HuR的功能及其對肌肉生長發(fā)育的調(diào)控作用

孫嚴金，薛亞男，仲 濤，王林杰，李 利，張紅平，占思遠

(四川農(nóng)業(yè)大學 畜禽遺傳資源發(fā)掘與創(chuàng)新利用四川省重點實驗室，成都 611130)

肌肉組織是動物機體的重要組成部分，主要包括骨骼肌、心肌和平滑肌，其中骨骼肌約占成年動物體重的40%～60%。肌肉的生長發(fā)育是一個極其復雜和精密的過程，受到許多細胞因子和轉錄因子構成的調(diào)控網(wǎng)絡共同作用，其中包括生肌調(diào)節(jié)因子(myogenic regulatory factors, MRFs)家族、肌細胞增強因子2(myocyte enhancer factor 2,MEF2)家族和轉錄調(diào)控因子Pax(paired box)家族。近些年的研究表明，非編碼RNA，包括長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA, lncRNA)、微小RNA(microRNA, miRNA)和環(huán)狀RNA(circular RNA, circRNA)等，參與了肌肉生成的調(diào)控網(wǎng)絡。RNA結合蛋白(RNA binding proteins,RBPs)作為細胞生命活動中的重要成員，通過與編碼和非編碼RNA互作，也參與了肌肉生長發(fā)育的調(diào)控過程。

RNA結合蛋白是細胞中一類重要的蛋白質(zhì)，它們通過識別特殊的RNA結合域與RNA互作，廣泛參與到RNA剪切、轉運、序列編輯、胞內(nèi)定位及翻譯控制等多個轉錄后調(diào)控過程中，在基因調(diào)控過程中扮演著關鍵作用。RNA結合蛋白的結構域包括K同源基序(K homology, KH)、RNA識別基序(RNA recognition motif, RRM)和鋅指結構域(zinc finger domain, ZNF)等。研究表明，RNA結合蛋白通過特異性結合靶mRNA分子3′非翻譯區(qū)(UTRs)的順式作用元件，調(diào)控靶基因的表達水平，進而參與組織發(fā)育、細胞周期及疾病發(fā)生等生物學過程。作為RNA結合蛋白家族的重要成員，HuR(human antigen R)蛋白在機體內(nèi)廣泛表達，通過調(diào)控靶基因mRNA的穩(wěn)定性或翻譯效率影響靶基因的表達水平，從而參與調(diào)控細胞的生命活動。本文結合近年來RNA結合蛋白HuR的相關研究，主要綜述了HuR的生物學特性、主要功能與作用方式及其在肌肉生長發(fā)育和相關疾病中的調(diào)控作用，同時對RNA結合蛋白HuR的今后研究方向進行了展望，以期讓相關科研人員更全面地了解HuR蛋白的研究進展，為進一步研究其在肌肉生長發(fā)育調(diào)控中的作用提供有力支撐。

1 HuR的生物學特性

RNA結合蛋白HuR是胚胎致死異常視覺(embryonic lethal abnormal vision, ELAV)基因家族成員之一，又被稱為類胚胎致死性異常視覺基因1(ELAV1)。ELAV家族包括HuB、HuC、HuD和HuR 4個成員。HuB、HuC和HuD主要在神經(jīng)組織中表達，而HuR則是在機體各組織中普遍表達。HuR蛋白編碼基因在人類上位于第19號染色體，小鼠上位于第8號染色體，山羊上位于第7號染色體，編碼的蛋白均由326個氨基酸組成。HuR蛋白含有3個經(jīng)典的RNA識別結構域，其中RRM1和RRM2結構域可以特異性的結合AU富含元件(AU-rich element, ARE)。RRM3對于穩(wěn)定RNA-蛋白質(zhì)復合物以及介導蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用非常重要。RRM2和RRM3之間還含有一個介導HuR進行核質(zhì)穿梭的鉸鏈區(qū)(HuR nuclear shuttle, HNS)，HuR的HNS區(qū)域含有核定位信號(nuclear localization sequence, NLS)和核輸出信號(nuclear export signal, NES)，HuR主要存在于細胞核中，當細胞受到刺激時，HuR的鉸鏈區(qū)會發(fā)生不同的蛋白修飾，從而促進HuR從細胞核穿梭到細胞質(zhì)中。

2 HuR的功能與作用方式

大量研究表明，HuR作為基因轉錄后水平的重要調(diào)控因子，通過與靶mRNA分子3′末端非翻譯區(qū)的ARE元件(AU rich element)結合來發(fā)揮其生物學功能，通常是通過提高靶mRNA的穩(wěn)定性或翻譯效率而上調(diào)靶基因在細胞中的表達水平。此外有研究表明，HuR蛋白也可以與非編碼RNA(如miRNA、lncRNA)或其它RNA結合蛋白相互作用，進而參與調(diào)控RNA剪接加工、多聚腺苷酸化形成、細胞凋亡等生命活動，以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展等過程(圖1)。

代表RNA結合蛋白HuR

2.1 HuR調(diào)控mRNA前體的剪接

研究發(fā)現(xiàn)，HuR通過調(diào)控剪接因子對mRNA前體內(nèi)含子或外顯子上剪接位點的識別，進而調(diào)節(jié)前體mRNA的剪接模式。研究人員發(fā)現(xiàn)，TIA-1(T cell intracellular antigen 1)/TIAR(TIA1-related)蛋白與位于降鈣素(calcitonin gene-related peptide, CGPR)外顯子下游富含U的序列相互作用能夠促進降鈣素非特異性形成。HuR能夠阻斷拼接因子TIA-1或TIAR的活性，并與其競爭性地結合到內(nèi)含子的U富集區(qū)域，促使CGRP mRNA前體非神經(jīng)元外顯子4發(fā)生跳躍，致使正常應該產(chǎn)生的肽激素被神經(jīng)傳遞素所代替。HuR通過改變SIRT1外顯子8周圍組蛋白修飾模式，使RNA聚合酶Ⅱ(RNA polymeraseⅡ, RNAPⅡ)的延伸速率加快，促進SIRT1外顯子8的切除，進而增加缺失SIRT1外顯子8的1 mRNA的表達，而TIA-1/TIAL1通過改變外顯子周圍組蛋白修飾模式，使RNAPⅡ的延伸速率減慢，促進SIRT1外顯子8的保留，使缺失SIRT1外顯子8的1 mRNA的表達降低。此外有研究表明，HuR蛋白還能夠發(fā)揮剪接增強子作用，結合HuD外顯子6下游的兩個AU元件，促進mRNA外顯子6插入。

2.2 HuR影響多聚腺苷酸化的形成

研究證明，HuR能夠選擇性結合到靶mRNA的U富集區(qū)，影響靶mRNA的poly(A)形成，進而影響靶mRNA多聚腺苷酸化的修飾過程。多聚腺苷酸化需要兩步反應，包括裂解和新生成的3′端上加poly(A)尾巴。這兩步需要切割刺激因子(cleavage stimulation factor, CstF)和多聚腺苷酸特異性因子(cleavage and polyadenylation specificity factor, CPSF)的參與，而HuR蛋白能夠與多聚腺苷酸化這兩個特異性因子(CstF、CPSF)競爭性結合富含U的序列，從而阻斷了mRNA的多聚腺苷酸化形成。

2.3 HuR調(diào)控mRNA的穩(wěn)定性

研究發(fā)現(xiàn)，在人的心肌細胞中，HuR蛋白能夠識別并結合2C基因的ARE序列，增加其mRNA穩(wěn)定性，從而促進了心臟鈉通道基因(cardiac sodium channel gene,5A)的轉錄。另外，HuR還可以通過與miRNA、lncRNA或circRNA相互作用調(diào)控靶mRNA的穩(wěn)定性。環(huán)狀RNA circE2F2(circRNA transcription factor 2, circE2F2)與HuR蛋白結合能夠促進HuR結合在E2F2的3′UTR，進而增加E2F2的mRNA穩(wěn)定性。研究表明，circDLC1可以與MMP1競爭結合HuR，通過降低MMP1的穩(wěn)定性，進而抑制MMP1的表達，最終抑制肝癌細胞的增殖和遷移。食管鱗狀細胞癌相關研究發(fā)現(xiàn)，HuR通過與miR-4319競爭性結合SEMA4D，增強SEMA4D的穩(wěn)定性，從而調(diào)節(jié)食管癌細胞的增殖、凋亡和遷移。當HOTAIR泛素化底物的水平較低時，HuR會優(yōu)先與HOTAIR結合，并通過募集let-7-Ago2(argonaute RISC catalytic component 2)復合物來降低HOTAIR的穩(wěn)定性。此外，HuR自身的蛋白修飾也可以影響靶mRNA的穩(wěn)定性。HuR蛋白的磷酸化能夠影響其對應激蛋白1(stress-response protein)mRNA穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)，細胞周期檢查點激酶(checkpoint kinase 2, Chk2)對HuR進行磷酸化的修飾，抑制了HuR與1 mRNA的結合。在人類肝細胞癌的研究中發(fā)現(xiàn)，ADORA2A-AS1與肌動蛋白束蛋白(fascin actin-bundling protein 1, FSCN1)轉錄物競爭性結合HuR，通過影響FSCN1的穩(wěn)定性來降低FSCN1的表達，從而阻斷了AKT通路的激活，最終抑制腫瘤的發(fā)生。此外有研究表明，LINC01119能夠與HuR相互作用，形成LINC01119-HuR復合物，進而與腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,)mRNA結合，增強其穩(wěn)定性，提高BDNF在轉錄和蛋白水平的表達，促進神經(jīng)性疼痛(neuropathic pain, NP)的發(fā)生。研究人員發(fā)現(xiàn)，LINC00668通過招募HuR增強蛋白激酶N2(protein kinase n2，PKN2)的穩(wěn)定性，從而促進胃癌的轉移。

2.4 HuR調(diào)控mRNA的翻譯

有研究表明，HuR通過結合靶mRNA的3′UTR富含AU的ARE區(qū)，調(diào)節(jié)靶mRNA的翻譯效率，進而參與細胞生命活動。在人類小腸上皮細胞中，HuR可以結合微囊蛋白1(caveolin-1, Cav-1)的3′UTR區(qū)調(diào)節(jié)Cav-1 mRNA的翻譯，從而促進早期小腸上皮的恢復。另外研究發(fā)現(xiàn)，HuR也可以與靶基因的5′UTR結合來調(diào)控翻譯。HuR可特異性地結合到細胞周期素依賴性激酶抑制因子p27mRNA的5′UTR序列中的內(nèi)部核糖體進入位點(internal ribosome entry site, IRES)，抑制p27的翻譯。相關研究發(fā)現(xiàn)，真核細胞翻譯起始因子(eukaryotic translation initiation factor 3, EIF3)與HuR相互作用結合在1 mRNA的3′UTR上，正向調(diào)節(jié)1 mRNA的翻譯，從而調(diào)控細胞周期進程。此外有研究表明，HuR可以招募miRNA let-7(RNA-induced silencing complex, RISC)結合在-mRNA的3′UTR，進而抑制-mRNA下調(diào)。

研究發(fā)現(xiàn)，HuR還可以與非編碼RNA互作，調(diào)控靶mRNA的翻譯。小鼠上研究發(fā)現(xiàn)，過表達的miR-195能夠與HuR競爭性結合雙皮質(zhì)素樣激酶1(double cortin-like kinase 1, DCLK1)的3′UTR并抑制DCLK1的翻譯，進而破壞腸絨毛細胞的功能。HuR也能與程序性細胞死亡因子4(programmed cell death 4, PDCD4)的3′UTR相互作用，阻止miR-21介導的PDCD4翻譯抑制。Abdelmohsen等研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)狀多聚腺苷酸結合蛋白核1(circle poly(A)binding protein nuclear 1, PABPN1)能夠與HuR蛋白結合，并抑制HuR蛋白與1基因mRNA的結合能力，從而抑制其翻譯。在肺癌研究中發(fā)現(xiàn)，circBACH1通過促進HuR的核質(zhì)易位，進而抑制p27的翻譯，促進肝癌細胞增殖。此外，在人類癌癥細胞的研究中發(fā)現(xiàn)，circAGO2能夠與HuR蛋白相互作用，促進其在促癌相關靶基因3′UTR的富集，從而減少HuR與AGO2的結合，抑制AGO2/miRNA介導的腫瘤進展相關的基因沉默。在小鼠研究中發(fā)現(xiàn)，CircPABPN1競爭性結合HuR，阻斷了其與ATG16L1的結合，抑制ATG16L翻譯，從而調(diào)節(jié)腸上皮細胞自噬。

3 HuR調(diào)控肌肉生長發(fā)育及相關疾病的研究

3.1 HuR通過影響mRNA的穩(wěn)定性參與調(diào)控肌生成

近些年來的研究表明，RNA結合蛋白HuR能夠與編碼或非編碼RNA相互作用參與肌肉生長發(fā)育以及肌肉疾病的發(fā)生，其中研究較為廣泛的作用機制是HuR通過調(diào)節(jié)靶基因mRNA穩(wěn)定性參與肌肉生長發(fā)育的調(diào)控(表1)。在分化的肌肉細胞中，RNA結合蛋白HuR能夠識別結合肌源性調(diào)節(jié)因子(p21、MyoD、MyoG和MyHC)的3′UTR的ARE序列，增加其mRNA穩(wěn)定水平，進而促進肌肉分化。另外，研究人員還發(fā)現(xiàn)，HuR蛋白可以結合并穩(wěn)定成肌細胞增殖的關鍵細胞周期控制因子CCND1，而Pitx2(paired like homeodomain 2)介導了HuR和CCND1之間的相互結合作用，在肌肉分化過程中，Pitx2被磷酸化，復合體Pitx2/HuR/CCND1解離，導致CCND1不穩(wěn)定，引起細胞周期停滯，最終促進肌肉分化。此外有研究表明，在未分化的肌肉細胞中，HuR位于細胞核中，當肌肉細胞分化開始后，細胞質(zhì)中的HuR增加，當細胞分化結束后，HuR重新回到細胞核，HuR在細胞核質(zhì)的表達量的變化與肌源性調(diào)節(jié)因子的核質(zhì)表達量相一致，表明HuR的核質(zhì)穿梭與肌生成的調(diào)控密切相關。在成肌細胞融合過程中，半胱天冬酶發(fā)揮作用，使10%～15%的HuR被裂解為HuR-CP1(HuR-cleavage product 1, 24 ku)和HuR-CP2(HuR-cleavage product 2, 8 ku)兩個片段。在小鼠C2C12成肌細胞分化過程中，HuR-CP1表達增加，并與HuR導入因子轉運蛋白-2(HuR-import factor transportin-2,TRN2)結合，阻止TRN2介導完整的HuR分子進入細胞核，從而增加細胞質(zhì)中HuR表達量，通過調(diào)節(jié)成肌基因mRNA的穩(wěn)定性來促進肌肉生成。

表1 RNA結合蛋白調(diào)控肌肉生長發(fā)育的靶基因及作用方式

Lv等在小鼠、豬和人中鑒定了一個新的促進肌肉生長的lncRNA——lncMGPF(lncRNA muscle growth promoting factor)，該lncRNA主要通過兩方面調(diào)控肌生成，一是作為miR-135a-5p分子海綿，增加肌細胞增強因子2C(MEF2C)表達；二是通過調(diào)控HuR蛋白裂解促進HuR由細胞核到細胞質(zhì)的遷移，增強HuR介導的肌源性調(diào)節(jié)基因、等mRNA的穩(wěn)定性，進而提高肌細胞分化能力。有研究還發(fā)現(xiàn)，lncRNA-OIP5-AS1能夠結合肌細胞增強因子MEF2C的3′UTR區(qū)域，增強MEF2C的穩(wěn)定性，從而促進MEF2C的表達，其作用方式是，lncRNA-OIP5-AS1作為一個“分子支架”，招募RNA結合蛋白HuR結合到MEF2C的3′UTR，促進MEF2C的表達，從而促進成肌分化過程。此外，有研究表明HuR還可通過與其它RNA結合蛋白相互作用參與調(diào)控肌肉生長發(fā)育。在肌肉發(fā)生早期，HuR和KSRP(KH-type splicing regulatory protein)以復合體的形式被募集到細胞周期啟動子核磷蛋白(nucleophosmin,)mRNA的3′UTR區(qū)域，而HuR/KSRP復合體可以招募兩種核糖核酸酶，多聚腺苷酸特異性核糖核酸酶(poly(A)specific ribonuclease, PARN)和EXOSC5(exosome component 5)，降低mRNA的穩(wěn)定性，進而促進肌肉纖維的形成。Legnini等研究發(fā)現(xiàn)，Linc-MD1作為miR-133b的宿主轉錄本，其在肌肉分化早期階段表達。一方面，Linc-MD1能夠與HuR蛋白結合并抑制Drosha酶作用，進而抑制miR-133合成來促進Linc-MD1的積累。另一方面，Linc-MD1又能作為miR-133的分子海綿，正向調(diào)控HuR蛋白的表達。此外，HuR蛋白可以與募集的miRNA協(xié)同來加強Linc-MD1的分子海綿活性，HuR和Linc-MD1之間形成的正向調(diào)控回路最終促進了肌肉的分化。

3.2 HuR通過解除miRNA介導的靶基因翻譯抑制參與調(diào)控肌生成

RNA結合蛋白HuR除了調(diào)節(jié)mRNA的穩(wěn)定性，還可以通過解除miRNA介導的靶基因翻譯抑制參與調(diào)控肌生成。研究發(fā)現(xiàn)，miR-1192可以結合到高遷移率族蛋白1(high mobility group box 1,1)mRNA的3′UTR，抑制HMGB1的翻譯進而阻止肌生成過程，而HuR蛋白可以靶向結合HMGB1 3′UTR的miRNA結合位點鄰近區(qū)域，阻止AGO2/miR-1192復合物的形成，從而解除miR-1192介導的翻譯抑制，促進了肌生成。研究表明，在癌癥動物模型中，骨骼肌組織中STAT3(signal transducer and activator of transcription 3)的異常激活是導致肌肉萎縮的原因之一，而在炎癥誘導的肌肉萎縮過程中，研究人員發(fā)現(xiàn)，HuR蛋白可以結合STAT3的3′UTR富含U的序列，阻止miR-330介導的STAT3翻譯抑制，促進STAT3蛋白質(zhì)的翻譯，影響肌肉的發(fā)育。

3.3 HuR調(diào)控肌肉發(fā)育相關疾病

研究發(fā)現(xiàn)，RNA結合蛋白HuR還參與肌肉發(fā)育相關疾病的調(diào)節(jié)過程，包括先天性肌強直綜合征和肌肉萎縮等。有研究表明，Q膠原蛋白(cooh-terminal collagen Q, COLQ)的突變會導致先天性肌強直綜合征并伴隨乙酰膽堿酯酶的缺失，而HuR在COLQ突變引起的先天性肌強直綜合征中，起著穩(wěn)定乙酰膽堿酯酶的作用，具體機制是當Q膠原蛋白缺失后，HuR能夠識別并結合乙酰膽堿受體亞單位的3′UTR，增加其穩(wěn)定性，促進其表達。另外研究發(fā)現(xiàn)，HuR蛋白參與調(diào)控由癌癥惡病質(zhì)引起的肌肉萎縮，HuR特異性敲除可以促進小鼠Ⅰ型纖維的富集，進而使其免受癌癥誘導的肌肉萎縮，過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子-1(peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1, PGC-1)是過氧化物酶體增殖物激活受體PPARγ(peroxisome proliferator-activated receptor γ, PPARγ)的轉錄共激活因子，HuR通過與mRNA衰減因子KSRP互作調(diào)節(jié)-1 mRNA的穩(wěn)定性，降低PGC-1的表達，進而抑制Ⅰ型肌纖維的形成，促進Ⅱ型肌纖維的形成，表明HuR可以通過促進糖酵解型肌纖維的形成，參與調(diào)節(jié)骨骼肌纖維類型。多聚腺苷酸結合蛋白核1(polyadenylate binding protein nuclear 1,1)基因第一外顯子突變能夠?qū)е录∪馓禺愋约膊　垩市图I養(yǎng)不良(oculopharyngeal muscular dystrophy, OPMD)，研究人員利用小鼠體內(nèi)外模型研究發(fā)現(xiàn)，HuR蛋白能夠識別并結合PABPN1 3′UTR的ARE序列，負向調(diào)控PABPN1的mRNA與蛋白水平，這一結果為以后研究OPMD治療策略提供了參考。

4 展 望

近年來，RNA結合蛋白與非編碼RNA互作調(diào)控肌肉生長發(fā)育成為肌肉生物學研究新的焦點之一，作為機體內(nèi)表達最廣泛的RNA結合蛋白，HuR的生物學功能及在肌生成與肌肉疾病發(fā)生過程中的作用機制也逐漸被報道，其主要通過影響靶mRNA的穩(wěn)定性和翻譯參與調(diào)控肌肉生長發(fā)育及肌肉疾病的發(fā)生。但是，目前關于HuR的功能研究主要集中在模式動物上，畜禽動物上HuR的功能和作用機制尚未闡明。近些年，隨著功能性非編碼RNA不斷被發(fā)掘，RNA結合蛋白和非編碼RNA互作的調(diào)控機制研究也會越來越多。通過開展RNA結合蛋白及其與非編碼RNA互作調(diào)控肌肉生長發(fā)育的相關研究，能夠進一步完善肌肉生成分子調(diào)控網(wǎng)絡，深化對肌肉生長發(fā)育潛在分子機制的認識，并可能為肌肉發(fā)育相關疾病的治療提供新的思路和應對策略。