‘摩爾多瓦’葡萄MYB4b基因克隆鑒定及表達(dá)分析

孫洋，王超霞，田淑芬*，劉丹，羅盼，王榮

（1. 天津農(nóng)學(xué)院園藝園林學(xué)院，天津 300384；2. 天津市尖峰天然產(chǎn)物研究開(kāi)發(fā)有限公司，天津 300192）

花色苷是苯丙烷代謝途徑的主要物質(zhì)，是自然界廣泛存在的類黃酮物質(zhì)[1]。葡萄種植和釀酒加工過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量枝條和果皮殘?jiān)?，其中仍含有豐富的花色苷，可用于一些高附加值保健食品的開(kāi)發(fā)，具有廣泛的應(yīng)用前景[2]。

MYB轉(zhuǎn)錄因子在葡萄花色苷的合成過(guò)程中起著決定性作用。根據(jù)葡萄基因組信息，預(yù)測(cè)有279個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子[3]，從PlantTFDB上查詢到葡萄R2R3類MYB轉(zhuǎn)錄因子約有190個(gè)。根據(jù)蛋白質(zhì)羧基端DNA結(jié)合區(qū)保守氨基酸的基序，這些R2R3類MYB轉(zhuǎn)錄因子可分為28個(gè)亞類，廣泛參與植物初生及次生代謝、細(xì)胞分化、激素信號(hào)傳導(dǎo)、生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控、生物及非生物逆境響應(yīng)等生命過(guò)程[4]。其中MYBAl和MYBA2這兩個(gè)位于2號(hào)染色體上的基因位點(diǎn)對(duì)葡萄的顏色起決定性影響。它們形成一個(gè)高度交聯(lián)的基因簇，長(zhǎng)度約為200 kb，通過(guò)調(diào)控UFGT基因的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)花色苷合成的作用[5-7]。在各種葡萄品種中，MYBAl基因位點(diǎn)的基因型主要包括VvmybAla、VvmybAlb和VvmybAl等位基因。在葡萄發(fā)育過(guò)程中，將逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子Gretl（Retrotransposon 1）插入VvmybAl編碼序列的上游啟動(dòng)子區(qū)域會(huì)導(dǎo)致花色苷相關(guān)基因的表達(dá)受到抑制，從而使葡萄皮無(wú)法合成花青素，所以會(huì)出現(xiàn)綠色葡萄果實(shí)[7-9]。VvmybAlb和VvmybAl具有通過(guò)調(diào)節(jié)UFGT的表達(dá)而促進(jìn)花色苷合成的功能[10]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，花色苷合成相關(guān)基因的啟動(dòng)子序列上存在MYB4結(jié)合的順式作用元件，據(jù)此推測(cè)，MYB4b作為MYB家族的成員之一，可能參與調(diào)控果實(shí)花色苷的合成。

‘摩爾多瓦’（Moldova）葡萄于1997年從羅馬尼亞引入，原產(chǎn)地為摩爾多瓦共和國(guó)。該品種為歐美雜交種，果實(shí)著色力強(qiáng)，能有效抵抗霜霉病的侵染，對(duì)天氣的包容度極高。天津地區(qū)的氣候特點(diǎn)是季節(jié)氣候變化明顯，干旱多風(fēng)，土壤鹽漬化程度高，因此，‘摩爾多瓦’葡萄適合在天津種植。為了解‘摩爾多瓦’葡萄MYB4b轉(zhuǎn)錄因子的相關(guān)生物學(xué)功能，提高其利用效率，試驗(yàn)利用PCR技術(shù)克隆獲得MYB4b轉(zhuǎn)錄因子的基因序列，并對(duì)其進(jìn)行生物信息分析與預(yù)測(cè)，采用熒光定量PCR方法檢測(cè)MYB4b基因在‘摩爾多瓦’不同組織部位和不同農(nóng)藝技術(shù)處理下的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平，同時(shí)檢測(cè)了相應(yīng)的花色苷含量，為研究其在葡萄生理脅迫過(guò)程中所作出的調(diào)控應(yīng)答奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料與處理

試驗(yàn)于2021年8月5日至2021年12月25日在天津市武清區(qū)金鍋農(nóng)業(yè)生態(tài)園進(jìn)行?！柖嗤摺咸褳槎嗄晟愿?，棚架栽培，定植株距1.0 m，行距3.0 m，棚架高4 m。每株葡萄結(jié)果主蔓1個(gè)，每果枝保留1穗果，整株保持40穗。

采集了花前7 d（7 dbf）、花期（0 daf）和花后7 d（7 daf）的花序、莖尖、幼莖、老莖、新葉、老葉、幼卷須、老卷須，以及不同發(fā)育時(shí)期的果實(shí)：幼果期（開(kāi)花后14 d）、轉(zhuǎn)色期（開(kāi)花后56 d）及成熟期（開(kāi)花后126 d）。采集‘摩爾多瓦’轉(zhuǎn)色期的果實(shí)進(jìn)行無(wú)菌水（CK）、0.3% NaCl、60 g·L-1PEG6000、40 mg·L-1碧護(hù)、500 mg·L-1殼聚糖共計(jì)5個(gè)浸泡處理，取處理0、3、6、12、24 h，2、4、6、8 d（10個(gè)時(shí)間點(diǎn)）的樣品進(jìn)行檢測(cè)，3次重復(fù)。樣品采集后存于液氮，用于RNA提取。

1.2 總DNA提取及目標(biāo)基因克隆

用TaKaRa MiniBEST Plant Genomic DNA Extraction Kit試劑盒（9768，TaKaRa）提取葡萄葉片總DNA，具體提取方法參照試劑盒說(shuō)明書。

在NCBI中獲得MYB4b的全長(zhǎng)序列，并采用Primer 5軟件設(shè)計(jì)引物（表1）。PCR擴(kuò)增目標(biāo)基因，回收純化特異性擴(kuò)增產(chǎn)區(qū)與天根的pGM-T載體連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，藍(lán)白斑篩選后將陽(yáng)性菌液送生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

表1 本文所采用的引物信息Table 1 Primer information used in this paper

1.3 生物信息學(xué)分析

采用ProtParam預(yù)測(cè)蛋白理化性質(zhì)；SignalP 4.1 Server預(yù)測(cè)信號(hào)肽；ProtScale預(yù)測(cè)親水性/疏水性；TMHMM-2.0 Server預(yù)測(cè)跨膜區(qū)；NCBI的CDD（Conserved Domain Database）預(yù)測(cè)功能結(jié)構(gòu)域；SOPMA預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)及三級(jí)結(jié)構(gòu)；Psort和Cell-PLoc 2.0進(jìn)行亞細(xì)胞定位；MEGA 5.1進(jìn)行氨基酸序列多重比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析。

1.4 總RNA提取及實(shí)時(shí)熒光定量PCR

用HiPure Plant RNA mini Kit試劑盒（R4151-02，Magen）提取成熟葉、幼嫩葉、幼莖、老莖、幼卷須、老卷須、莖尖，以及各個(gè)階段的花序和果實(shí)總RNA，反轉(zhuǎn)錄后得到cDNA。按照SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）的操作指導(dǎo)，在Illumina-Eco熒光定量PCR儀（美國(guó)ABI）上測(cè)定基因的表達(dá)量。

以延伸因子EF-1α為內(nèi)參基因進(jìn)行熒光定量PCR，采用Primer5軟件設(shè)計(jì)相關(guān)引物（表1）。10 μL反應(yīng)體系：2×SuperReal PreMix Plus 5 μL、上下游引物（10 mmol）各0.3 μL、cDNA模板1 μL和RNase-free水3.4 μL。反應(yīng)條件：98 ℃ 10 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)；最后進(jìn)行溶解曲線測(cè)定。熒光定量結(jié)果通過(guò)相對(duì)定量法（2-△△t）進(jìn)行分析，采用Excel軟件繪圖。

1.5 總花色苷含量測(cè)定

總花色苷含量用鹽酸甲醇法測(cè)定，具體方法參照洪燕紅的試驗(yàn)方法[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 MYB4b基因克隆與序列分析

用TaKaRa MiniBEST Plant Genomic DNA Extraction Kit試劑盒（9768，TaKaRa）提取葡萄葉片總DNA凝膠電泳結(jié)果顯示提取的DNA條帶清晰完整（圖1左），Nanodrop 2000微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)結(jié)果得到所提DNA的濃度為324.54 μg·μL-1，OD260/280的比值為1.84。結(jié)果表明所提的基因組DNA濃度和純度滿足后續(xù)試驗(yàn)的要求。

從電泳圖（圖1中）中可以看出，PCR擴(kuò)增得到大小不同的多個(gè)片段。根據(jù)DNA marker的位置和預(yù)期目標(biāo)產(chǎn)物的大小，將700～1000 bp大小的電泳條帶均進(jìn)行切膠回收。根據(jù)TA克隆載體的重組原理，藍(lán)白斑篩選結(jié)果顯示（圖1右），藍(lán)色菌落中不含目的片段，白色菌落可能含有目的片段。

圖1 ‘摩爾多瓦’葡萄基因組DNA（左）和PCR產(chǎn)物（中）電泳圖及藍(lán)白斑篩選圖（右）Figure 1 Electrophoresis of genomic DNA (left) and PCR products (middle) and blue and white spot screening map (right) of 'Moldova'

Sanger測(cè)序結(jié)果分析表明，PCR克隆得到的片段即為MYB4b基因序列，該基因含有2個(gè)外顯子，1個(gè)內(nèi)含子，轉(zhuǎn)錄的mRNA序列總長(zhǎng)為729 bp，共編碼242個(gè)氨基酸，單鏈分子量為27 311.04 （表2）。

表2 MYB4b基因序列分析Table 2 Sequence analysis of MYB4b gene

2.2 生物信息學(xué)分析

利用ProtParam在線軟件預(yù)測(cè)一級(jí)結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)，MYB4b蛋白分子式為C1178H1880N360O357S16，原子總數(shù)為3791，分子量為27311.04。理論等電點(diǎn)pI為8.47，為堿性蛋白。氨基酸組成Leu最多，占11.2%；Gln最少，占0.4%；未出現(xiàn)Pyl、Sec。帶正電荷氨基酸殘基總數(shù)（Asp＋Glu)為33，帶負(fù)電荷氨基酸殘基總數(shù)（Arg＋Lys)為37。脂溶系數(shù)為73.35，總平均疏水系數(shù)為-0.705，屬于疏水性蛋白。半衰期為30 h，不穩(wěn)定系數(shù)55.60，根據(jù)不穩(wěn)定參數(shù)值在40以下才是穩(wěn)定蛋白的標(biāo)準(zhǔn)，可推測(cè)MYB4b翻譯出來(lái)的蛋白為不穩(wěn)定蛋白。

使用NCBI的Conserved Domain Database數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)所獲得的‘摩爾多瓦’葡萄MYB4b蛋白的氨基酸序列進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析（圖2）。結(jié)果表明，MYB4b蛋白在第1～131個(gè)氨基酸之間含有一個(gè)PLN03091功能結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)為轉(zhuǎn)錄阻遏型因子MYB5的保守結(jié)構(gòu)域，E-value為6.1e-73，且PLN03091是超家族cl33633的唯一成員。

圖2 MYB4b蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)分析Figure 2 Prediction and analysis of conserved domain ofMYB4bprotein

使用在線軟件預(yù)測(cè)‘摩爾多瓦’葡萄MYB4b蛋白的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)（圖3）。MYB4b蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中，主要是有123個(gè)氨基酸位點(diǎn)形成無(wú)規(guī)則卷曲，占比達(dá)到了50.83%；其次為80個(gè)氨基酸位點(diǎn)形成的α-螺旋占比達(dá)到33.06%，24個(gè)氨基酸位點(diǎn)形成的β-折疊占比達(dá)到9.92%，15個(gè)氨基酸位點(diǎn)的β-轉(zhuǎn)角占比達(dá)到6.20%。MYB4b蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)與二級(jí)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)相吻合，為螺旋-折疊-無(wú)規(guī)則卷曲。

圖3 MYB4b蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)（左）和三級(jí)結(jié)構(gòu)（右）預(yù)測(cè)Figure 3 Secondary (left) and three-level (right) structures prediction of MYB4b protein

2.3 MYB4b蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析

采用在線軟件ProtScale對(duì)‘摩爾多瓦’葡萄MYB4b蛋白氨基酸序列進(jìn)行親水性/疏水性預(yù)測(cè)。由圖4可知，MYB4b蛋白在多肽鏈第162位氨基酸最低分值為-3.144，疏水性最強(qiáng)；而在蛋白多肽鏈第200位氨基酸親水性分值最高，為1.856，疏水性最弱?？傮w而言，MYB4b蛋白氨基酸序列親水氨基酸分布較均勻，且親水氨基酸數(shù)量多與疏水氨基酸，總體平均疏水系數(shù)為-0.705。因此推測(cè)MYB4b蛋白為親水蛋白。

圖4 MYB4b蛋白親水性/疏水性預(yù)測(cè)Figure 4 Prediction of hydrophobicity/hydrophobicity of MYB4b protein

系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析結(jié)果表明（圖5），目的基因MYB4b與刺葡萄（Vitis davidii）的MYB相關(guān)蛋白308的編碼基因和河岸葡萄（Vitis riparia）的MYB4a轉(zhuǎn)錄因子同源性最高，表明兩者親緣關(guān)系較近。與其他物種的MYB序列聚類分析發(fā)現(xiàn)，葡萄MYB4b與擬南芥的同源關(guān)系較近，反而與葡萄的其他轉(zhuǎn)錄因子，如MYB14、MYB15的親緣進(jìn)化關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。此外，對(duì)葡萄不同MYB轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行聚類分析發(fā)現(xiàn)，相比對(duì)VvMYB24、VvMYB44、VvAPL來(lái)講，MYB4b與MYB14、MYB15的同源性相對(duì)較高，但處在不同分支。由此推測(cè)在葡萄進(jìn)化過(guò)程中，MYB4b、MYB14/15和VvMYB24/44，可能來(lái)自不同的進(jìn)化途徑，屬于不同的R2R3-MYB亞型。

圖5 MYB轉(zhuǎn)錄因子系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Figure 5 Phylogenetic tree of MYB transcription factors

2.4 不同組織MYB4b基因的表達(dá)模式及花色苷分布

如圖6所示，在‘摩爾多瓦’葡萄不同時(shí)期的花序、莖尖、幼莖、老莖、新葉、老葉、幼卷須、老卷須，以及不同時(shí)期的葡萄果實(shí)（幼果期、轉(zhuǎn)色期及成熟期）中均檢測(cè)到MYB4b基因的表達(dá)，但在各組織中的表達(dá)量不同。其中，在莖尖和花序（7 dbf）中的表達(dá)量較高，其次是花序（0 daf）中，而在幼果期果實(shí)中的表達(dá)量較低（圖6）。比較MYB4b基因在老葉和新葉中的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，MYB4b在老葉中的表達(dá)量高于新葉。

圖6 不同組織部位的MYB4b基因的組織表達(dá)模式（左）及花色苷含量（右）Figure 6 Relative expression of MYB4b (left) and anthocyanin contents (right) in different tissue parts

如圖6所示，‘摩爾多瓦’葡萄不同組織部位中均含有花色苷。其中，花色苷在葡萄果實(shí)成熟期含量顯著高于其他組織部位，是花序（7 dbf）中花色苷含量的3.6倍，是花序（7 daf）中花色苷含量的50倍。比較花色苷在老葉和新葉的含量發(fā)現(xiàn)，老葉（0.756 mg·g-1）中的花色苷含量略高于新葉（0.737 mg·g-1）；比較花色苷在老卷須和幼卷須的含量發(fā)現(xiàn)，老卷須（0.149 mg·g-1）中的花色苷含量低于新卷須（0.444 mg·g-1）。

2.5 離體處理對(duì)MYB4b的基因表達(dá)和花色苷的影響

由圖7可知，鹽脅迫下，果實(shí)中MYB4b基因的表達(dá)呈先升高后下降趨勢(shì)，以處理6 h的MYB4b的表達(dá)量最高，之后逐漸回落。PEG誘導(dǎo)的干旱處理中，處理3 h的表達(dá)量較處理前顯著上升，24 h明顯回落，但處理6 d的表達(dá)量再次顯著上升。葡萄果實(shí)在碧護(hù)處理中，MYB4b基因的表達(dá)量在處理的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均顯著低于0 h，但6、12、24 h時(shí)均顯著高于同時(shí)期的清水處理，而處理2、4、8 d，MYB4b基因的表達(dá)量明顯下調(diào)，顯著低于處理前。葡萄果實(shí)在殼聚糖處理12 h前MYB4b基因的表達(dá)逐漸增加，在12 h達(dá)到最高值，隨后MYB4b基因的表達(dá)開(kāi)始降低，自2 d開(kāi)始各處理時(shí)間點(diǎn)MYB4b基因的表達(dá)量均低于處理前。上述結(jié)果表明，0.3%鹽、PEG6000、碧護(hù)和殼聚糖處理下調(diào)MYB4b基因的表達(dá)，其中0.3%鹽和殼聚糖的下調(diào)表達(dá)更強(qiáng)烈。

圖7 離體處理下MYB4b基因的表達(dá)變化Figure 7 Expression changes of MYB4b gene under in vitro treatment

由圖8可知，鹽脅迫下（圖8A），果實(shí)中花色苷的含量變化先增加后減少，以處理6 h花色苷的含量最高，處理6 h后，花色苷的含量逐漸回落，在處理4 d時(shí)達(dá)到次高值。PEG誘導(dǎo)的干旱處理（圖8B），果實(shí)中花色苷的含量變化先增加后減少，以處理4 d時(shí)花色苷的含量最高，顯著高于其他組織部位，是處理0 h的5.8倍。碧護(hù)處理中（圖8C），花色苷含量在處理6 h時(shí)達(dá)到最高值，6 h后逐漸降低，在處理6 d時(shí)有所回升，卻仍低于處理6 h的花色苷含量，是處理6 h的0.65倍。殼聚糖處理中（圖8D），果實(shí)中花色苷的含量變化先減少后增加，以處理4 d時(shí)花色苷的含量最高，顯著高于其他組織部位，處理0 h的花色苷含量為次高值。上述結(jié)果表明，0.3%鹽、PEG6000、碧護(hù)和殼聚糖處理均可促進(jìn)花色苷的合成，但花色苷含量最高的出現(xiàn)時(shí)間不同，其中0.3%鹽和碧護(hù)處理均在處理6 h時(shí)花色苷含量最高，PEG6000和殼聚糖處理均在處理4 d時(shí)花色苷含量最高。

圖8 花色苷在0.3%鹽溶液（A）、PEG6000 (B)、碧護(hù)（C）和殼聚糖（D）處理中的含量Figure 8 Anthocyanin contents in in vitro treatment of 0.3% salt (A)、PEG6000 (B)、Bihu (C) and chitosan (D)

3 討論

MYB轉(zhuǎn)錄因子家族成員均含有MYB保守結(jié)構(gòu)域[12]。在物種的進(jìn)化過(guò)程中，基因的保守氨基酸序列變化很小，決定著基因的功能和類型。根據(jù)NCBI的CDD數(shù)據(jù)庫(kù)分析得到MYB4b蛋白在第1～131位堿基之間含有一個(gè)PLN功能結(jié)構(gòu)域[13-14]。前人研究發(fā)現(xiàn)，PLN保守結(jié)構(gòu)可能是一個(gè)含有多個(gè)結(jié)構(gòu)域的模型，是轉(zhuǎn)錄阻遏型因子MYB5的保守結(jié)構(gòu)域，說(shuō)明MYB4b轉(zhuǎn)錄因子屬于典型的MYB家族基因，可能具有轉(zhuǎn)錄抑制作用，其具體的功能有待進(jìn)一步的試驗(yàn)驗(yàn)證。

由于轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子需要與基因組DNA下游靶基因的順式作用元件相結(jié)合，從而發(fā)揮其對(duì)下游基因的激活或者抑制等調(diào)控作用。當(dāng)轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白在細(xì)胞質(zhì)中完成翻譯修飾后，需要特定的核定位信號(hào)引導(dǎo)其從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核中，因此轉(zhuǎn)錄因子的亞細(xì)胞定位大多是在細(xì)胞核中，如PbMYB3R、VdMYB14轉(zhuǎn)錄因子的檢測(cè)與鑒定[15-16]。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果表明，MYB4b轉(zhuǎn)錄因子定位于細(xì)胞核中，說(shuō)明其含有的核定位信號(hào)，可將其翻譯修飾后的蛋白質(zhì)從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核中，有助于其PLN保守結(jié)構(gòu)域結(jié)合到基因組DNA上，從而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活或抑制等調(diào)控功能。

在植物中，MYB基因家族具有悠久的進(jìn)化歷史。早期的系統(tǒng)進(jìn)化分析推測(cè)，在十億年前就出現(xiàn)了MYB結(jié)構(gòu)域[17-18]。與動(dòng)物相比，植物MYB基因家族系統(tǒng)性分化程度較低，數(shù)目眾多，加大了對(duì)其進(jìn)化研究的困難[19-21]。本文MYB4b轉(zhuǎn)錄因子與其他物種以及葡萄其他MYB轉(zhuǎn)錄因子構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的結(jié)果表明，MYB4b與刺葡萄（Vitis davidii）的MYB相關(guān)蛋白的編碼基因以及河岸葡萄（Vitis riparia）的MYB4a轉(zhuǎn)錄因子同源性最高，表明兩者親緣關(guān)系較近。

MYB轉(zhuǎn)錄因子是植物中非常重要的一類轉(zhuǎn)錄因子，是花青素生物合成中MBW復(fù)合物的主要調(diào)控因子[22]。Zahra[23]等研究也發(fā)現(xiàn)，MYB影響植物中花青素、黃酮類化合物的合成。本研究通過(guò)組織表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)，MYB4b在‘摩爾多瓦’葡萄果實(shí)幼果期的表達(dá)量最低，在果實(shí)轉(zhuǎn)色期及成熟期低表達(dá)，推測(cè)其可能負(fù)調(diào)控葡萄果實(shí)花色苷的合成。此外，MYB4b與MYB14、MYB15的同源性相對(duì)較高，李慎昌[24]的試驗(yàn)結(jié)果表明，VdMYB14能夠有效抑制花色苷的合成，推測(cè)MYB4b抑制花色苷的合成。

碧護(hù)是一種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，其作用機(jī)理是讓植物獲得抗性物質(zhì)，提高自我修復(fù)功能，它能激活植物體各種酶的活性，促使植物葉片把光合效能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能[25]。殼聚糖在許多園藝作物中的應(yīng)用潛力多有研究，包括誘導(dǎo)防御反應(yīng)、改善農(nóng)藝性狀、果蔬采后管理、促進(jìn)植物生長(zhǎng)和增強(qiáng)生理活性等[26]。本研究發(fā)現(xiàn)，0.3%鹽、干旱、碧護(hù)和殼聚糖處理均下調(diào)MYB4b基因的表達(dá)，推測(cè)對(duì)花色苷的合成起促進(jìn)作用。MYB4b基因是否對(duì)葡萄果實(shí)花色苷的合成有影響待進(jìn)一步的驗(yàn)證分析。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)通過(guò)PCR技術(shù)和TA克隆得到‘摩爾多瓦’葡萄MYB4b基因序列，該基因編碼的蛋白質(zhì)屬于親水性的非分泌堿性蛋白，系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示MYB4b基因與擬南芥的MYB4同源性較高，與VvMYB14/15的同源性相對(duì)較低，可能屬于不同的亞型。

MYB4b基因在不同組織部位均有表達(dá)，莖尖和花序（7 dbf）中的表達(dá)量較高，在幼果期的果實(shí)中表達(dá)量較低；同時(shí)受到0.3%鹽、PEG6000、碧護(hù)和殼聚糖處理的誘導(dǎo)表達(dá)，其中0.3%鹽和殼聚糖對(duì)MYB4b基因的下調(diào)表達(dá)更強(qiáng)烈。