效改善滴水損失性狀。通過分子標(biāo)記輔助選擇和全基因組選擇技術(shù)，鑒別影響豬肉滴水損失的主效基因和因果位點(diǎn)，將會加快豬肉滴水損失性狀的遺傳育種進(jìn)程。

蘇淮豬是在新淮豬基礎(chǔ)上再導(dǎo)入大白豬血統(tǒng)，通過橫交、多世代選育而成，含淮豬血統(tǒng)25%，大白豬血統(tǒng)75%。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，蘇淮豬群體滴水損失性狀存在較大的變異，變異系數(shù)達(dá)到66.88%。因此，本研究利用蘇淮豬作為試驗(yàn)群體，鑒別影響豬群體滴水損失變異的關(guān)鍵基因。通過對高、低滴水損失組的蘇淮豬群體進(jìn)行80K SNP芯片分型，利用法和法進(jìn)行選擇信號檢測，篩選出受到選擇的SNP位點(diǎn)，結(jié)合對受選擇的代表性SNP在蘇淮豬全群中的關(guān)聯(lián)性驗(yàn)證，并通過對選擇信號周邊基因進(jìn)行功能注釋與富集分析，以期篩選出受到選擇的且與蘇淮豬滴水損失性狀相關(guān)的候選基因和位點(diǎn)，旨在為蘇淮豬肉品質(zhì)的改善提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物

本試驗(yàn)在江蘇省淮安市淮陰種豬場內(nèi)篩選478頭飼養(yǎng)管理?xiàng)l件和日糧相同、日齡相近((237.95±2.13)d)、體質(zhì)健康的蘇淮育肥豬, 其中閹公豬290頭，母豬188頭，在淮安市金源肉品中心分4個(gè)批次屠宰。屠宰前禁食24 h, 期間保持豬只自由飲水。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品采集 試驗(yàn)蘇淮豬擊暈放血后，燙毛，去頭、尾、蹄和內(nèi)臟(保留板油和腎)，稱量胴體重；剪取豬只右耳組織樣1份·頭，放入盛有75%乙醇的2 mL離心管中，注明耳號，-20 ℃保存；采集左半胴體倒數(shù)3～4根肋骨處的背最長肌肌肉樣品200 g左右，注明耳號，用于肌肉滴水損失的測定。

1.2.2 蘇淮豬滴水損失表型的測定 本試驗(yàn)參考國家農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)《NY/T 821—2019豬肌肉品質(zhì)測定技術(shù)規(guī)范》，采用吊袋法進(jìn)行蘇淮豬滴水損失表型的測定，具體方法參考文獻(xiàn)[19]。

1.2.3 根據(jù)滴水損失EBV挑選試驗(yàn)群體 本研究先利用Excel 2019軟件對蘇淮豬全群滴水損失表型數(shù)據(jù)進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)。再使用DMU軟件計(jì)算478頭蘇淮豬滴水損失的EBV，具體模型：

=+++++

式中，代表滴水損失表型的觀測值；代表性別的固定效應(yīng)；代表批次的固定效應(yīng)；代表蘇淮豬屠宰日齡，作為協(xié)變量；代表蘇淮豬的胴體重，作為協(xié)變量；為個(gè)體的加性遺傳效應(yīng)；為隨機(jī)殘差效應(yīng)。

根據(jù)滴水損失EBV將478頭蘇淮豬按照從大到小進(jìn)行排序，挑選高、低各10%的蘇淮豬個(gè)體(N=48)用于后續(xù)的芯片分型和選擇信號分析。

利用SPSS軟件對蘇淮豬試驗(yàn)群體內(nèi)高、低EBV兩組之間的育種值和滴水損失進(jìn)行單因素方差分析。

1.2.4 高、低滴水損失蘇淮豬基因型檢測 使用天根生物科技有限公司的基因組DNA提取試劑盒提取蘇淮豬耳組織樣品的DNA，質(zhì)檢合格后，使用基于Illumina平臺的GeneSeek公司開發(fā)的GGP 80K SNP芯片進(jìn)行檢測，獲得SNP分型數(shù)據(jù)。原始基因型數(shù)據(jù)以ped和map文件存儲。接著利用PLINK軟件對SNP進(jìn)行質(zhì)量控制。質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)：剔除非常染色體上的SNP，次等位基因頻率大于0.01，個(gè)體的SNP檢出率大于0.9。

1.2.5 基因型數(shù)據(jù)填充 由于進(jìn)行分析時(shí)需要所有的SNP都分型成功，因此本研究將質(zhì)控后的芯片數(shù)據(jù)里部分沒有分型成功的SNP位點(diǎn)進(jìn)行了填充，本研究對有缺失的基因型數(shù)據(jù)進(jìn)行填充時(shí)使用的Beagle軟件。

1.2.6 選擇信號檢測 按照Weir和Cockerham的統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行高、低滴水損失蘇淮豬群體間值的計(jì)算，利用vcftools軟件計(jì)算每個(gè)位點(diǎn)的值。接著利用R包qqman進(jìn)行繪圖，來展示全基因組水平上值的分布。

本研究將低滴水損失的蘇淮豬群體作為試驗(yàn)群體，使用selscan軟件進(jìn)行選擇信號的計(jì)算。然后將原始的值正態(tài)化處理后取絕對值，同時(shí)按從大到小的順序進(jìn)行排序。

根據(jù)Wright的研究，若群體值在0～0.05 之間，說明各亞群間不存在分化；若值在0.05～0.15之間，為中度分化；若值在0.15～0.25之間，則為高度分化。合并選擇信號分析結(jié)果后，取||值在前5%，且值≥0.15 的SNP位點(diǎn)作為受選擇位點(diǎn)。

1.2.7 候選基因檢測及功能注釋和富集分析 基于豬11.1版本參考基因組(Sscrofa 11.1)的位置信息使用Ensembl在線網(wǎng)站對受選擇的SNP位點(diǎn)上、下游各50 kb的區(qū)域進(jìn)行基因注釋，并使用NCBI和Genecard在線網(wǎng)站查找相關(guān)基因的功能。通過KOBAS 3.0在線數(shù)據(jù)庫對候選基因進(jìn)行GO和KEGG功能富集分析，分析內(nèi)容涵蓋了細(xì)胞組分(cellular component)、分子功能(molecular function)、生物學(xué)過程(biological process)。

1.2.8 影響豬滴水損失的QTL注釋 根據(jù)豬11.1版本參考基因組(Sscrofa 11.1)的位置信息，利用在線網(wǎng)站Animal QTL Database下載影響豬滴水損失的全部QTL信息。接著，與選擇信號顯著候選位點(diǎn)進(jìn)行比對。

1.2.9 受選擇的代表性SNP在蘇淮豬全群中的關(guān)聯(lián)性驗(yàn)證 本研究對3個(gè)位于候選基因內(nèi)含子上同時(shí)又位于QTL區(qū)域內(nèi)的SNPs位點(diǎn)進(jìn)行分型，通過一代測序進(jìn)行全群分型。利用SAS 9.4軟件將共有SNP位點(diǎn)基因型與滴水損失進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析，具體模型：

=+++++

式中，代表滴水損失表型的觀測值；代表性別的固定效應(yīng)；代表批次的固定效應(yīng)；代表蘇淮豬屠宰日齡，作為協(xié)變量；代表蘇淮豬的胴體重，作為協(xié)變量；為個(gè)體基因型的固定效應(yīng)；為隨機(jī)殘差效應(yīng)。以<0.05表示差異達(dá)到顯著水平，以<0.01表示差異達(dá)到極顯著水平。所得結(jié)果均以滴水損失表型的“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

2 結(jié) 果

2.1 蘇淮豬滴水損失表型的變異分析

本研究利用Excel 2019軟件對蘇淮豬群體滴水損失表型數(shù)據(jù)進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)后發(fā)現(xiàn),蘇淮豬群體滴水損失均值2.04%，群體內(nèi)存在較大表型變異，變異系數(shù)高達(dá)76.45%。

利用SPSS軟件進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果見表1，蘇淮豬試驗(yàn)群體內(nèi)高、低EBV兩組之間的育種值和滴水損失差異均極顯著(<0.01)。

表1 蘇淮豬群體內(nèi)高、低EBV組間滴水損失的比較分析

2.2 分別基于Fst和iHS方法得到的顯著選擇信號

首先分別進(jìn)行了基于和的選擇信號分析。使用selcsan軟件對質(zhì)控后的全基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，共得到48 344個(gè)標(biāo)記的值，取絕對值后使用R語言繪圖，以||值在前5%為閾值線，共有2 417個(gè)SNPs位于閾值線之上，這些SNPs主要分布在1、2、4、5、6、7、9、11、13、14、15、18號染色體上，其中||值最大的SNP位點(diǎn)位于13號染色體上，結(jié)果如圖1所示。接著，又使用vcftools軟件對質(zhì)控后的51 705個(gè)SNPs進(jìn)行計(jì)算，得到了高、低滴水損失蘇淮豬群體間值，并利用R語言進(jìn)行繪圖，共有1 597個(gè)SNPs的值大于0.15，這些SNPs主要分布在1、2、3、6、7、11、13號染色體上，其中值最大的SNP位點(diǎn)位于11號染色體上，結(jié)果如圖2所示。

圖1 低滴水損失蘇淮豬全基因組水平上的|iHS|分布

圖2 高、低滴水損失蘇淮豬組間全基因組水平上SNP的Fst分布

2.3 合并基于Fst和iHS方法得到的顯著選擇信號結(jié)果

本研究基于兩種選擇信號的檢測結(jié)果，選擇||值在前5%，同時(shí)值≥0.15的SNP位點(diǎn)作為達(dá)到顯著水平的受選擇位點(diǎn)，共計(jì)175個(gè)SNPs。由圖3可知，這些SNP位點(diǎn)分布在1、2、3、4、5、6、7、11、12、14、16號染色體上，其中主要分布在1、6、7、11號染色體上。

圖3 達(dá)到顯著水平的SNP位點(diǎn)在染色體上的分布

2.4 蘇淮豬基因組顯著選擇信號的候選基因注釋

本研究根據(jù)豬11.1版本參考基因組(Sscrofa 11.1)的位置信息，使用Ensembl在線網(wǎng)站對達(dá)到顯著水平的SNP位點(diǎn)進(jìn)行基因注釋，共獲得了73個(gè)基因。由于很多基因在豬上的報(bào)道和研究不多，本研究利用NCBI和Genecard在線網(wǎng)站查找人類直系同源基因的功能。同時(shí)，利用KOBAS 3.0在線數(shù)據(jù)庫對所有的候選基因進(jìn)行富集分析。如表2所示，通過富集分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，部分條目的生物學(xué)功能與肌肉發(fā)育以及細(xì)胞氧化應(yīng)激有關(guān)。

表2 候選基因富集分析結(jié)果

如表3所示，對選擇信號進(jìn)行基因注釋后，發(fā)現(xiàn)多個(gè)基因功能與肌動蛋白功能相關(guān)，如、、和1基因；其次還發(fā)現(xiàn)了1L1基因與細(xì)胞氧化應(yīng)激相關(guān)。

表3 與滴水損失相關(guān)的部分重要候選基因的位置和基因的功能

2.5 蘇淮豬受選擇位點(diǎn)與已報(bào)道的QTL的比較結(jié)果

本研究對蘇淮豬全基因組選擇信號分析鑒別的175個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行影響豬滴水損失的QTL注釋。結(jié)果如表4所示，通過注釋發(fā)現(xiàn)，共有27個(gè)SNPs分別分布在15個(gè)QTLs上，這些位點(diǎn)涉及到了13個(gè)基因，其中rs80930355、rs340037952位點(diǎn)分別位于與肌動蛋白結(jié)合有關(guān)的、基因的內(nèi)含子上，rs320624660位點(diǎn)位于與細(xì)胞氧化應(yīng)激相關(guān)的1L1基因的內(nèi)含子上。

表4 蘇淮豬全基因組選擇信號顯著位點(diǎn)的QTL注釋結(jié)果

2.6 蘇淮豬受選擇的代表性SNP與滴水損失的關(guān)聯(lián)性分析

本研究選擇與已報(bào)道的QTL區(qū)域重合且位于候選基因上的3個(gè)SNPs(rs80930355、rs340037952和rs320624660位點(diǎn))在蘇淮豬全群進(jìn)行基因分型。通過蘇淮豬全群滴水損失與3個(gè)SNPs關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)(表5)，rs340037952位點(diǎn)與蘇淮豬群體滴水損失存在顯著關(guān)聯(lián)(<0.05)，rs320624660位點(diǎn)與蘇淮豬群體滴水損失存在極顯著關(guān)聯(lián)(<0.01)。其中，對于rs320624660位點(diǎn)而言，AA基因型個(gè)體的滴水損失極顯著高于GG基因型個(gè)體(<0.01)，AG基因型個(gè)體的滴水損失顯著高于GG型個(gè)體(<0.05)。而rs80930355位點(diǎn)與滴水損失不存在顯著關(guān)聯(lián)(>0.05)。

表5 基因型與滴水損失的關(guān)聯(lián)性分析

3 討 論

3.1 蘇淮豬群體滴水損失變異

蘇淮豬含有75% 的大白豬血統(tǒng)和25% 的淮豬血統(tǒng)，并且在蘇淮豬長期的人工選育過程中會對背膘、日增重進(jìn)行選擇，因此會間接選擇包括滴水損失在內(nèi)的肉質(zhì)性狀。但是由于蘇淮豬基因組包含來自大白豬的基因片段和淮豬的基因片段，這造成了蘇淮豬群體內(nèi)滴水損失性狀可能會存在較大變異。本研究發(fā)現(xiàn)，蘇淮豬滴水損失變異很大，也印證了這一判斷。因此，本研究使用蘇淮豬作為試驗(yàn)動物，來鑒別影響豬滴水損失變異的候選基因。本研究基于蘇淮豬高密度芯片數(shù)據(jù)，采用和兩種選擇信號方法合并分析的方式對蘇淮豬進(jìn)行全基因組檢測，鑒別影響豬滴水損失的關(guān)鍵變異位點(diǎn)和基因。

由于肌肉滴水損失表型受眾多且復(fù)雜的因素影響，如運(yùn)輸方式、屠宰前的擊暈方式、環(huán)境溫度等都會影響滴水損失表型的測定，這會對試驗(yàn)帶來一些不可避免的誤差，以至于影響性狀表型的準(zhǔn)確性和育種效率，因此本研究控制運(yùn)輸方式和屠宰前的擊暈方式一致。而且隨著數(shù)量遺傳學(xué)理論的發(fā)展，育種學(xué)家借助一定的統(tǒng)計(jì)方法將性狀的表型值進(jìn)行剖分，并從中估計(jì)出可以真實(shí)遺傳的部分，即育種值。因此，相較于豬早期育種時(shí)根據(jù)性狀表型值的高低來選擇試驗(yàn)群體的方法，基于育種值高低選擇試驗(yàn)群體的方法可以更好地提高育種的準(zhǔn)確性和效率。本研究基于EBV選擇高、低滴水損失組各48個(gè)個(gè)體進(jìn)行選擇信號檢測。通過研究發(fā)現(xiàn)，高、低EBV組蘇淮豬的滴水損失存在極顯著差異，進(jìn)一步說明了本試驗(yàn)樣品選擇的可靠性。

3.2 影響豬滴水損失性狀的受選擇基因分析

本研究使用兩種單一的選擇信號方法分別鑒別到了很多受選擇的位點(diǎn)，其中單一選擇信號方法得到的最顯著SNP位點(diǎn)上、下游各50 kb的區(qū)域沒有發(fā)現(xiàn)與已報(bào)道的影響豬滴水損失的QTL區(qū)域重合，并且附近區(qū)域通過基因富集也沒有發(fā)現(xiàn)功能上可能與滴水損失有關(guān)的基因。本研究為了避免單個(gè)選擇信號檢測出現(xiàn)假陽性，選擇對兩種選擇信號的結(jié)果進(jìn)行合并分析的方法，以此來增加結(jié)果的可靠性。合并分析后，共發(fā)現(xiàn)了175個(gè)達(dá)到顯著水平的SNPs，這些顯著SNPs共涉及到73個(gè)基因，通過功能富集分析發(fā)現(xiàn)，許多基因與肌動蛋白、氧化應(yīng)激、蛋白質(zhì)磷酸化以及脂質(zhì)合成有關(guān)。同時(shí)在175個(gè)顯著SNPs中有27個(gè)SNPs位于15個(gè)與豬滴水損失相關(guān)的QTL上，并且涉及到了、、1L1基因，這些基因在功能上與肌動蛋白結(jié)合和細(xì)胞氧化應(yīng)激相關(guān)。對上述3個(gè)分別位于、、1L1基因內(nèi)含子上的rs80930355、rs340037952和rs320624660位點(diǎn)在蘇淮豬全群內(nèi)進(jìn)行基因分型后，并與滴水損失進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，rs340037952和rs320624660位點(diǎn)與蘇淮豬群體的滴水損失存在顯著關(guān)聯(lián)，因此可以做為蘇淮豬滴水損失選育提升的潛在分子標(biāo)記。另外，發(fā)現(xiàn)有2個(gè)基因(3K4、3)富集到了MAPK信號通路上，MAPK信號通路是已經(jīng)報(bào)道過的在骨骼肌中產(chǎn)生氧化應(yīng)激的通路之一。然而結(jié)果顯示，富集到的與細(xì)胞氧化應(yīng)激相關(guān)的條目以及MAPK信號通路并不顯著，這可能是由于基因數(shù)目太少造成的。

動物屠宰后的一系列生理生化反應(yīng)都會導(dǎo)致肌肉的滴水損失增加。目前，研究表明，肌肉靜電荷、肌肉收縮(肌動蛋白和肌球蛋白相互作用)、蛋白質(zhì)降解以及鈣蛋白主要原酶系統(tǒng)以及氧化反應(yīng)等均會引起宰后滴水損失的改變。

鄧婕等和趙海洲等的研究顯示，基因編碼的蛋白是一個(gè) E3 泛素連接酶，它通過泛素-蛋白酶體系統(tǒng)來降解異常折疊蛋白，參與氧化應(yīng)激及線粒體功能調(diào)控等多種途徑，發(fā)揮保護(hù)功能；Neisch和Fehon以及Maniti等的研究表明，()為細(xì)胞膜-細(xì)胞骨架連接蛋白，即能參與細(xì)胞的生長和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，又可接受胞外信號，使細(xì)胞骨架重排；Lundquist等認(rèn)為，編碼的蛋白是與血清反應(yīng)因子(SRF)轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)聯(lián)的轉(zhuǎn)錄輔激活子，在發(fā)育、形態(tài)發(fā)生和細(xì)胞遷移過程中控制調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架基因的表達(dá)，SRF-MRTFA復(fù)合物活性對Rho-GTPase誘導(dǎo)的細(xì)胞球狀肌動蛋白(G-actin)濃度變化作出反應(yīng)，從而將細(xì)胞骨架基因表達(dá)與細(xì)胞骨架動力學(xué)耦合，MRTFA通過RPEL重復(fù)序列與G-肌動蛋白結(jié)合，調(diào)節(jié)MRTFA-SRF復(fù)合物的活性；Janji等認(rèn)為，L-質(zhì)體蛋白是是肌動蛋白絲交聯(lián)劑大家族的成員之一，L-質(zhì)體蛋白的磷酸化將蛋白質(zhì)從低活性狀態(tài)轉(zhuǎn)換為高活性狀態(tài)，磷酸化L-質(zhì)體蛋白可能作為一個(gè)整合的信號控制組裝肌動蛋白細(xì)胞骨架和細(xì)胞運(yùn)動的三維空間。因此，這些與肌動蛋白相關(guān)的基因可以作為影響滴水損失的候選基因。Westhofen等認(rèn)為，1L1與細(xì)胞抵抗自由基有關(guān)，1L1基因敲除后導(dǎo)致對氧化應(yīng)激更高的敏感性和細(xì)胞活力降低；該基因編碼的蛋白功能都與細(xì)胞氧化應(yīng)激相關(guān)，而屠宰后肌肉的氧化反應(yīng)是造成肌肉滴水損失增加的主要因素，因此也可以作為影響蘇淮豬滴水損失的候選基因。

4 結(jié) 論

綜上所述，本研究使用與兩種互補(bǔ)的檢測方法在高、低滴水損失蘇淮豬群體中找到175個(gè)受選擇的SNPs，并依此鑒定到影響蘇淮豬滴水損失的73個(gè)受選擇的基因，通過功能注釋發(fā)現(xiàn)，有5個(gè)基因是滴水損失的功能候選基因。其中4 個(gè)候選基因(、、、1)與肌肉中的肌動蛋白有關(guān)；而1L1基因與氧化應(yīng)激有關(guān)。同時(shí)，還分別在和1L1基因上鑒定到與蘇淮豬群體的滴水損失存在顯著關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)：rs340037952和rs320624660。上述基因和SNPs的檢測為未來解析豬滴水損失的遺傳機(jī)制以及蘇淮豬肉質(zhì)的持續(xù)選育提供了參考依據(jù)。