H1N1 流感病毒樹鼩模型生物學(xué)特性的研究

金亮子 吳芳芳 鄧偉 奎秀瑩 罕園園孫曉梅仝品芬李娜王喜軍代解杰*

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所,昆明 650118;2.昆明醫(yī)科大學(xué),昆明 650500;3.廣西壯族藥用植物園,西南瀕危藥材資源開發(fā)國家工程中心,南寧 530023)

流行性感冒簡稱流感,是由流感病毒引起的急性呼吸道傳染病。流感病毒是一種正黏病毒科負(fù)鏈RNA 病毒,包含8 個具有負(fù)極性的單鏈RNA 分子。該科的5 個屬包括甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒、索戈托病毒和伊薩病毒(傳染性鮭魚貧血病毒)[1]。甲型流感病毒感染最為常見和嚴(yán)重,它在短時間內(nèi)迅速傳播并影響大地理區(qū)域的人口,在1918 年至1919 年的流感大流行期間,估計有三分之一的世界人口、受到感染并患有臨床癥狀明顯的疾病[2]。

流感病毒不斷變異,流感大流行隨時可能爆發(fā),合適的動物模型可以研究流感感染特性及傳播特性,為流感的防控、藥物篩選及疫苗的研究提供工作基礎(chǔ)。動物模型用于模擬復(fù)雜的生物現(xiàn)象和人類疾病特征,多年來,動物模型已成功用于疾病機(jī)理、藥物發(fā)現(xiàn)、靶點(diǎn)驗證和臨床前試驗[3]。流感動物模型提高了我們對疾病發(fā)生發(fā)展機(jī)理和病理生理學(xué)的理解,是闡明流感發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵[4]。小鼠和雪貂常用于流感病毒研究,但也有一定的局限性[5]。小鼠體型較小,不易觀察到疾病的表現(xiàn),許多流感毒株需要提前適應(yīng)才能成功感染小鼠[6]。雪貂模型由于價格高、大小不均、抗體反應(yīng)性差[7],有必要尋求新的流感動物模型,開展疾病的發(fā)生機(jī)制研究具有重要的科學(xué)意義。樹鼩與靈長類動物的親緣關(guān)系比與嚙齒類動物的親緣關(guān)系更近,具有體型小、易于繁殖、成本低等優(yōu)點(diǎn),成為研究人類疾病的理想對象[8]。從傳染病的角度來看,樹鼩容易感染人類病原體,并表現(xiàn)出類似于人類感染的臨床癥狀[9]。因此,本研究通過流感病毒感染樹鼩,探討流感病毒在不同組織中的病毒動力學(xué)及其在各組織中的分布規(guī)律,為其疾病的發(fā)病機(jī)制和藥物研發(fā)提供一種有科學(xué)價值新的動物模型。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗動物

H1N1 流感病毒血清抗體陰性、3～3.5 歲普通級樹鼩(中緬樹鼩滇西亞種)24 只,雌雄各半,體重105～150 g。來源于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所樹鼩種質(zhì)資源中心【SCXK(滇) K2018-0002】,飼養(yǎng)于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所樹鼩種質(zhì)資源中心負(fù)壓獨(dú)立通風(fēng)樹鼩籠具(IVC)中【SYXK(滇)K2018-0002】,飼養(yǎng)環(huán)境溫度控制在20～25℃,濕度控制在40%～70%,人工光照每天12 h,換氣次數(shù)每小時大于15 次。所有操作均符合中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所倫理要求(編號:DWSP202004001)。

1.1.2 細(xì)胞

犬腎上皮細(xì)胞(MDCK 細(xì)胞)購于北納生物。

1.1.3 病毒及感染途徑

H1N1 A/Puerto Rico/8/1934(A/PR/8)流感病毒株由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所劉龍丁教授惠贈。經(jīng)普通級雞胚增殖后收集病毒尿囊液,病毒滴度為1 × 106.8TCID50/0.1 mL,-80℃冰箱儲存?zhèn)溆?實(shí)驗均在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所樹鼩種質(zhì)資源中心BSL-2(生物安全I(xiàn)I 級)實(shí)驗室中進(jìn)行。

保定樹鼩待穩(wěn)定5 min 后,用每只600 μL/(1 ×106.8TCID50/0.1 mL)病毒液通過滴鼻的方式感染樹鼩。

1.1.4 主要試劑與儀器

PBS(Hyclone,美國),病毒RNA 提取試劑盒QIAamp Viral RNA Mini Kit(Qiagen,德國),One Step Prime Script TM RT-PCR Kit(TaKaRa,日本),4%多聚甲醛固定液(美倫生物,中國),普通級1%雞紅細(xì)胞,血凝板(Nunc,丹麥),臺式高速離心機(jī)(Hitachi,CT15RE,日本),實(shí)時定量熒光PCR 儀(BIO-RAD,CFX-96,美國),生物安全柜(Forma,A/B3,美國),切片機(jī)(徠卡,中國)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及實(shí)驗干預(yù)

樹鼩隨機(jī)分為空白組(B 組)和模型組(M 組),每組12 只,感染后觀察10 d。M 組用H1N1 A/PR/8/34 滴鼻方式感染樹鼩,B 組用PBS 滴鼻處理樹鼩。

1.2.2 體溫的測定

每天上午8:30 保定樹鼩后保持5～10 min,待動物穩(wěn)定后測定肛溫。

1.2.3 病毒載量的測定

每天采樹鼩的鼻拭子、咽拭子,用尾靜脈采血法采集外周血樣0.3 mL,使用實(shí)時定量熒光PCR(RT-PCR)絕對定量測定法研究了甲型H1N1 A/PR8/34 流感病毒在感染后1～10 d 的病毒載量的變化情況[10],引物及探針序列見表1。

表1 H1N1 A/PR8/34 引物序列Table 1 H1N1 A/PR8/34 primer sequence

1.2.4 特異性抗體檢測

分別測定感染后2、4、7 和10 d 血清樣品。首先標(biāo)記96 孔微量滴定板,然后用高碘酸鉀(KIO4)處理血清以去除非特異性凝集原。每孔加入25 μL生理鹽水,第1 個空孔加入25 μL 處理過的血清樣品,稀釋至最后一孔,丟棄最后一孔的最后25 μL。每孔(1 ∶1)加入等體積(25 μL)含有4 個血凝單位病毒的生理鹽水,最后加入1%雞紅細(xì)胞懸液50 μL。小心地敲擊滴定板的4 個側(cè)面進(jìn)行混合。在室溫下放置30 min 后讀取抗體滴度[11]。

1.2.5 病理學(xué)檢測

腹腔注射0.4 mL(3%戊巴比妥鈉)安樂死樹鼩,采集鼻甲、咽、氣管和肺組織,4%多聚甲醛固定液固定,石蠟包埋切片,HE 染色鏡下觀察拍照。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)表示為平均值± 標(biāo)準(zhǔn)差(x-±s)。兩組間的數(shù)據(jù)采用獨(dú)立樣本t檢驗,組間比較采用方差分析,組間比較用單因素方差分析。P＜0.05 為具有顯著性差異。GraphPad Prism 7.0 用于繪圖和數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果

2.1 樹鼩的體征及溫度變化

所有樹鼩0 d 的臨床體征均正常,感染后1～7 d,M 組樹鼩出現(xiàn)活動遲緩、被毛蓬亂、食欲減退和鼻咽分泌物增加等的臨床體征,并在9 d 逐漸消失。M 組樹鼩在接種流感病毒株后體溫有所升高,2 d到達(dá)最高為39.2℃。與B 組相比,M 組溫度顯著性升高(P＜0.05),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(見圖1)。

圖1 H1N1 病毒感染樹鼩后的體溫變化Note.Compared with group B,*P ＜0.05.Figure 1 Body temperature of tree shrews infected with H1N1 virus

2.2 樹鼩體內(nèi)的流感病毒復(fù)制

感染后1～10 d 收集樹鼩咽拭子、鼻拭子和血液樣品。鼻拭子中的病毒載量在1～2 d 達(dá)到峰值后開始下降,10 d 略有增加。咽拭子和鼻拭子的病毒載量趨勢大致相同。血液中的病毒載量在3 d 開始出現(xiàn),5 d 到達(dá)最高,且可持續(xù)至10 d(見圖2)。

圖2 H1N1 感染樹鼩后鼻拭子、咽拭子和血清中的病毒載量變化情況Figure 2 Changes on viral load in nasal swabs,pharyngeal swabs and serum of tree shrews infected with H1N1 virus

感染后2 d 鼻甲、咽部、氣管和肺部組織可檢測到病毒載量(約1 × 102～3copies/mL),一直持續(xù)到10,5 d 有明顯的峰值,以肺組織病毒載量表達(dá)最高(見圖3)。

圖3 H1N1 病毒感染樹鼩后不同時間鼻甲、咽、氣管和肺組織的病毒載量變化Figure 3 Changes of viral load in turbinate,pharynx,trachea and lung tissues during different time after infection with H1N1 virus infection in tree shrews

2.3 血清病毒載量及特異性抗體

感染后3 d 血液中可檢測病毒到載量,在5 d 達(dá)到峰值。感染后2 d 開始產(chǎn)生血清抗體,并一直呈上升趨勢,表明病毒感染樹鼩后在體內(nèi)可復(fù)制,呈持續(xù)性感染狀態(tài)后不斷產(chǎn)生血清抗體(見圖4)。

圖4 血液中病毒載量及抗體水平Figure 4 Viral load and antibody levels in blood

2.4 樹鼩組織的病理變化

在感染后3、5 和10 d 取鼻甲、咽、氣管和肺組織進(jìn)行病理檢查(見圖5)。病理結(jié)果顯示,B 組樹鼩的鼻甲、咽、氣管和肺組織未見明顯病理改變(圖5a,5b,5c,5d)。M 組樹鼩的鼻甲3 d 有一定程度的損傷(圖5e),5 d 和10 d 沒有明顯的病理改變(圖5i,5m)。3、5 d 咽組織上皮細(xì)胞壞死、脫落(圖5f,5j),10 d 未見明顯病理改變(圖5n)。感染后3、5、10 d 氣管組織均出現(xiàn)上皮細(xì)胞壞死和脫落(圖5g,5k,5o),隨著感染天數(shù)的增加,損傷逐漸加重。3 d肺組織無明顯病理變化(圖5h),5 d 肺泡壁出現(xiàn)小面積增厚(圖5l),伴有少量的炎性細(xì)胞浸潤,10 d肺泡壁大面積增厚(圖5p),伴有少量的炎性細(xì)胞浸潤。

圖5 H1N1 感染樹鼩后不同時間點(diǎn)鼻甲、咽、氣管和肺組織的病理變化Figure 5 Pathological changes of turbinate,pharynx,trachea and lung tissues of tree shrews infected with H1N1 during different time

組織病理結(jié)果提示,流感病毒經(jīng)上呼吸道感染先損害鼻甲和咽,并逐漸蔓延至氣管和肺,最后導(dǎo)致肺部感染,引起肺組織的病理實(shí)質(zhì)性改變。

3 討論

抗流感病毒藥物和疫苗的研發(fā)都需要合適的動物模型。理想的流感動物模型,需要比較全面的模擬流感疾病的臨床表現(xiàn)及病理變化[12]。目前常用于建立流感模型的動物有雪貂、小鼠和非人靈長類等。雪貂和人類在肺生理學(xué)、細(xì)胞受體分布和感染臨床癥狀方面有相似之處[13],并且易感,主要用于傳播力方面的研究及致病機(jī)制研究,但個體差異較大,價格較貴,商品化試劑少。小鼠成本較低,但小鼠個體較小,不易觀察到疾病的表現(xiàn),并且許多流感毒株需要提前經(jīng)過適應(yīng)之后,才能成功感染小鼠。恒河猴、食蟹猴等其他非人靈長類動物不易操作,價格昂貴,存在一定的倫理方面的制約[14]。本研究選擇樹鼩來建立流感動物模型,在動物出現(xiàn)流感樣的臨床癥狀、血清病毒復(fù)制及抗體和病理變化上進(jìn)行有益的探索。樹鼩是一種小型的非靈長類哺乳動物,樹鼩與人類在生理學(xué)、分類學(xué)、基因組學(xué)及免疫學(xué)等生理生化特性方面的相似性高于常用的雪貂、小鼠等實(shí)驗動物。我們的研究結(jié)果表明,H1N1 A/PR8/34 流感病毒在樹鼩呼吸道能夠有效復(fù)制,在下呼吸道表現(xiàn)出典型的流感癥狀和病理變化,如急性支氣管炎和肺炎[15]。

人流感的臨床癥狀主要以流涕、咳嗽、肌肉酸痛等為主要表現(xiàn)[16]。本研究中發(fā)現(xiàn)流感病毒感染樹鼩后,樹鼩表現(xiàn)主要以鼻腔分泌物增加、流涕為主,也存在被毛蓬亂及精神萎靡;恒河猴及食蟹猴等非人靈長類動物模型臨床表現(xiàn)為流涕,打噴嚏,還有呼吸困難等癥狀[17];小鼠模型表現(xiàn)反應(yīng)遲鈍,豎毛,弓背,食欲減退甚至出現(xiàn)死亡;雪貂模型出現(xiàn)厭食、體重減輕、昏睡等癥狀[18]。相比而言,樹鼩模型表現(xiàn)的臨床癥狀與非人靈長類動物甚至人的表現(xiàn)和程度更為相似。

病毒載量及抗體可以反映病毒復(fù)制與自我防御機(jī)制之間的相互作用[19],高峰通常出現(xiàn)在出現(xiàn)癥狀時[20]。樹鼩感染流感病毒后,鼻、咽拭子在1 d和2 d 達(dá)到高峰,可以達(dá)到1 × 108copise/mL,這與人類感染流感病毒后出現(xiàn)的病毒載量高峰相似[21],與恒河猴感染流感病毒的趨勢相似但有些許不同。恒河猴感染流感病毒后,在1 d 和2 d 達(dá)到高峰,5 d和6 d 再次上升[22]。小鼠感染流感病毒后肺部可能出現(xiàn)肺炎癥狀[23],病毒載量也可以檢測到,但未發(fā)現(xiàn)與人類相似的峰值[24],并且小鼠的臨床癥狀與人類不相似,更容易死亡[25],這是由于小鼠呼吸道中的受體分布及蛋白質(zhì)的相互作用與人類不同所導(dǎo)致的[26]。這從另一個方面反映出樹鼩作為流感動物模型比大鼠和小鼠更接近靈長類動物。根據(jù)臨床的回顧性研究,病毒載量可以在人呼吸道中長期存在[27],這和我們的結(jié)果相一致,在10 d 依然可以鼻甲、咽、氣管及肺中檢測到流感的病毒載量。H1N1 流感病毒的主要感染為氣管支氣管炎,大量病毒附著于氣管和支氣管[28]。因此,我們還檢測了鼻甲、氣管、咽和肺組織中的病毒載量。發(fā)現(xiàn)2 d 即可在鼻甲、氣管、咽組織中測出病毒載量,5 d 達(dá)到峰值,最高可達(dá)到1 × 109copise/mL,各組織病毒載量趨勢一致。說明病毒在次日開始復(fù)制,并逐漸擴(kuò)散至下呼吸道。流感病毒通過直接病毒感染或免疫系統(tǒng)反應(yīng)造成的損害影響呼吸道[29]。肺組織病毒載量在5 d 達(dá)到高峰,同時出現(xiàn)病理損傷。表明流感病毒隨著時間的推移逐漸從上呼吸道傳播到下呼吸道,感染組織器官。之后,病毒載量緩慢下降,因為流感病毒可以感染肺內(nèi)皮細(xì)胞并造成損傷,但提示不能在肺內(nèi)皮細(xì)胞中進(jìn)一步復(fù)制[30]。而小鼠肺的病毒載量高峰則在3 d[31]。10 d 各組織中病毒載量仍可以檢測到,有動物實(shí)驗表明,肺中的病毒載量一般要25 d 才能完全清除[32]。

從病理結(jié)果可以看出,樹鼩感染流感病毒3 d后,首先在鼻甲中進(jìn)行復(fù)制并產(chǎn)生損傷,然后是咽部,隨著時間的推移,病毒逐漸擴(kuò)散并在肺組織中復(fù)制,氣管損傷持續(xù)存在,肺泡出現(xiàn)彌漫性的增厚,說明存在炎性病變,這與感染病人的尸檢報告一致,人感染后可出現(xiàn)氣管和支氣管炎[33],支氣管壁的上皮細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞脫落和壞死,肺出現(xiàn)了彌漫性間質(zhì)性肺炎[34]。樹鼩感染流感病毒表現(xiàn)的癥狀和人類似的癥狀是由于受體分布和人類似[5],可能更能模擬人感染流感病毒的病理變化情況。

在之前的報道中,流感病毒可以在沒有適應(yīng)的情況下感染樹鼩[5],這說明有新的流感病毒流行的時候,樹鼩可以作為一種快速替代模型。這項研究的結(jié)果表明,甲型流感可以感染樹鼩并引起肺炎。樹鼩的癥狀與人類高度相似,有體溫升高、流涕等臨床癥狀[35]。在鼻咽拭子中,可以連續(xù)檢測血液和組織中的病毒載量,并誘導(dǎo)血清中特異性抗體的形成。樹鼩能較好地模擬流感病毒感染后的病毒復(fù)制和病理變化,是很好的流感動物模型。樹鼩的優(yōu)勢是存在與人類相似的唾液酸受體,基因組與人類相似。流感病毒無需適應(yīng)即可感染樹鼩。飼養(yǎng)方便、體型小、價格低也是樹鼩的優(yōu)點(diǎn)。本研究建立的樹鼩感染模型在臨床表現(xiàn)、病毒復(fù)制和病理變化等方面均能滿足H1N1 流感病毒疾病模型的建模要求,此模型可以對開展甲型流感病毒的作用機(jī)制、藥物評價及疫苗學(xué)研究有較好的參考意義。