骨髓間充質(zhì)干細胞標記技術(shù)的研究與進展

朱杰

摘要：背景：骨髓間充質(zhì)干細胞是干細胞移植及組織工程研究中常用的細胞，近來有關(guān)于其標記示蹤技術(shù)的研究日益增多，研究的進展有目共睹但就其示蹤方法的選擇上仍存在較大爭議。目的：對國內(nèi)外 BMMSC的標記示蹤技術(shù)的研究進展作一綜述。方法：本文以“骨髓間充質(zhì)干細胞、標記方法、示蹤技術(shù)”等中文關(guān)鍵詞在萬方數(shù)據(jù)庫和CNKI進行檢索，并以“l(fā)abeling，bone? marrow mesenchymal stem cell，Tracer”等英文關(guān)鍵詞在 PubMed、Web of Science 數(shù)據(jù)庫檢索，選擇文獻進行綜述。結(jié)果和結(jié)論：骨髓間充質(zhì)干細胞有眾多標記方法及示蹤技術(shù)，主要有熒光染料標記法、熒光蛋白標記法、核苷酸標記法、核磁共振對比增強標記法等。不同的示蹤方法有各自的優(yōu)缺點，科研實驗所選擇的示蹤方法應具有特異性強、靈敏度高、標記步驟簡便、檢測方法簡單、對細胞或生物影響小等優(yōu)點，而科研工作者也在不斷改進更新示蹤方法，骨髓間充質(zhì)干細胞的示蹤技術(shù)仍有待于進行進一步的研究。

關(guān)鍵詞：骨髓間充質(zhì)干細胞;標記方法;示蹤技術(shù);綜述

【中圖分類號】 G644.5 【文獻標識碼】 A? ? ? 【文章編號】2107-2306（2022）10--02

骨髓間充質(zhì)干細胞是一種具有較強自我更新能力的多能干細胞，具有培養(yǎng)方便，提取簡單，分化潛能高，免疫原性低1等優(yōu)點故被廣泛應用于組織工程，研究表明骨髓間充質(zhì)干細胞移植入宿主體內(nèi)可提高宿主缺失功能的再生修復程度2，隨著骨髓間充質(zhì)干細胞的研究日益增多，各類標記示蹤技術(shù)層出不窮，尋找一種標記穩(wěn)定且不影響細胞理化性質(zhì)的標記方法能有效監(jiān)測干細胞移植后的增殖分化情況。本文對幾類常見的細胞標記技術(shù)作一綜述。

1.熒光染料標記法

1.1 CM-DiL

DiL是一種可結(jié)合于細胞膜并在膜內(nèi)通過被動擴散而標記細胞的親脂性熒光染料，它還可以通過細胞的胞飲作用進入細胞來標記整個細胞質(zhì)。其在細胞內(nèi)消失周期較長，且較難由標記細胞轉(zhuǎn)移到非標記細胞，細胞毒性低，對細胞活力及細胞生長影響較小3。 CM-Dil（氯苯甲酰氨-1，1’雙十八烷基-3，3’，3’，3’-四甲基吲哚羰基花青高氯酸鹽，Chloromethylbenzamido-1， 1-Dioctadecyl-3，3，3，3-TetramethylindocarbocyaninePerchlorate）是在Dil中加入了氯甲基取代物而成的Dil的衍生物，其通過與細胞內(nèi)含巰基的多肽和蛋白結(jié)合而獲得能夠抵抗醛類的固定作用的能力，近年來已基本替代 Dil在細胞示蹤方面的使用。CM-DIL是一種無毒的親脂性膜染料，其染色穩(wěn)定性和染色強度優(yōu)于大多數(shù)其他熒光染料或放射性同位素4。其熒光激發(fā)波和發(fā)射波長分別為 553 nm、570 nm5。研究表明該染料標記能力強，且不影響間充質(zhì)干細胞在體內(nèi)外的遷移或多向分化潛能6，陳7等人的研究顯示間充質(zhì)干細胞經(jīng)CM-Dil染色后傳至第8代時仍有較強的熒光表達。CM-Dil不適用于細胞長期示蹤是由于其標記細胞膜，有隨著細胞分裂熒光強度也會逐漸降低的缺點。

1.2 CF-SE

羧基熒光素乙酰乙酸5，6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester，CFDA-SE）是一種非極性分子，具有很高的膜通透性而無熒光活性，當其進入細胞內(nèi)環(huán)境后，其乙酸基團被細胞內(nèi)的酶水解而轉(zhuǎn)化為氨基反應性羧基熒光素琥珀酰亞胺酯（carboxyfluorescein succinimidyl ester，CFSE），后者帶負電荷并具有很高的熒光活性，且細胞膜不再對其通透，其含有的succinimidyl ester基團能與細胞中的游離胺基結(jié)合形成穩(wěn)定的具有綠色熒光的復合物存在于細胞中8，9。CFSE標記活細胞后可在細胞傳代時將熒光標記物均勻地分配到子代細胞中，故分裂后細胞的熒光強度是親代細胞一半，以此可用流式細胞儀在 488nm波長處進行分析，以此來推斷細胞的傳代情況。研究表明CFSE染色不影響角質(zhì)形成細胞或黑素細胞的活性或正常遷移功能10。隨著細胞的分裂增殖過程不斷進行，細胞熒光染色活性也會隨著細胞的分裂逐漸遞減，故CFSE熒光染色法一般不用于細胞長期示蹤。

1.3 DAPI

DAPI即4’，6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽（4’，6-diamidino-2-phenylindole）是較為常用的細胞核熒光染料，其能透過細胞膜進入細胞中并結(jié)合在DNA雙螺旋上，故常用來標記活細胞。DAPI標記的優(yōu)點是標記效率高，毒性小，費用低。缺點是由于DAPI是與DNA結(jié)合，DNA半保留復制的特點會使DAPI在子代細胞中的含量越來越低，此外，有研究表明死亡后的標記細胞釋放出的DAPI可能被周圍細胞攝取而出現(xiàn)假陽性11。Shang12等人的研究顯示DAPI標記骨髓間充質(zhì)干細胞后在紫外熒光激發(fā)下，標記細胞的細胞核呈藍色，細胞膜及細胞質(zhì)呈暗區(qū)，標記后的第3代細胞的熒光強度明顯減弱且標記細胞存在活力逐漸降低的趨勢。因此DAPI也適用于細胞的短期示蹤。

2.分子學標記法

2.1熒光蛋白標記法

熒光蛋白標記技術(shù)是近來發(fā)展迅速的示蹤技術(shù)，熒光蛋白即可自行發(fā)出不同顏色熒光的蛋白質(zhì)，其中應用價值最大的是由 Shimomura13等在 1962年由維多利亞多管水母中提取而來的綠色熒光蛋白。GFP生色團結(jié)構(gòu)被高能量光子照射后發(fā)生構(gòu)象轉(zhuǎn)變，由高能級構(gòu)象躍遷為低能級構(gòu)象后發(fā)出能量較低的光子14從而發(fā)出綠色熒光 ，GFP有著易于檢測、靈敏度高、熒光性質(zhì)穩(wěn)定、無毒等優(yōu)點，近年來成為被廣泛應用的示蹤物質(zhì)。但是天然GFP熒光強度較低，故其通過氨基酸替換形成的突變體：增強型綠色熒光蛋白（EGFP）成為目前主要使用的熒光蛋白，該突變保留了GFP的諸多優(yōu)點，使其熒光強度顯著增強且更易于表達。Pinero 等用EGFP標記了BMSC后熒光穩(wěn)定持續(xù)表達超過了60天。熒光蛋白標記的穩(wěn)定高效使其被廣泛應用于生物的研究中，但熒光蛋白標記法存在著費用高以及研究周期長的缺點。由于其熒光表達穩(wěn)定且持續(xù)時間長，故更適用于一些長研究周期的示蹤研究。

2.2核苷酸標記法

細胞增殖周期一共包括4個時期，DNA是細胞在S期利用各種原料以半保留復制的形式進行合成的，BrdU即5-溴脫氧尿苷（5-bromo-2-deoxyuridine，BrdU）結(jié)構(gòu)類似于胸腺嘧啶核苷酸，當細胞周期處于S期時且有BrdU存在于細胞中時，BrdU可競爭內(nèi)源性胸腺嘧啶核苷酸的結(jié)合位點從而進入細胞的核酸中，后通過抗BrdU單克隆抗體對其進行免疫組織化學染色便可觀察其標記細胞的情況。抗BrdU單克隆抗體不與細胞自身的胸腺嘧啶發(fā)生反應，避免了假陽性的情況出現(xiàn)。許偉等人的研究使用BrdU標記骨髓間充質(zhì)干細胞，結(jié)果顯示BrdU標記率為86.2%。BrdU標記的優(yōu)點有：操作簡便、標記迅速、標記率高。但有報道稱未被標記細胞可吞噬死亡細胞所釋放的BrdU從而出現(xiàn)假陽性標記。5-乙炔基-2’-脫氧尿苷（EdU）是另一種胸腺嘧啶核苷類似物，但由于其損害細胞表型并降低細胞活力，故很少應用于干細胞示蹤。

3.核磁共振（magnetic resonance imaging，MRI）對比增強劑標記法

1999年Weissleder提出分子影像學概念，分子影像學是通過不同的影像學技術(shù)顯示不同分子水平下的特定分子，反映活體分子水平變化，在影像學方向研究其生物學行為的科學。主要包括磁共振成像、核醫(yī)學成像和計算機斷層成像等技術(shù)。由于核磁共振具有較高的時間和空間分辨率，加之近年來核磁共振對比劑研究的不斷深入，故目前核磁共振對比增強劑標記法在骨髓間充質(zhì)干細胞示蹤研究中應用較廣泛。該技術(shù)是用MRI追蹤事先在體外被磁共振增強劑標記后并移植的細胞，目前應用較多的磁共振對比增強劑是超順磁性氧化鐵，起初其被用于標記淋巴細胞，主要用于一些有關(guān)免疫研究的示蹤，現(xiàn)隨著干細胞研究的進展被廣泛應用于干細胞示蹤中。SIPO具有超順磁性、良好的生物相容性及穩(wěn)定性，但直接標記干細胞時標記率低，因此需通過轉(zhuǎn)染劑介導來提高標記率。周26等人應用多聚賴氨酸作為轉(zhuǎn)染劑。其表面帶大量正電荷，表面帶負電荷的氧化鐵微粒通過靜電作用可與之充分結(jié)合而提高干細胞的磁標記率。Mishra的研究發(fā)現(xiàn)，PLL與SPIO聯(lián)合標記間充質(zhì)干細胞，可顯著提高后者的橫向弛豫率。SPIO標記細胞也有顯著缺點：1.隨著細胞分裂導致子代細胞內(nèi)SPIO含量降低，進而影響觀察效果。2.細胞死亡后SPIO又有被周圍未被標記的細胞吞噬而產(chǎn)生假陽性的可能。3.高劑量SPIO標記細胞時會降低細胞活性。

結(jié)論

骨髓間充質(zhì)干細胞分化潛能高，增殖能力強，目前被當作種子細胞廣泛應用于組織修復及基因治療中。其標記示蹤技術(shù)眾多且均具有一定的優(yōu)缺點，所選用的標記方法應具有特異性強、靈敏度高、對細胞或生物影響小等優(yōu)點。而科技工作者也在不斷改進更新示蹤方法，骨髓間充質(zhì)干細胞的示蹤技術(shù)仍有待于進行進一步的研究。

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