結核分枝桿菌感染的實驗室診斷方法及檢測技術研究進展

譚偉芬 付少萍

摘要：結核分枝桿菌感染內(nèi)科最常見的感染性疾病，該感染會侵犯全身各器官，其中以肺結核最為常見，隨著近年來醫(yī)療檢驗技術的進步，結核分枝桿菌感染的實驗室診斷及檢測技術不斷優(yōu)化，為疾病早期大規(guī)模快速檢測帶來極大便利。鑒于此，文章就近兩年所發(fā)表的結核分枝桿菌感染的實驗室診斷方法及檢測技術文獻結合我院實際治療開展情況做如下總結。

關鍵詞：結核分枝桿菌感染;實驗室診斷;檢測技術;研究進展

【中圖分類號】 R730.43 【文獻標識碼】 A? ? ? 【文章編號】2107-2306（2022）10--01

結核分枝桿菌感染引起的結核病是全球范圍流行的疾病，臨床數(shù)據(jù)顯示結核病是世界十大死亡原因之一，WHO數(shù)據(jù)顯示目前全球范圍內(nèi)結核病患者數(shù)量約為2000萬人，因此結核分枝桿菌感染的診療一直是臨床研究的重要方向[1]。隨著近年來醫(yī)療檢驗技術的進步及對疾病研究的深入，結核分枝桿菌感染的實驗室診斷方法及檢測技術已逐漸成熟，涂片鏡檢、免疫血清學檢查、培養(yǎng)法、分子生物學檢測等檢查技術開始廣泛應用并在實際應用中發(fā)揮著較為理想的診斷效果。本文就目前我國臨床對于結核分枝桿菌感染實施的實驗室診斷方法及檢測技術開展情況做以下綜述，現(xiàn)報道如下：

1.涂片鏡檢技術

涂片鏡檢技術在生物學及免疫學基礎上建立的檢測技術，包括萋-尼氏抗酸染色和熒光染色鏡檢，后者的敏感度優(yōu)于前者。但該技術在實際應用中尚存在一定缺陷，原因在于肺結核患者中約40%-60%為菌陰肺結核，應用涂片鏡檢技術抗酸染色的陽性率相對較低，因此該技術往往無法有效探查菌落;另外該技術檢查結核分枝桿菌感染敏感度相對較低，通常需要平均每毫升5000-10000條抗酸菌才可得出陽性結果[2]。

2.細菌培養(yǎng)法

分枝桿菌培養(yǎng)和菌種鑒定是目前臨床針對結核分枝桿菌感染最精確可靠的檢查，已成為該細菌感染疾病診斷的“金標準”，其中固定培養(yǎng)法是指以雞蛋為基礎，在高溫凝固形成的兩個培養(yǎng)基中實施分枝桿菌培養(yǎng)，一般可在2-3周內(nèi)出現(xiàn)細菌生長;液體培養(yǎng)法的優(yōu)勢在于液體培養(yǎng)基內(nèi)營養(yǎng)豐富，細菌可在液體中于營養(yǎng)物質充分接觸，因此該技術能有效縮短培養(yǎng)時間，正常情況下可在1-2周內(nèi)出現(xiàn)細菌生長。

3.血清學檢查

血清學檢查是結核分枝桿菌感染重要的輔助檢查方法，該檢查具有推廣難度小、操作簡便、無需精密儀器等優(yōu)點。隨著近年來檢測技術的進步，血清學檢查結核分枝桿菌感染受到廣泛重視、聯(lián)合應用結核抗原、酶聯(lián)免疫斑點技術、蛋白芯片技術開始逐漸推廣應用。其中酶聯(lián)免疫斑點技術是上述疾病實驗室診斷及檢測技術發(fā)展最為迅速的部分，該技術的原理是抗體捕獲培養(yǎng)中的細胞分泌的細胞予以酶聯(lián)斑點顯色方式表達。

目前臨床上最常用的方法為IGRAs，基本原理是MTB感染者體內(nèi)致敏的T淋巴細胞，在體外再次接受MTB特異性抗原刺激后，激活的效應T淋巴細胞能夠產(chǎn)生特異性IFN-γ，通過對IFN-γ的檢測判斷是否存在MTB感染。根據(jù)檢測技術和操作程序的不同，IGRAs方法有2類：（1）以基于酶聯(lián)免疫吸附試驗法（ELISA）檢測全血中MTB特異性抗原刺激后釋放的IFN-γ水平;（2）采用酶聯(lián)免疫斑點法（ELISPOT）檢測在MTB特異性抗原刺激下，外周血單個核細胞中釋放IFN-γ的效應T淋巴細胞數(shù)目。

4.結核菌素皮膚試驗

結核菌素皮膚試驗又被稱為PDD皮膚實驗，該技術主要采用結核分枝桿菌的純蛋白衍生物實施前臂內(nèi)側皮膚注射，再通過觀察受檢者局部皮膚是否出現(xiàn)紅腫硬結，但由于我國國民大多接種了卡介苗，故單純依靠結核菌素皮膚試驗或難以判斷是自然感染或卡介苗的免疫應答反應，并受患者免疫狀態(tài)及部分非結核分枝桿菌感染的影響可能出現(xiàn)假陰性或假陽性，在實際應用中需綜合使用其他檢查，以此提升診斷效力。

5.分子生物學檢測

PCR檢查主要利用體外擴增技術檢查結核分枝桿菌，是目前臨床針對結核分枝桿菌感染應用率最高的基因檢查技術。（1）GeneXpert結核分枝桿菌（MTB）技術是由美國Cepheid公司研發(fā)的一套半巢式實時熒光定量PCR體外診斷技術。以利福平耐藥基因rpoB基因為靶向基因，可在2h內(nèi)同時檢測MTB和對利福平是否耐藥。該方法于2010年由WHO推薦用于肺結核的診斷，2013年WHO又推薦其用于肺外結核的診斷。目前GeneXpert結核分枝桿菌（MTB）技術廣泛應用于臨床，成為診斷結核病重要的檢測手段，大大地提高了病原學陽性率，初步判斷患者耐藥情況，指導臨床抗結核治療方案。該檢查具有更高的簡便性及特異性，能最大限度避免交叉感染，進而提升診斷的精準度。而Xpert MTB/RIF Ultra是新一代檢測技術，靶基因增加了IS6110和IS1081，其敏感度優(yōu)于Xpert MTB/RIF。（2）交叉引物擴增技術（cross-priming amplification，CPA）：采用IS6110基因為靶基因。在成人結核病檢測的敏感度為72%。WHO于2018年在全球結核病報告中介紹了該方法，認為其可作為Xpert MTB/RIF的替代方法，在結核病的診斷中具有潛在價值。（3）分子線性探針測定法：該技術主要利用核酸擴增和反向雜交技術，將不同靶基因的特異性探針置于紙條上，進行一系列的反應。該方法可以鑒別MTBC和NTM，并進行耐藥相關基因檢測，敏感度（92.9%）和特異度（99.3%）高;WHO推薦GenoTypeMTBDR為MDR-TB的快速診斷方法[4]。

高通量測序技術：采用高通量測序平臺對臨床標本或陽性培養(yǎng)物中的核酸進行靶向測序或全基因組測序，通過將測序數(shù)據(jù)與數(shù)據(jù)庫序列比對明確是否存在MTB特異性序列，獲得MTB的耐藥基因突變情況，從而進行診斷和/或耐藥性預測。WHO在2018年的技術指南中指出，高通量測序技術可以作為檢測耐藥結核病的病原學新方法，并建議在有條件的地區(qū)予以推廣。其局限性為檢測步驟復雜，周期較長，費用高;檢測結果易受人源宿主及環(huán)境物種遺傳物質的干擾。近年來快速發(fā)展的宏基因檢測技術因其不依賴于已知核酸序列，無需特殊探針設計，可直接對未知病原微生物進行檢測，打破了傳統(tǒng)微生物檢驗的局限性，一代宏基因檢測只能測量單一的序列，最長可測得1000-1500bp;二代宏基因檢測能測得大量序列，但片段被限制在250-300bp;三代宏基因檢測能測最長可測得10kb[5]。

6.病理學檢查

典型的病變由融合的上皮樣細胞結節(jié)組成，中心為干酪樣壞死，周邊可見朗格漢斯巨細胞，外層為淋巴細胞浸潤和增生的纖維結締組織[6]。主要病理變化包括滲出性病變、增生性病變和壞死性病變，這3種病理變化?；祀s存在，并相互轉化。組織病理學檢查對于結核病有確診價值，但若病理改變中未找到MTB，需要結合臨床和影像學特點以除外真菌感染等疾病引起的肉芽腫改變。病理組織的獲取方法：肺組織、胸內(nèi)淋巴結可通過內(nèi)鏡檢查、外科手術、尸檢時獲得。病理結果陽性判定：（1）組織形態(tài)學符合結核病病理基本變化;（2）病理分子生物學鑒定為MTB[7]。

7.小結

隨著現(xiàn)代醫(yī)療檢驗技術的進步，結核分枝桿菌感染的實驗室診斷方法及檢測技術越發(fā)成熟，涂片鏡檢技術、分子生物學檢測、細菌培養(yǎng)法、血清學檢查、結核菌素皮膚試驗在其中發(fā)揮著重要作用，但各項檢測手段實施需根據(jù)臨床實際情況進行選用，后續(xù)研究需在聯(lián)合運用各項檢測手段的前提下為患者提供最具效力的病理診斷，最大限度提升結核分枝桿菌感染的診斷精確率及診斷效率。

參考文獻：

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[2]中國防癆協(xié)會.高危人群結核分枝桿菌潛伏感染檢測及預防性治療專家共識[J].中國防癆雜志，2021，43（9）：874-878.

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[7]王新剛，衛(wèi)建民，楊俊松，等.結核分枝桿菌/利福平耐藥實時熒光定量核酸擴增檢測技術在脊柱結核檢測中的應用[J].頸腰痛雜志，2021，42（6）：875-877.