檢測綿羊源愛知病毒D型熒光RT-PCR方法的建立和應用

阿比克哈莫，余忠華，楊 晨，景志忠，湯 承*

(1.中國農業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所 家畜疫病病原生物學國家重點實驗室 農業(yè)部獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點實驗室，蘭州730046；2.阿壩藏族羌族自治州動物科學技術研究所，紅原624400；3.西南民族大學畜牧獸醫(yī)學院，成都610041)

嵴病毒(Kobuvirus, KoV)屬于小RNA病毒科嵴病毒屬，目前,KoV有Aichivirus A～Aichivirus F 6個不同的種以及3個未分類的KoV，研究表明，Aichivirus A成員人愛知病毒、Aichivirus B成員牛嵴病毒和Aichivirus C成員豬嵴病毒為腹瀉相關病原。

目前，在綿羊中鑒定了2個種的KoVs：Aichivirus B和Aichivirus D，綿羊嵴病毒(ovine kobuvirus, OKoV)早期被歸納為Aichivirus B成員，2010年，首次在匈牙利健康綿羊的糞便樣本中檢測到Aichivirus B OKoV；隨后在巴西健康、腹瀉綿羊的糞便樣本和愛爾蘭綿羊腸系膜淋巴結中都檢測到Aichivirus B OKoV。本研究前期在四川腹瀉綿羊糞便樣本中獲得了一個完整的OKoV基因組，研究發(fā)現(xiàn)該基因組與牛源Aichivirus D毒株基因組遺傳關系最近，證明是Aichivirus D的一個成員，表明宿主綿羊可能存在多種成員的KoVs病毒。

GenBank基因庫目前只錄入了2個OKoV基因組序列，其中，1個來自匈牙利毒株(GenBank登錄號為GU245693)，系Aichivirus B的成員，另外一個來自本實驗室前期發(fā)現(xiàn)的中國毒株(GenBank登錄號為MW296158)，系Aichivirus D的成員。KoV基因組主要由5′端非編碼區(qū)(5′UTR)、開放閱讀框(ORF)以及3′端非編碼區(qū)(3′UTR)構成。

目前，常用的KoV RT-PCR檢測方法的靶基因均為3D。關于OKoV的分子檢測方法只有一篇RT-PCR方法的報道，本研究旨在根據(jù)我國綿羊源Aichivirus D最保守的3D基因序列設計引物，建立特異性檢測綿羊源Aichivirus D的熒光RT-PCR方法，調查分析該病毒在國內的流行情況及其3D基因的分子特征。

1 材料與方法

1.1 病毒(菌)株核酸和臨床樣本

綿羊源Aichivirus D、山羊嵴病毒、綿羊腸道病毒、A群羊輪狀病毒、羊星狀病毒、牛冠狀病毒、牛星狀病毒、牛病毒性腹瀉病毒、牛嵴病毒、綿羊源產腸毒素大腸桿菌、綿羊源沙門菌、綿羊源志賀菌、糞腸球菌、枯草芽胞桿菌、奇異變形桿菌核酸樣本均由西南民族大學動物醫(yī)學實驗室-20 ℃保存。

50份綿羊(3月齡以內)腹瀉糞便樣本，于2019年1月―2020年4月采自四川阿壩3個綿羊養(yǎng)殖場，用于檢測方法比較；253份綿羊(3月齡以內)糞便樣本(健康羊的133份，腹瀉羊的120份)于2020年4月―2021年5月分別采自阿壩、紅原和若爾蓋共6個養(yǎng)殖場，用于流行病學調查，所有糞便樣本均由西南民族大學動物醫(yī)學實驗室-80 ℃保存。

1.2 引物的設計與合成

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫的綿羊源Aichivirus D 3D基因序列，采用Primer Premier 6.0軟件設計引物，引物序列為F: 5′-AAGCCCTTGCTCTTTACACTTCTACCC-3′, R: 5′-CACGGGACAGCCCCTTCTTCAC-3′，位于綿羊源Aichivirus D毒株SWUN/AB18/2019基因組序列的7 118—7 423 nt(GenBank登錄號：MW364797)，由擎科生物有限公司合成。

1.3 核酸提取

用TRIzol法提取樣本總RNA，按照Prime Script TMRT試劑盒說明書的步驟反轉錄成cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 陽性標準品的制備

以綿羊源Aichivirus D SWUN/AB18/2019毒株cDNA為模板，陽性標準品的制備同文獻[9]。

1.5 反應條件及體系的優(yōu)化

退火溫度和引物濃度的優(yōu)化同文獻[9]。

1.6 熔解曲線分析和標準曲線的建立

用本試驗建立的熒光RT-PCR方法分別對10～10遞增稀釋的標準品進行檢測，建立標準曲線。

1.7 檢測綿羊Aichivirus D熒光RT-PCR方法的評價

評價指標主要包括特異性、穩(wěn)定性、敏感性和準確性。用本試驗所建立的方法對“1.1”中其他羊腹瀉病原的核酸樣本進行熒光RT-PCR檢測，對照組用等量RNase Free ddHO替代，以評價該方法的特異性。方法的批內和批間穩(wěn)定性評價、敏感性測定同文獻[9]。采用本試驗所建立的檢測綿羊源Aichivirus D熒光RT-PCR方法和常用于檢測OKoV的RT-PCR方法分別對50份綿羊腹瀉糞便樣本進行檢測以評價準確性。

1.8 臨床樣本中綿羊源Aichivirus D的檢測

利用本試驗建立的方法對253份綿羊腹瀉糞便樣本進行綿羊源Aichivirus D的檢測。

1.9 綿羊源Aichivirus D完整的3D基因序列擴增

自行設計2對特異性引物分段擴增綿羊源Aichivirus D完整的3D基因，引物信息：F1: 5′-CATTCCGTGGGCTCTGTGGTG-3′,R1: 5′-GCAAC-CAACCGCACTGCCATACT-3′;(6 748—7 533 nt, GenBank登錄號：MW296158); F2′: 5′-AAGGGGCTGTCCCGTGCTG-3′; R2: 5′-GAGACCAACACCATTACAAAGAGCCTAAC-3′(7 426—8 378 nt, GenBank登錄號：MW296158)，對“1.1”檢測到的陽性樣本，進行綿羊源Aichivirus D完整的3D基因分段克隆，并用生物軟件分析3D基因序列。

2 結 果

2.1 引物的特異性

用自行設計的特異性檢測綿羊源Aichivirus D引物從SWUN/AB18/2019毒株cDNA中擴增出大小為306 bp目的片段，與GenBank中綿羊源Aichivirus D 3D基因的相似性為100%。

2.2 優(yōu)化的熒光RT-PCR反應體系及條件

優(yōu)化的20 μL反應體系：TB Green Premix ExII 10 μL，模板1.5 μL，F(xiàn)、R引物各0.5 μL，ddHO 7.5 μL。反應條件：95 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s,56 ℃ 30 s，共40個循環(huán)；熔解段95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,95 ℃ 15 s，反應結束。

2.3 標準曲線及熔解曲線

標準品的濃度為83 ng·μL，換算拷貝數(shù)為2.53×10copies·μL。本研究建立的方法在標準品濃度為2.53×10～2.53×10copies·μL線性關系良好(圖1)，標準曲線為=-3.553 7+40.65，相關系數(shù)值為0.999 6，擴增效率為91.2%，PCR產物在86.5 ℃左右均呈現(xiàn)單一波峰，無非特異擴增峰和引物二聚體(圖2)。

圖1 綿羊源Aichivirus D熒光RT-PCR檢測方法的標準曲線

圖2 綿羊源Aichivirus D熒光RT-PCR檢測方法的熔解曲線

2.4 方法的評價

2.4.1 特異性 本試驗所建立的方法僅對綿羊源Aichivirus D具有良好的擴增曲線，對其他無關病原無擴增曲線。

2.4.2 穩(wěn)定性 本試驗所建方法的批內和批間變異系數(shù)均小于1%。

2.4.3 敏感性 本試驗所建方法所能檢出的最低拷貝數(shù)為25.3 copies·μL。

2.4.4 準確性 50份綿羊腹瀉糞便樣本中KoV的檢測結果表明，本試驗所建熒光RT-PCR方法的檢出率為30%，已有RT-PCR方法的檢出率為6%，且熒光RT-PCR方法檢出的陽性樣本包含RT-PCR方法檢出的全部陽性糞便樣本。

2.5 綿羊腹瀉糞便樣本中綿羊源Aichivirus D的檢出率

本研究所建方法對253份綿羊糞便樣本的檢測結果見表1，綿羊源Aichivirus D平均陽性率為8.7%，平均場陽性率66.7%。其中,腹瀉糞便樣本中綿羊源Aichivirus D陽性率(17.5%)顯著高于非腹瀉糞便樣本中綿羊源Aichivirus D陽性率(0.75%，<0.001)，陽性PCR產物經測序證實均為3D目的基因。

表1 樣本信息及綿羊源Aichivirus D檢測結果

2.6 綿羊源Aichivirus D 3D完整基因的克隆結果

從阿壩、若爾蓋和紅原共4個綿羊養(yǎng)殖場的綿羊源Aichivirus D陽性糞便樣本中成功克隆出大小為1 422 bp的13個完整的3D基因(GenBank登錄號: MZ558247～MZ558259)。這13個3D基因間的核苷酸相似性為99.4%～100.0%，與GenBank中國外僅有的1個Aichivirus B OKoV完整的3D基因核苷酸相似性為62.3%～62.9%，與GenBank中前期本研究上傳的1個綿羊源Aichivirus D完整3D基因核苷酸相似性為99.4～100.0%，與GenBank中僅有的2個牛源Aichivirus D毒株的3D基因核苷酸相似性為71.0～82.5%。

系統(tǒng)發(fā)育分析表明，這13株綿羊源Aichivirus D 3D基因與中國綿羊源Aichivirus D毒株的3D基因共同聚為單獨的一個大支(圖3)，并且與牛源Aichivirus D 3D基因遺傳關系最近，而與Aichivirus B OKoV毒株3D遺傳關系較遠，說明本研究的毒株是Aichivirus D的一個新的成員。這14個中國綿羊源Aichivirus D毒株完整3D氨基酸序列與GenBank中僅有的1個國外Aichivirus B OKoV和2個牛源Aichivirus D 3D氨基酸序列相比，8個毒株(GenBank登錄號：MZ558247-MZ558251，MZ558256-MZ558258)有2個共同的氨基酸突變在RNA的聚合酶區(qū)域。

●.本研究綿羊源Aichivirus D毒株;▲.本實驗室前期克隆的1個中國綿羊源Aichivirus D毒株；◆.GenBank中唯一的1個Aichivirus B OKoV毒株

3 討 論

目前，3D基因為KoV檢測方法的主要靶基因，盡管該基因在嵴病毒屬成員中較為保守，但同種基因型毒株遺傳關系較為密切，具有遺傳多樣性。檢測OKoV的方法目前只有1篇文獻報道，這種RT-PCR方法能同時檢測Aichivirus A、Aichivirus B和Aichivirus C 3個種的毒株核酸，其特異性需要測序驗證。該RT-PCR方法的上游引物(23個堿基)擴增位點在國內唯一上傳的1個完整綿羊源Aichivirus D 3D基因序列有6個核苷酸突變，在18-19位插入了14個核苷酸，而下游引物(22個堿基)擴增位點有9個核苷酸突變；另外該方法引物在其他Aichivirus A、Aichivirus B和Aichivirus C毒株3D基因上有不同程度的核苷酸突變，這些堿基突變很可能會影響PCR擴增效率。本研究根據(jù)綿羊源Aichivirus D流行毒株的3D基因建立了熒光RT-PCR方法，該方法特異性和重復性好，靈敏度高，與國外上述檢測KoV的RT-PCR方法相比，大大提高了臨床樣本中綿羊源Achivirus D的檢出率，為綿羊源Achivirus D檢測和流行病學調查提供了新的檢測方法。

KoV是人和多種動物腹瀉的相關病原，綿羊源Achivirus D作為綿羊新發(fā)病毒，其流行病學資料匱乏。本試驗用建立的熒光RT-PCR方法對2020年4月-2021年5月阿壩、若爾蓋和紅原6個綿羊養(yǎng)殖場的253份綿羊糞便樣本進行了檢測，結果腹瀉糞便樣本中綿羊源Achivirus D陽性率(17.5%)顯著高于非腹瀉糞便樣本中綿羊源Achivirus D陽性率(0.75%，<0.001)，場陽性率為66.7%，表明了綿羊源Aichivirus D可能是引起以上地區(qū)綿羊腹瀉的病原。

遺傳演化分析表明，已有的14個中國綿羊源Aichivirus D毒株其完整的3D基因共同聚為單獨的1個小支，與2個牛源Aichivirus D毒株聚為單獨的1個大支，而與國外Aichivirus B OKoV毒株遺傳距離相對較遠，說明了中國毒株具有獨特的進化模式(圖2)，這可能是由環(huán)境、地域和自然選擇模式等因素造成的。3D基因編碼區(qū)包含高度保守的氨基酸基序，作為KoV依賴性RNA的聚合酶，參與調節(jié)病毒RNA復制，該區(qū)域氨基酸的突變可能會降低RNA聚合酶的活性。本研究14個中國綿羊源Aichivirus D毒株完整3D氨基酸序列與GenBank中僅有的1個國外Aichivirus B OKoV和2個牛源Aichivirus D 3D氨基酸序列相比，8個毒株有2個共同的氨基酸突變在RNA的聚合酶區(qū)域，這些獨特的氨基酸替換是否會影響3D基因的功能需要進一步探討。

4 結 論

成功建立檢測綿羊源Aichivirus D的熒光RT-PCR方法，與常見的其他無關病原無交叉反應，批內、批間變異系數(shù)均小于1%，最低檢出拷貝數(shù)為25.3 copies·μL，檢出率高于已有的RT-PCR，該方法特異性和穩(wěn)定性好，靈敏度高，為綿羊源Aichivirus D病原流行病學調查提供了新的檢測方法。證明綿羊源Aichivirus D已在青藏高原腹瀉綿羊中廣泛流行，其3D基因具有獨特的進化趨勢。