人血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(ACE2)BAC 轉(zhuǎn)基因小鼠模型的制備及鑒定

朱孟敏 劉玲玲 牛博文彭秀華陳麗香秦波音楊華李峰*

(1.上海市公共衛(wèi)生臨床中心,上海 201508;2.上海市新發(fā)再現(xiàn)傳染病研究所,上海 201508)

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(ACE2)是近年來肆虐全球疫情新冠病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2) 的功能宿主受體,由ACE2 功能基因編碼翻譯的蛋白質(zhì)屬于二肽基羧基二肽酶血管緊張素轉(zhuǎn)化酶家族[1]。人血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(hACE2)基因位于人的X 染色體,編碼805 個(gè)氨基酸殘基,屬于Ⅰ型跨膜糖蛋白,相對(duì)分子質(zhì)量為120 × 103。基因編碼區(qū)較大,長達(dá)41 572 bp,目前有關(guān)hACE2 基因的表達(dá)調(diào)控元件研究如火如荼[2-4]。通過基因序列同源性比對(duì),人的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶1 與血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2 有著較大的相似性[5]。ACE2 在維持體液平衡、血壓的穩(wěn)定、炎癥浸潤和細(xì)胞增殖等方面有著非常重要的作用,同時(shí)ACE2 在腎、腸道以及生殖泌尿系統(tǒng)特異性表達(dá)意味著其在調(diào)節(jié)上述器官方面也起到不同的作用[6]。此外,最為重要的是該基因編碼蛋白是SARS 病毒糖蛋白的功能受體,該病毒的棘突Spike 蛋白(S 蛋白)可以和人類細(xì)胞表面的ACE2 受體特異性結(jié)合,造成宿主細(xì)胞內(nèi)感染,從而導(dǎo)致人體內(nèi)的細(xì)胞因子風(fēng)暴和級(jí)聯(lián)免疫反應(yīng)[7]。

近幾年,hACE2 人源化小鼠模型已成為研究新冠病毒SARS-CoV-2 最具可靠的動(dòng)物模型,其在新冠疾病入侵途徑、病變經(jīng)過、發(fā)病機(jī)制和特效藥物篩選等熱門研究領(lǐng)域扮演著不可或缺的工具載體[8]。目前,hACE2 人源化小鼠模型構(gòu)建策略主要有3 種形式:(1)通過CRISPR-Cas9 基因編輯技術(shù)將鼠源部分序列或者胞外區(qū)全部替代為對(duì)應(yīng)的人源序列結(jié)構(gòu),這樣的目的是能夠?qū)⒉迦氲娜嗽葱蛄邪l(fā)揮最大的作用,并且在不影響小鼠正常生理功能的情況下,使人ACE2 的表達(dá)能夠充分。(2)在使用人類角蛋白18(cytokeratin 18,K18)啟動(dòng)子作為調(diào)控和驅(qū)動(dòng)hACE2 時(shí),將安全島H11 的位點(diǎn)進(jìn)行過表達(dá)的處理,該手段的主要目標(biāo)是用于模擬人類易感新冠病毒的感染研究。(3)通過全長替換的方式,將鼠源的ACE2 全長序列替換為對(duì)應(yīng)的人源ACE2序列[9]。以上3 種構(gòu)建策略在目的基因ACE2 的表達(dá)水平上可能有所不同,而且使用不同物種的啟動(dòng)子也會(huì)影響上述目的基因的表達(dá)。我們的策略是將人的ACE2 功能基因、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和相關(guān)的調(diào)控序列全部引入到小鼠基因組中,不去除鼠源ACE2 的相關(guān)類似的區(qū)域,觀察在后期基因表達(dá)和組織蛋白水平的情況,尤其是研究人源的ACE2 調(diào)控序列在小鼠體內(nèi)發(fā)揮的作用。

本文利用長片段BAC 質(zhì)粒隨機(jī)整合的方法,將包含有人的ACE2 功能基因、啟動(dòng)子和相關(guān)調(diào)控序列引入到小鼠基因組中,不僅可以研究人的ACE2 目的功能基因和蛋白在腸道、腎小管和肺血管內(nèi)皮細(xì)胞組織中的表達(dá)水平,而且能夠比較不同調(diào)控序列的長度是否影響功能基因的蛋白表達(dá)水平。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

體重15～18 g 的4 周齡C57BL/6J 雌鼠10 只,體重20～25 g 的12 周齡C57BL/6J 雄鼠10 只,體重25～30 g 的6～8 周齡ICR 雌鼠30 只及體重35～40 g 的3 月齡ICR 雄鼠15 只均為SPF 級(jí)動(dòng)物,購自上海吉輝實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)有限公司【SCXK(滬)2017-0012】。轉(zhuǎn)基因陽性小鼠為上海市公共衛(wèi)生臨床中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部【SCXK(滬)2020-0002】保種品系。實(shí)驗(yàn)用鼠均飼養(yǎng)于上海市公共衛(wèi)生臨床中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部【SYXK(滬)2020-0019】SPF 動(dòng)物設(shè)施內(nèi)。飼養(yǎng)室內(nèi)光照為12 h 明暗交替,濕度40%～60%,溫度22～25℃。動(dòng)物操作要求符合上海市公共衛(wèi)生臨床中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理要求【公衛(wèi)倫審2020-D069-01 號(hào)】。

1.1.2 主要試劑與儀器

BAC 質(zhì)粒(BACPAC 資源中心,RP11-478H11),M16 培養(yǎng)液(Merk,M7292-100 ML),M2培養(yǎng)液(Merk,M7176-100 ML),透明質(zhì)酸酶(Merck,H1136),孕馬血清促性腺激素(寧波第二激素廠,PMSG)人絨毛膜促性腺激素(寧波第二激素廠,HCG),動(dòng)物基因組DNA 小量提取試劑盒(上海萊楓,DK611-02),EasyPure RNA Kit 試劑盒(北京全式金,ER201-01),反轉(zhuǎn)錄試劑盒(上海翊圣,11123ES60),qPCR 試劑盒(上海翊圣,11201ES03/08/60),Anti-ACE2 抗體(Abcam,ab108209)。

Leica 組織切片機(jī)(Lecia CM1950,德國),顯微操作系統(tǒng)(eppendorf,德國),倒置顯微鏡(Leica,德國),拉針儀(SUTTER,美國),體式顯微鏡(奧林巴斯,日本),高速冷凍離心機(jī)(Thermo,美國),臺(tái)式搖床(春蘭儀器,中國),PCR 儀(eppendorf,德國),生化培養(yǎng)箱(上海一橫,中國),qPCR 儀(杭州博日,中國),電泳儀/電泳槽(上海天能科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 BAC 質(zhì)粒的純化

商品化BAC 質(zhì)粒RP11-478H11 (序列號(hào):AC097625.11)全長194 492 bp,包含hACE2 基因及其調(diào)控序列。將上述BAC 質(zhì)粒菌種接種到100 mL氯霉素抗性LB 培養(yǎng)液中,32℃過夜振蕩培養(yǎng)16～20 h。用質(zhì)粒提取試劑盒抽提BAC 質(zhì)粒,用限制性內(nèi)切酶切并進(jìn)行脈沖場凝膠電泳鑒定,脈沖場凝膠電泳參數(shù)為電壓:6 V/cm、脈沖角度:120℃、轉(zhuǎn)換時(shí)間:1～25 s、條帶范圍:2～300 kb、電泳時(shí)間:18 h。將鑒定正確的BAC 質(zhì)粒在透析液(濃度為0.5 mL的1 mol/L Tris-HCl、10 μL 的0.5 mmol/L EDTA 和1 mL 的5 mol/L NaCl 用無菌水定容到50 mL)中過夜透析純化,將BAC 質(zhì)粒溶液稀釋到1～3 ng/μL注射備用。

1.2.2 人源化BAC 轉(zhuǎn)基因小鼠獲得

利用拉針儀制備注射針(外徑:1.0 mm,內(nèi)徑:0.78 mm,長度:10 cm)和固定針(外徑:1.5 mm,內(nèi)徑:1.1 mm,長度:10 cm),固定針口為外徑100～120 μm,內(nèi)徑20～30 μm 左右,最后彎針角度15°備用。用注射針將稀釋的BAC 質(zhì)粒注射到胚胎的雄原核內(nèi),看到原核內(nèi)部膨大為止,最后轉(zhuǎn)移至M16培養(yǎng)液中培養(yǎng)。于第1 日16:00,將4 周齡C57BL/6J 雌鼠按每只5U 腹腔注射PMSG,飼養(yǎng)47 h 后,按每只5U 腹腔注射HCG 并與種公鼠合籠過夜。第4天9:00 輸卵管膨大部收集受精卵進(jìn)行顯微注射。用注射針將稀釋的BAC 質(zhì)粒注射到胚胎的雄原核內(nèi),看到原核內(nèi)部膨大為止,最后轉(zhuǎn)移至M16 培養(yǎng)液中培養(yǎng)。

胚胎移植:取0.5 d 假孕ICR 受體鼠,麻醉,剔除背部毛發(fā),酒精及碘酊消毒,剪開脊柱背側(cè)皮膚,剪開脊柱兩側(cè)0.5 cm 處肌肉層,用鈍頭鑷子夾住脂肪墊拉出附帶的卵巢及輸卵管,用脂肪夾固定,在體視顯微鏡下找出輸卵管壺腹部,用1 mL 注射器針頭在壺腹部前側(cè)刺一切口,之后將胚胎經(jīng)此切口吹入輸卵管壺腹部,分別縫合肌肉層及皮膚,碘酊消毒。18 d 后觀察代孕鼠的妊娠分娩情況,將出生7 d的小鼠打耳洞標(biāo)記,并進(jìn)行hACE2 外源基因整合情況鑒定。

1.2.3 轉(zhuǎn)基因小鼠外源基因的檢測

利用表1 中的引物來確定轉(zhuǎn)基因小鼠基因的整合情況。反應(yīng)體系和條件詳見說明書,反應(yīng)結(jié)束后,進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4 絕對(duì)定量法測定外源基因的拷貝數(shù)

使用絕對(duì)定量PCR 法對(duì)各品系F2 代小鼠的的拷貝數(shù)進(jìn)行檢測。按照表1 中的引物進(jìn)行目的基因的測定,具體的步驟如下:以BAC 質(zhì)粒為外源基因拷貝數(shù)測定的標(biāo)準(zhǔn)樣品,將質(zhì)粒濃度稀釋到50 ng/μL,依次10 倍梯度稀釋5 次,最終獲得5 組標(biāo)準(zhǔn)樣品,每個(gè)濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行3 次重復(fù),來保證有效數(shù)據(jù)的可靠性。使用表1 中的引物對(duì)以上的5 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品BAC 質(zhì)粒進(jìn)行qRT-PCR 實(shí)驗(yàn)。反應(yīng)體系和條件詳見說明書,上述實(shí)驗(yàn)每組設(shè)置3 個(gè)平行的樣本。獲得的Ct 值通過公式生成的絕對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線,從而得到轉(zhuǎn)基因小鼠ACE2 的拷貝數(shù)濃度。

1.2.5 相對(duì)定量PCR 法檢測hACE2、BMX、PIR 和Inc 基因的表達(dá)量

收集各品系轉(zhuǎn)基因小鼠的相應(yīng)組織,進(jìn)行RNA提取和cDNA 制備,使用qPCR 試劑盒Hieff ?qPCR SYBR? Green Master Mix(No Rox)進(jìn)行熒光定量PCR。反應(yīng)體系及儀器操作步驟詳見說明書。所獲得的Ct 值與對(duì)照組進(jìn)行比較分析。以上qRTPCR 實(shí)驗(yàn)中均設(shè)置3 個(gè)平行樣品,并通過3 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)獲得結(jié)果。

1.2.6 Western Blot 檢測hACE2 蛋白表達(dá)

將組織剪碎勻漿后,離心取上清,并測定上樣蛋白濃度。準(zhǔn)備蛋白電泳的試劑物品,按順序在梳子孔內(nèi)加入蛋白樣品。濃縮膠電壓用90 V,分離膠電壓用120 V,待溴酚藍(lán)快到底部時(shí)停止電泳。之后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜,將PVDF 膜用甲醇透膜,安裝轉(zhuǎn)膜裝置結(jié)構(gòu)到電泳槽中,電泳儀調(diào)至恒流,220 mA,1 h。轉(zhuǎn)膜完成后,取出PVDF 膜,去除多余的膜,標(biāo)記好正反面。孵育一抗(1 ∶500,4℃過夜)和二抗(1 ∶5000,室溫1～2 h),TBST 洗膜3 次,打開化學(xué)ECL發(fā)光系統(tǒng),用鑷子將膜轉(zhuǎn)移至發(fā)光用平板上,滴加ECL 發(fā)光液,在化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)中曝光觀察,根據(jù)條帶情況適當(dāng)調(diào)節(jié)曝光時(shí)間,保存圖片。

1.2.7 免疫熒光檢測hACE2 蛋白分布

組織的固定及包埋:新鮮組織取材后立刻置于組織固定液中,4℃固定過夜。固定組織PBS 沖洗3遍后,置于30%蔗糖溶液中,4℃冰箱中放置,直至組織塊完全沉淀于溶液底部。將組織塊取出按正確方向放在包埋盒中,加入OCT,置于液氮蒸汽中速凍,待OCT 完全凝固,放入-80℃冰箱保存待用。

切片及免疫熒光染色:對(duì)固定的組織塊進(jìn)行連續(xù)切片,每張厚度為10 μm,做好標(biāo)記,-20℃保存?zhèn)溆谩Ｈ〕銮衅?0℃烘片15 min,PBS 中漂洗3 次,每次10 min;0.3% TritonX-100 中1:10 加入H2O2溶液避光處理15 min;PBS 漂洗3 次,每次10 min;1% BSA+1%馬血清室溫下封閉2 h;加入一抗ACE2(1 ∶400),4℃放置48 h;去除一抗,PBS 漂洗3 次,每次10 min;加入連有熒光素的相應(yīng)的二抗,室溫避光孵育2 h;PBS 漂洗3 次,每次10 min;DAPI 染色10 min;PBS 漂洗3 次,每次10 min;甘油封片,激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 11.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)值以平均值± 標(biāo)準(zhǔn)差()的方式顯示。用單因素方差分析(ANVOA)進(jìn)行q檢驗(yàn)。組間比較用方差分析,P＜0.05 為差異具有顯著性,P＜0.01 為差異極具有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 各品系小鼠整合及拷貝數(shù)測定

基因拷貝數(shù)檢測(圖1A)顯示,hACE2-15-1 拷貝數(shù)最高,而hACE2-14-3 最低。分別在5’UTR、3’UTR、編碼區(qū)設(shè)計(jì)鑒定引物(圖1B),將獲得的F0 代小鼠基因組進(jìn)行PCR 鑒定,共獲得4 只陽性首建鼠,分別與C57BL/6J 小鼠進(jìn)行雜交育種獲得4 個(gè)品系,除hACE2-ident30KB-3UTR 在hACE2-14-3 品系未能擴(kuò)增出目的條帶,其他引物均能在4 個(gè)hACE2 轉(zhuǎn)基因小鼠基因組中擴(kuò)增出單一明亮的條帶(圖1C),基因整合情況如圖1B所示。

圖1 外源基因檢測、拷貝數(shù)鑒定及在整合片段在BAC 上的位置Note.A.Four transgenic mice copy number histogram of foreign gene hACE2.B.PCR map of genome identification of four transgenic mice.C.The position of four transgenic mouse integration fragments on BAC.Figure 1 Foreign gene detection,copy number identification and position of integrated fragment on BAC

2.2 相對(duì)熒光定量PCR 法檢測小鼠腸道四段中hACE2 基因表達(dá)水平

相對(duì)熒光定量PCR 結(jié)果顯示,十二指腸、空腸、回腸和結(jié)腸中,hACE-14-3 小鼠品系hACE2 mRNA表達(dá)最高,hACE2-6-9 最低,其余兩個(gè)品系差異不大(圖2)。hACE2-6-9 和hACE-14-3 品系在腸道四段中人的ACE2 的mRNA 的相對(duì)表達(dá)量差異極具顯著性(P＜0.01)。hACE-14-3 與hACE2-15-1 在十二指腸和回腸中,mRNA 的相對(duì)表達(dá)量差異具有顯著性(P＜0.05),空腸和結(jié)腸中,在mRNA 的相對(duì)表達(dá)量差異極具顯著性(P＜0.01)。hACE-14-3 與hACE2-15-2 在十二指腸中,mRNA 的相對(duì)表達(dá)量差異具有顯著性(P＜0.05),而在回腸中,無顯著性差異,在空腸和結(jié)腸中,mRNA 的相對(duì)表達(dá)量差異極具顯著性(P＜0.01)。

圖2 十二指腸、空腸、回腸和結(jié)腸中hACE2 的mRNA 相對(duì)表達(dá)水平Note.A.mRNA expression in duodenum of four transgenic mice.B.MRNA expression of four transgenic mice in jejunum.C.MRNA expression in ileum of four transgenic mice.D.MRNA expression of four transgenic mice in colon.Compared with hACE2-14-3,*P ＜0.05,**P ＜0.01.Figure 2 Relative expression levels of hACE2 mRNA in duodenum,jejunum,ileum and colon

2.3 Western Blot 檢測小鼠腸道四段hACE2 蛋白的表達(dá)

在轉(zhuǎn)基因hACE2 小鼠的腸道四段組織中,hACE2-14-3 的hACE2 蛋白表達(dá)水平最高,hACE2-15-1 次之,其他2 個(gè)小鼠品系未檢測相關(guān)蛋白的表達(dá)(圖3)。其中,在十二指腸組織中,hACE2-14-3 有微量的hACE2 蛋白表達(dá),其他品系在小鼠中未檢測到相關(guān)蛋白的表達(dá)(圖3A)。在空腸組織中,hACE2-14-3 的蛋白表達(dá)水平最高,其他品系在小鼠中未檢測到相關(guān)蛋白的表達(dá)(圖3B)。在回腸組織中,hACE2-14-3 的蛋白表達(dá)水平依然最高,hACE2-15-1 次之,其他品系在小鼠中未檢測到相關(guān)蛋白表達(dá)(圖3C)。在結(jié)腸組織中,hACE2-14-3 的hACE2 蛋白表達(dá)水平最高,其他品系基本無表達(dá)(圖3D)。

圖3 十二指腸、空腸、回腸和結(jié)腸中hACE2 蛋白的相對(duì)表達(dá)水平Note.A.Expression of hACE2 protein in duodenum of four transgenic mice.B.Expression of ACE2 protein in jejunum of four transgenic mice.C.Expression of ACE2 protein in ileum of four transgenic mice.D.Expression of ACE2 protein in colon of four transgenic mice.Figure 3 Relative expression levels of hACE2 protein in duodenum,jejunum,ileum and colon

2.4 相對(duì)定量PCR 法測定小鼠空腸和結(jié)腸中hACE2 基因座其他3 個(gè)基因的表達(dá)水平

圖4A 是在4 個(gè)品系小鼠空腸和結(jié)腸組織的BMX 基因mRNA 的表達(dá)水平,其中hACE2-15-1的BMX 基因在空腸中mRNA 表達(dá)水最高,hACE2-6-9 表達(dá)最低,結(jié)腸組織中,hACE2-15-2的表達(dá)最高,hACE2-6-9 的表達(dá)依然最低。圖4B是在4 個(gè)品系小鼠空腸和結(jié)腸組織的PIR 基因mRNA 的表達(dá)水平,其中hACE2-15-2 的PIR 基因在空腸中mRNA 表達(dá)水最高,而hACE2-15-1表達(dá)最低,在結(jié)腸組織中,hACE2-6-9 的表達(dá)最高,hACE2-15-1 的表達(dá)最低。圖4C 是在4 個(gè)品系小鼠空腸和結(jié)腸組織的Inc 基因mRNA 的表達(dá)水平,其中hACE2-15-2 的Inc 基因在空腸中mRNA 表達(dá)水最高,hACE2-6-9 表達(dá)最低,在結(jié)腸組織中,hACE2-15-2 的表達(dá)最高,hACE2-15-1 的表達(dá)最低。

圖4 空腸和結(jié)腸中3 種mRNA 剪切形式基因的表達(dá)水平Note.A.Expression level of BMX gene mRNA in jejunum and colon of four transgenic mice.B.Expression level of PIR gene mRNA in jejunum and colon of four transgenic mice.C.Expression level of Inc gene mRNA in jejunum and colon of four transgenic mice.Figure 4 Gene expression levels of three mRNA cleavage forms in jejunum and colon

2.5 免疫熒光檢測腎小管和肺血管內(nèi)皮細(xì)胞中hACE2 的分布

免疫熒光染色結(jié)果顯示,以對(duì)照組hACE2-15-1腎小管未加抗體為參照,可見實(shí)驗(yàn)組hACE2-15-1 腎小管中有較為豐富的的hACE2 的蛋白表達(dá)(圖5a,5b,5c,5d,5e,5f)。在實(shí)驗(yàn)組肺血管內(nèi)皮細(xì)胞中,如紅色箭頭所示,hACE2 均勻的表達(dá)分布在血管內(nèi)皮細(xì)胞中(圖5g,5h,5i),對(duì)照組小鼠品系在肺血管內(nèi)皮細(xì)胞中hACE2 則無表達(dá)(圖5j,5k,5l)。

圖5 hACE2-15-1 腎小管和肺血管內(nèi)皮細(xì)胞中hACE2 的免疫熒光Figure 5 hACE2-15-1 immunofluorescence of ACE2 in vascular endothelial cells of renal tubules and lungs

3 討論

SARS-CoV-2 感染小鼠模型是有效解決新冠病毒入侵人體后,病毒的復(fù)制增殖、致病機(jī)制機(jī)理和疫苗藥物研發(fā)的重要研究工具和手段[10]。ACE2 人源化轉(zhuǎn)基因小鼠可能作為有價(jià)值的SARS-CoV、SARS-CoV-2 易感動(dòng)物模型。目前已報(bào)道多種ACE2人源化轉(zhuǎn)基因小鼠。研究結(jié)果顯示這些hACE2 人源化轉(zhuǎn)基因小鼠存在諸多缺陷[11]。CAG 復(fù)合啟動(dòng)子全身性普遍表達(dá)hACE2 基因,CK18 啟動(dòng)子在上皮細(xì)胞表達(dá)hACE2 基因,這兩種轉(zhuǎn)基因小鼠不能模擬hACE2 基因的真實(shí)表達(dá)情況[12]。小鼠Ace2 啟動(dòng)子由于不能含有全部的小鼠Ace2 基因調(diào)控區(qū)而只能部分模擬鼠源性hACE2 基因的表達(dá)[13]。Donoghue 等[14]制作在心臟特異性表達(dá)hACE2 的人源化轉(zhuǎn)基因小鼠,ACE2 超表達(dá)引起心臟傳導(dǎo)異常及室性心律失常。感染實(shí)驗(yàn)顯示hACE2 轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平和病毒感染后病理變化程度直接相關(guān),即hACE2 轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平嚴(yán)重影響SARS-CoV 病毒復(fù)制水平及感染后組織病理變化。接近生理性表達(dá)水平的hACE2 人源化轉(zhuǎn)基因小鼠預(yù)期更有利于心血管疾病以及新冠肺炎(COVID-19)發(fā)病分子機(jī)制研究和相關(guān)藥物研發(fā)[15]。我們利用含有194 kb 的hACE2 基因座位點(diǎn)的細(xì)菌人工染色體(BAC),結(jié)合小鼠原核顯微注射技術(shù),成功制備4 個(gè)含有全長hACE2 基因序列的人源化BAC 轉(zhuǎn)基因小鼠品系。人源化小鼠含有完整的hACE2 基因調(diào)控序列,包括hACE2 5’-UTR、3’-UTR 以及全部的內(nèi)含子區(qū)和外顯子區(qū)。這些人源化小鼠均攜帶包括rs2074192、rs6632677、rs4646142、rs4240157、rs2048683 在內(nèi)的人ACE2 的5 個(gè)SNP 突變位點(diǎn),保留完整的人hACE2 啟動(dòng)子及基因調(diào)控區(qū),從而為心血管疾病、新冠肺炎發(fā)病機(jī)制研究、hACE2 基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制研究和藥物、疫苗的研發(fā)提供重要工具。

人ACE2 基因表達(dá)調(diào)控比較復(fù)雜,受諸多因素影響。高血壓和糖尿病小鼠腎內(nèi),ACE2 的蛋白表達(dá)下調(diào)。Zisman 等[16]發(fā)現(xiàn),在人特發(fā)性擴(kuò)張型心肌病的終末期心臟中,ACE2 的表達(dá)明顯增加。Kuba等[17]發(fā)現(xiàn),在急性肺損傷小鼠動(dòng)物模型中,ACE2 表達(dá)明顯減少。Koitka 等[18]發(fā)現(xiàn),ACE2 在腎病和腎次全切除大鼠體內(nèi)的表達(dá)明顯減少。RAAS 抑制劑,包括血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑或血管緊張素Ⅱ型受體拮抗劑可以上調(diào)ACE2 mRNA 水平[19]。近期研究表明ACE2 可能參與了SARS-CoV-2 感染人體誘發(fā)多臟器損傷過程,其可能的機(jī)制是SARSCoV-2 結(jié)合ACE2 后,通過不明機(jī)制下調(diào)人體細(xì)胞中ACE2 含量,失調(diào)ACE-Ang II-AT1R 軸和ACE2-Ang 1-7-Mas 軸之間的平衡,Ang 1-7 水平下降,而Ang II 表達(dá)絕對(duì)或是相對(duì)升高,使細(xì)胞因子(尤其促炎因子)表達(dá)升高,誘發(fā)炎癥風(fēng)暴,出現(xiàn)全身炎癥反應(yīng)[20]。本研究制備的幾個(gè)小鼠品系,我們對(duì)腸道中ACE2 的表達(dá)進(jìn)行較深入的研究,hACE2-14-3 小鼠品系整合最短的3’UTR 區(qū)域,檢測腸道四段的mRNA 水平和蛋白表達(dá)量發(fā)現(xiàn),與其他未丟失3’UTR 區(qū)域的小鼠品系相比ACE2 表達(dá)產(chǎn)物要高,表明3’UTR 基因組區(qū)域可能存在腸道特異性表達(dá)的調(diào)控序列。

目前研究發(fā)現(xiàn),自然SARS-Cov-2 僅可感染樹鼩、雪貂、非人靈長類等動(dòng)物,對(duì)小鼠無法感染,故ACE2 轉(zhuǎn)基因人源化小鼠普遍被應(yīng)用于SARS-Cov-2等臨床研究。常見的ACE2 轉(zhuǎn)基因鼠有多種,包括以小鼠ACE2 啟動(dòng)子、CMV、HFH4、或K18 啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)人ACE2 cDNA 表達(dá)的轉(zhuǎn)基因鼠,以及小鼠ACE2部分片段人源化的基因敲入小鼠,這些小鼠模型在感染SARS-Cov-2 病毒以后均出現(xiàn)不同程度的臨床癥狀,但與人臨床癥狀還有一定的差異,這可能與轉(zhuǎn)基因小鼠中hACE2 的表達(dá)調(diào)控與人存在差異有關(guān)。本研究制備的BAC 轉(zhuǎn)基因人源化小鼠含有較完整的ACE2 啟動(dòng)子區(qū)域及增強(qiáng)子區(qū),相比于傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因鼠或者基因敲入小鼠,能夠更好地在小鼠體內(nèi)模擬人ACE2 的表達(dá)調(diào)控。且本研究制備的小鼠在腎小管上皮細(xì)胞、肺血管內(nèi)皮細(xì)胞和腸道等組織中均有人ACE2 的表達(dá),與人體中ACE2 的定位相近,是ACE2 基因表達(dá)調(diào)控、心血管疾病和冠狀病毒感染機(jī)制等研究的良好小鼠模型,也為新冠藥物疫苗開發(fā)提供一些數(shù)據(jù)參考。

總之,本研究報(bào)道了1 種全長基因序列的hACE2 人源化BAC 轉(zhuǎn)基因小鼠。該小鼠有以下特點(diǎn):(1)含有全長hACE2 基因序列,包括全部的內(nèi)含子區(qū);(2)含有人源hACE2 基因自身的啟動(dòng)子,且包含hACE2 基因5’-UTR 和3’-UTR 基因表達(dá)調(diào)控區(qū);(3)攜帶包括rs2074192、rs6632677、rs4646142、rs4240157、rs2048683 在內(nèi)的人ACE2 的5 個(gè)SNP突變位點(diǎn),這5 個(gè)SNP 突變位點(diǎn)可能和病毒感染及人群疫苗接種后免疫反應(yīng)有關(guān)聯(lián)。