復(fù)方中藥提取物增強免疫力作用及初步機制研究

王濤 ,戴明珠 ,李延川 ,彭逸 ,李春啟*

(1.無限極(中國)有限公司,廣州 510610;2.杭州環(huán)特生物科技股份有限公司,杭州 310051)

免疫力可以保護機體不受侵害,近年來,由于生態(tài)失衡導(dǎo)致的免疫性疾病越來越多,西藥不能起到預(yù)防作用,治療效果不甚明顯且存在毒副作用。而中藥及其提取物在中醫(yī)藥基礎(chǔ)理論指導(dǎo)下,擅治未病,最講究協(xié)調(diào)和平衡且毒副作用小,所以中藥及其提取物增強免疫力一直是新研究方向。已有研究表明,靈芝多糖和生物堿均能明顯增強小鼠巨噬細胞吞噬能力和T 淋巴細胞轉(zhuǎn)化能力,同時可提高小鼠外周血中IFN-γ 的表達水平[1-2]。五味子多糖[3-4]、白術(shù)多糖及內(nèi)酯[5]均具有抗氧化和增強機體免疫力活性;菟絲子提取物是有效的抗菌劑,抗氧化劑和抗炎劑[6-7];黨參[8]和茯苓[9]在多種急性和慢性炎癥的不同實驗?zāi)Ｐ椭酗@示抗炎活性。然而大部分研究都是以傳統(tǒng)的大小鼠為動物模型進行評價,具有造模時間長、成本高、通量小等缺點。

斑馬魚(Danio rerio,zebrafish)是一種國際認可的新型模式生物,其引人注目的優(yōu)勢是胚胎發(fā)育的透明性,基于高通量的檢測體系,以及短時-高效-低費篩選。隨著“3R (reduction,replacement,refinement)原則”的推行與實施,其在藥物的靶點鑒別、疾病的模型開發(fā)和毒性評價中應(yīng)用越來越廣泛[10-13]。本研究采用體外細胞實驗和體內(nèi)斑馬魚免疫低下模型探究復(fù)方中藥提取物對免疫力的影響,從RAW 264.7 小鼠單核巨噬細胞白血病細胞活性,斑馬魚巨噬細胞數(shù)量及其吞噬功能,T 細胞數(shù)量,免疫相關(guān)基因水平多方面考察復(fù)方中藥提取物的生物安全性與增強免疫作用,對復(fù)方中藥提取物增強免疫功能進行驗證并提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

轉(zhuǎn)基因巨噬細胞綠色熒光(Tg(mpeg1:EGFP))斑馬魚,轉(zhuǎn)基因T 細胞紅色熒光(Tg(rag2:DsRed))斑馬魚,均為受精后2 d(2 days post fertilization,dpf)已出膜幼魚,體重每尾約0.25 mg,均來源于杭州環(huán)特生物科技股份有限公司。斑馬魚成魚以自然成對的交配方式進行胚胎繁殖,胚胎置于標準稀釋水中(標準稀釋水:294.0 mg/L CaCl2·2H2O,123.3 mg/L MgSO4·7H2O,63.0 mg/L NaHCO3和5.5 mg/L KCl)在28℃條件下孵化,電導(dǎo)率450～550 μS/cm;pH 為 6.5～ 8.5;硬度為50～100 mg/L CaCO3。由杭州環(huán)特生物科技股份有限公司養(yǎng)魚中心繁殖提供【SYXK(浙)2022-0004】,并通過國際AAALAC 認證(001458)[14-15]。所有操作經(jīng)杭州環(huán)特生物科技股份有限公司審批(001458)。實驗結(jié)束后,使用0.25 g/L 三卡因甲基磺酸鹽對所有斑馬魚進行麻醉安樂死,符合美國獸醫(yī)協(xié)會(American Veterinary Medical Association,AVMA)對斑馬魚麻醉安樂死的要求[16]。

1.1.2 細胞

RAW 264.7 小鼠單核巨噬細胞白血病細胞,訂購于中國典型培養(yǎng)物保藏中心,培養(yǎng)條件:(89%DMEM+1%雙抗+10% FBS)完全培養(yǎng)基,37℃,5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

酒石酸長春瑞濱(上海麥克林生化科技有限公司,批號:C10946321);鹽酸小檗胺(上海源葉生物科技有限公司,批號:R29J6F1);百令膠囊(杭州中美華東制藥有限公司,批號:180303);二甲基亞砜(DMSO,Sigma 公司,批號:BCBZ1685);MTT 細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所,貨號:G020-1-1);胎牛血清(FBS,Gibico 公司,批號:2152441P);雙抗(Gibico 公司,批號:2145455);DMEM(Gibico 公司,批號:8120203);RNA 快速提取試劑盒(上海奕杉生物科技有限公司,貨號:RN001);iTaq Universal SYBR Green Supermix(Bio-rad 公司,貨號:1725124);Fast Quant RT Kit(With gDNase)試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司,貨號:KR106);熒光微球(Sigma 公司,批號:MKCB2036 V)。

多功能酶標儀(SPARK,TECAN,Switzerland);細胞培養(yǎng)箱(3111,Thermo,USA);紫外-可見分光光度計(Nanodrop 2000,Thermo,USA);普通PCR 擴增儀(T100,Bio-rad,Singapore);熒光定量PCR 儀(CFX Connect,Bio-rad,Singapore);低位裙邊96 孔板(透明)(HSP9601,Bio-rad,USA);6 孔板(Nest Biotech,China);電動聚焦連續(xù)變倍熒光顯微鏡(AZ100,Nikon,Japan);顯微注射儀(IM -300,Narishige,Japan);拉針儀(PC-10,Narishige,Japan)。

1.2 方法

1.2.1 復(fù)方中藥提取物的制備

提取液1:赤靈芝→提取罐中提取→過篩(80目);提取液2:菟絲子、茯苓、五味子、黨參、白術(shù)→提取罐中提取→過篩(80 目)。將提取液進行濃縮,濃縮過程中溫度不可以超過95℃,真空度-0.03～-0.08 Mpa,濃縮至固形物含量在產(chǎn)品標準范圍內(nèi)進行出料。

1.2.2 RAW 264.7 細胞培養(yǎng)及復(fù)方中藥提取物處理

取生長狀態(tài)良好的RAW 264.7 小鼠單核巨噬細胞白血病細胞,2000 個/孔分別接種于96 孔細胞板使細胞貼壁完全。棄去舊培養(yǎng)基:(1)每孔依次加入復(fù)方中藥提取物62.5、125、250、500 及1000 μg/mL 濃度的培養(yǎng)基,加入體積均為100 μL,24 h后棄去舊的培養(yǎng)基,避光條件下每孔加入100 μL 含0.5 mg/mL MTT 的培養(yǎng)基,繼續(xù)孵育4 h,棄去上清,每孔加入150 μL DMSO,搖床振蕩5 min,用酶標儀在490 nm 波長下測定各孔吸光度(OD)值,確定復(fù)方中藥提取物最佳處理濃度。(2)除正常對照孔及溶劑對照孔(0.1% DMSO)外,其余每孔均加入酒石酸長春瑞濱12.5 μg/mL 濃度的培養(yǎng)基后,再依次加入復(fù)方中藥提取物27.8、83.3、250 μg/mL 濃度以及陽性對照組鹽酸小檗胺25 μg/mL 濃度的培養(yǎng)基。孵育24 h 后棄去舊的培養(yǎng)基,避光條件下每孔加入100 μL 含0.5 mg/mL MTT 的培養(yǎng)基,繼續(xù)孵育4 h 棄去上清,每孔加入150 μL DMSO,搖床振蕩5 min,用酶標儀在490 nm 波長下測定各孔OD值,評價復(fù)方中藥提取物對RAW 264.7 細胞存活率的影響。

1.2.3 復(fù)方中藥提取物安全性考察

為解決上述技術(shù)難點，分別建立永磁直驅(qū)柔性構(gòu)架有限元瞬態(tài)響應(yīng)分析模型及整車動力學(xué)模型，并提出架懸直驅(qū)結(jié)構(gòu)與驅(qū)動軸間動態(tài)間隙的干涉評判指標，以此作為間隙大小設(shè)定的依據(jù)。

選取受精后2 d(2 days post fertilization,dpf)Tg(mpeg1:EGFP)轉(zhuǎn)基因斑馬魚于6 孔板中,每孔(實驗組)均處理30 尾斑馬魚,容量為3 mL。設(shè)置加藥組:復(fù)方中藥提取物62.5、125、250、500、1000、2000 μg/mL;同時設(shè)置正常對照組(養(yǎng)魚用水處理的斑馬魚)。加蓋置于28℃培養(yǎng)箱中孵育,每隔24 h統(tǒng)計并及時移除死亡斑馬魚,記錄孵育至6 dpf 時斑馬魚各臟器毒性表型與死亡情況,確定復(fù)方中藥提取物對正常斑馬魚的最大檢測濃度(maximum tolerated concentration,MTC)。

1.2.4 復(fù)方中藥提取物對斑馬魚巨噬細胞生成的影響

取2 dpf Tg(mpeg1:EGFP)轉(zhuǎn)基因斑馬魚于6孔板中,設(shè)置加藥組:復(fù)方中藥提取物222、667、2000 μg/mL;同時設(shè)置對照組:陽性對照鹽酸小檗胺5.33 μg/mL,正常對照組及模型對照組。除正常對照組外,其余各組均水溶給予酒石酸長春瑞濱400 μg/mL,建立斑馬魚巨噬細胞減少癥模型。各組加蓋置于28℃培養(yǎng)箱中孵育至3 dpf 時,在熒光顯微鏡下觀察斑馬魚尾部靜脈血管中巨噬細胞熒光強度(S1),并拍照。使用尼康NIS-Elements D 3.20 高級圖像處理軟件采集數(shù)據(jù)。

1.2.5 復(fù)方中藥提取物對斑馬魚巨噬細胞吞噬功能的影響

選取2 dpf Tg(mpeg1:EGFP)轉(zhuǎn)基因斑馬魚,均靜脈注射紅色熒光微球(直接用生理鹽水稀釋為2%溶液,每尾10 nL)作為異物以建立斑馬魚巨噬細胞吞噬功能模型。將模型斑馬魚分配于6 孔板中,30 尾/(孔·3 mL 體系),設(shè)置加藥組:復(fù)方中藥提取物222、667、2000 μg/mL;同時設(shè)置對照組:陽性藥百令膠囊15.0 μg/mL 和模型對照組。加蓋置于28℃培養(yǎng)箱中孵育至6 dpf 時,在熒光顯微鏡下觀察斑馬魚體內(nèi)(全身)熒光微球殘留的數(shù)目(N),并拍照。使用Image J 高級圖像處理軟件采集數(shù)據(jù)。

1.2.6 復(fù)方中藥提取物對斑馬魚T 細胞的影響及初步機制研究

選取2 dpf Tg(rag2:DsRed)轉(zhuǎn)基因斑馬魚于6 孔板中,設(shè)置加藥組:復(fù)方中藥提取物222、667、2000 μg/mL;同時設(shè)置對照組:陽性對照百令膠囊60.0 μg/mL,正常對照組及模型對照組。除正常對照組外,其余實驗組均水溶給予酒石酸長春瑞濱200 μg/mL,建立斑馬魚T 細胞減少癥模型。各組加蓋置于28℃培養(yǎng)箱中孵育至5 dpf 時,(1)對T 細胞生成的影響:在熒光顯微鏡下觀察斑馬魚T 細胞熒光強度(S2),并拍照,使用尼康NIS-Elements D 3.20 高級圖像處理軟件采集數(shù)據(jù);(2)機制研究:收集斑馬魚樣本,采用經(jīng)典的TRIzol 法提取各濃度組斑馬魚總RNA,以β-actin作為基因表達的內(nèi)參,通過q-PCR 法檢測目的基因腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factorα,TNF-α)、重組激活型基因-1(rag1)、重組激活型基因-2(rag2)、白細胞介素-12(interleukin-12,IL-12)和γ-干擾素(interferon-γ,IFN-γ)的轉(zhuǎn)錄水平,進行復(fù)方中藥提取物增強免疫力初步機制研究。引物序列:βactin-FOR:5’-TCGA GCAGGAGATGGGAACC-3’,βactin-REV:5’-CTCGTGGA TACCGCAAGATTC-3’;TNF-α-FOR:5 ’-AGGAGAGTTGCCTTTACCGC-3 ’,TNF-α-REV:5 ’-AATGGATGGCAGCCTTGGAA-3 ’;rag1-FOR:5’-GGAAGGACTGAGAGAGAGGGCGC-3’,rag1-REV:5 ’-AGGACCAGATCCGTGCTTCTCG-3 ’;rag2-FOR:5’-TGGAAGCCCTGTCCTTACCT-3’,rag2-REV:5 ’-GACTCCCACATCATCCAGGC-3 ’;IL-12-FOR:5’-AACTCCTA CAAGCCCAGCAC-3’,IL-12-REV:5’-ACACTCGGTCGTCAAACGAA-3’;IFN-γ-FOR:5’-GCCTGGGGAGTATGTTTG CT-3’,IFN-γ-REV:5’-CAGGAAGATGGGGTGTGCAT-3’。基因相對表達量計算公式:RNA相對表達量=2-△△Ct;ΔΔC(t)=ΔC(t)實驗組-;ΔC(t)=C(t)目的基因-C(t)β-actin

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用GraphPad Prim 5.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析,數(shù)據(jù)處理結(jié)果用平均值± 標準差()表示;多組間采用方差分析和Dunnett’st檢驗,兩獨立樣本用TTEST 檢驗,以P＜0.05 作為顯著性差異判定標準。

2 結(jié)果

2.1 復(fù)方中藥提取物對RAW 264.7 細胞存活率的影響

當復(fù)方中藥提取物濃度為62.5～250 μg/mL時,RAW 264.7 細胞存活率均＞90.0%;當復(fù)方中藥提取物濃度為500 μg/mL 時,RAW 264.7 細胞存活率下降為84.0%。故確定復(fù)方中藥提取物對RAW

264.7 細胞最大安全濃度為250 μg/mL(見表1)。

表1 復(fù)方中藥提取物對RAW 264.7 細胞安全濃度評價實驗結(jié)果(n=4,)Table 1 Experimental results of evaluating the safe concentration of CHCe on RAW264.7 cells(n=4,)

表1 復(fù)方中藥提取物對RAW 264.7 細胞安全濃度評價實驗結(jié)果(n=4,)Table 1 Experimental results of evaluating the safe concentration of CHCe on RAW264.7 cells(n=4,)

由表2 可知,酒石酸長春瑞賓可導(dǎo)致RAW 264.7細胞存活率顯著下降;同時復(fù)方中藥提取物3 倍濃度梯度干預(yù)后,細胞存活率呈劑量依賴性升高,復(fù)方中藥提取物250 μg/mL 可顯著提高RAW 264.7 細胞存活率(P＜0.01)。

表2 復(fù)方中藥提取物對RAW264.7 細胞存活率的影響評價實驗結(jié)果(n=4,)Table 2 Experimental results of CHCe on the survival rate of RAW264.7 cells(n=4,)

表2 復(fù)方中藥提取物對RAW264.7 細胞存活率的影響評價實驗結(jié)果(n=4,)Table 2 Experimental results of CHCe on the survival rate of RAW264.7 cells(n=4,)

注:與模型對照組比較,*P ＜0.05,**P ＜0.01,***P ＜0.001。(下表同)Note.Compared with the model control group,*P ＜0.05,**P ＜0.01,***P ＜0.001.(The same in the following tables)

2.2 復(fù)方中藥提取物對斑馬魚的MTC

在實驗終點,復(fù)方中藥提取物62.5～2000 μg/mL 濃度組斑馬魚均未見明顯異常,各臟器和行為狀態(tài)與正常斑馬魚相似(見圖1)。提示復(fù)方中藥提取物對正常斑馬魚的MTC 為2000 μg/mL。

圖1 復(fù)方中藥提取物濃度摸索實驗結(jié)果圖片展示Figure 1 Picture display of the experimental results of the concentration of CHCe

2.3 復(fù)方中藥提取物對斑馬魚巨噬細胞生成的影響

由統(tǒng)計結(jié)果可知(圖2,表3),酒石酸長春瑞賓可導(dǎo)致斑馬魚免疫力低下,表現(xiàn)為與正常對照組比較,酒石酸長春瑞賓組斑馬魚中巨噬細胞熒光強度顯著降低;復(fù)方中藥提取物低、中、高3 倍濃度梯度干預(yù)后,巨噬細胞熒光強度均顯著升高,巨噬細胞減少的改善功效分別為18%(P＜0.05)、21%(P＜0.01)和22%(P＜0.01)。

表3 復(fù)方中藥提取物對巨噬細胞減少改善功效評價實驗結(jié)果(n=4,)Table 3 Experimental results of the effect of CHCe on macrophages(n=4,)

表3 復(fù)方中藥提取物對巨噬細胞減少改善功效評價實驗結(jié)果(n=4,)Table 3 Experimental results of the effect of CHCe on macrophages(n=4,)

圖2 復(fù)方中藥提取物處理后斑馬魚尾部靜脈血管巨噬細胞熒光強度典型圖Note.The green fluorescent particles are macrophages,and the yellow dotted frame is the analysis area (Veins from cloaca to tail end).Figure 2 Typical graph of fluorescence intensity of macrophages after CHCe treatment

2.4 復(fù)方中藥提取物對斑馬魚巨噬細胞吞噬功能的影響

由統(tǒng)計結(jié)果可知(圖3,表4),與模型對照組比較,復(fù)方中藥提取物低、中、高3 個濃度組均可明顯減少斑馬魚體內(nèi)熒光微球殘留數(shù)目(P＜0.05),表明復(fù)方中藥提取物具有促巨噬細胞吞噬功能作用。

表4 復(fù)方中藥提取物對巨噬細胞吞噬功能促進功效評價實驗結(jié)果(n=10,)Table 4 Experimental results of CHCe on the promotion of macrophage phagocytic function(n=10,)

表4 復(fù)方中藥提取物對巨噬細胞吞噬功能促進功效評價實驗結(jié)果(n=10,)Table 4 Experimental results of CHCe on the promotion of macrophage phagocytic function(n=10,)

圖3 復(fù)方中藥提取物處理后斑馬魚體內(nèi)(全身)殘留熒光微球典型圖Note.Red fluorescent particles are fluorescent microspheres.Figure 3 Typical image of residual fluorescent microspheres in zebrafish whole body after CHCe treatment

2.5 復(fù)方中藥提取物對斑馬魚T 細胞生成的影響

由統(tǒng)計結(jié)果可知(表5,圖4),與正常對照組比較,模型對照組T 細胞熒光強度極顯著降低,表明酒石酸長春瑞賓可誘導(dǎo)斑馬魚免疫抑制。與模型對照組比較,復(fù)方中藥提取物中濃度T 細胞熒光強度顯著升高(P＜0.01);但高濃度對T 細胞熒光強度無升高作用且呈現(xiàn)降低的作用趨勢。

圖4 復(fù)方中藥提取物處理后斑馬魚T 細胞熒光強度典型圖Note.Red fluorescent particles are T cells.Figure 4 Typical graph of fluorescence intensity of T-lymphocytes after CHCe treatment

表5 復(fù)方中藥提取物對T 細胞減少改善功效評價實驗結(jié)果(n=10,)Table 5 Experimental results of the effect of CHCe on T-lymphocytes(n=10,)

表5 復(fù)方中藥提取物對T 細胞減少改善功效評價實驗結(jié)果(n=10,)Table 5 Experimental results of the effect of CHCe on T-lymphocytes(n=10,)

2.6 復(fù)方中藥提取物對斑馬魚T 細胞的影響及初步機制研究

2.6.1 RNA 濃度及純度

在實驗終點,提取斑馬魚總RNA,用超微量分光光度計測定RNA 濃度及純度(A260/A280 比值),結(jié)果表明A260/A280 比值均在1.88～2.03之間,表明提取得到斑馬魚總RNA 質(zhì)量較好,可用于后續(xù)q-PCR 實驗(見表6)。

表6 總RNA 的濃度及純度Table 6 Concentration and purity of total RNA

2.6.2 對重組激活型基因rag1 和rag2 的影響

根據(jù)基因相對表達量公式計算,與正常對照組比較,模型對照組rag1、rag2 基因相對表達量均顯著下調(diào)(P＜0.01),復(fù)方中藥提取物干預(yù)后,低、中、高濃度組rag1、rag2 基因相對表達量均顯著恢復(fù)(見表7)。

表7 復(fù)方中藥提取物對rag1 和rag2 基因表達的影響(n=3,)Table 7 Effect of CHCe on rag1 and rag2 gene expression(n=3,)

表7 復(fù)方中藥提取物對rag1 和rag2 基因表達的影響(n=3,)Table 7 Effect of CHCe on rag1 and rag2 gene expression(n=3,)

2.6.3 對免疫因子IL-12 和IFN-γ的影響

根據(jù)表8 顯示與正常對照組比,模型對照組IL-12 基因相對表達量極顯著下調(diào)(P＜0.001),復(fù)方中藥提取物干預(yù)后,在實驗終點,低濃度組IL-12 基因相對表達量極顯著上升(P＜0.001),中、高濃度組出現(xiàn)負反饋調(diào)節(jié)。

表8 復(fù)方中藥提取物對IL-12 和IFN-γ 基因表達的影響(n=3,)Table 8 Effect of CHCe on IL-12 and IFN-γ gene expression(n=3,)

表8 復(fù)方中藥提取物對IL-12 和IFN-γ 基因表達的影響(n=3,)Table 8 Effect of CHCe on IL-12 and IFN-γ gene expression(n=3,)

與正常對照組比較,模型對照組IFN-γ基因相對表達量顯著下調(diào)(P＜0.01),復(fù)方中藥提取物3 倍濃度梯度干預(yù)后,IFN-γ基因相對表達量呈劑量依賴性恢復(fù),復(fù)方中藥提取物高濃度組IFN-γ基因相對表達量極顯著上升(P＜0.001)。

2.6.4 對致炎癥因子TNF-α的影響

模型對照組TNF-α基因相對表達量(1.000)與正常對照組(0.006)比較極顯著上調(diào)(P＜0.001)。復(fù)方中藥提取物低、中、高濃度組TNF-α基因相對表達量分別為0.023、0.002 和0.008(P＜0.001),提示復(fù)方中藥提取物可顯著下調(diào)TNF-α基因相對表達量(見表9)。

表9 復(fù)方中藥提取物對TNF-α 基因表達的影響(n=3,)Table 9 Effect of CHCe on TNF-α gene expression(n=3,)

表9 復(fù)方中藥提取物對TNF-α 基因表達的影響(n=3,)Table 9 Effect of CHCe on TNF-α gene expression(n=3,)

3 討論

復(fù)方中藥提取物是靈芝[1-2]、五味子[3-4]、白術(shù)[5]、菟絲子[6-7]、茯苓[9]和黨參[8]提取物為主要原料,在之前的研究中,這6 味中藥提取物均具有增強免疫力相關(guān)報道;此外,菟絲子[6-7]、黨參[8]和茯苓[9]在多種急性和慢性炎癥模型中顯示強抗炎活性。在本實驗條件下,體外細胞實驗中當復(fù)方中藥提取物在62.5～250 μg/mL 時,RAW 264.7 細胞存活率均＞90.0%,表明復(fù)方中藥提取物具有良好的生物安全性,且在巨噬細胞的免疫作用方面,對于降低免疫力的造模劑來說,復(fù)方中藥提取物也有很好的改善作用,與對照組相比,細胞活性上升,這可能是因為復(fù)方中藥提取物主要原料的安全性和促進免疫力的作用。例如靈芝多糖可影響免疫細胞和免疫相關(guān)細胞,包括促進B 和T 淋巴細胞,樹突狀細胞,巨噬細胞和自然殺傷細胞活性[17-18]。復(fù)方中藥提取物同時在本次實驗中表現(xiàn)出較好的改善免疫力低下模型中巨噬細胞數(shù)量和吞噬能力,以及T 細胞的熒光強度,表明復(fù)方中藥提取物在體內(nèi)實驗中能有效的增強機體免疫力,在之前的報道中,復(fù)方中藥提取物中具備的靈芝提取物可下調(diào)LPS 誘導(dǎo)的促炎因子,并促進BV-2 和原發(fā)性小膠質(zhì)細胞的抗炎細胞因子表達。另外,靈芝提取物通過改變巨噬細胞吞噬作用從而達到先天免疫應(yīng)答的激活[19],對于基因表達水平方面,不同濃度的復(fù)方中藥提取物對免疫力低下模型抗炎因子水平的恢復(fù),以及致炎因子水平的降低可以很好的從分子機制解釋復(fù)方中藥提取物的增強免疫力的原理,另外相當多的研究對復(fù)方中藥提取物中的中藥成分免疫基因水平的表達給出了很好的解釋[20-22],例如五味子可通過增加衰老小鼠的血清IL-2,IL-4,IFNγ,lgG,lgM和lgA的水平,降低TNF-α和IL-6 的含量,并增加白血球數(shù)量,吞噬活性,淋巴細胞增殖和體外脾指數(shù)去增強衰老小鼠的免疫力[23]。這些研究都為本實驗提供了有效的實驗依據(jù)的支撐,復(fù)方中藥提取物的增強免疫力功效也均與之報道相符合。

4 結(jié)論

在體外實驗中復(fù)方中藥提取物有良好的生物安全性,且可明顯提高酒石酸長春瑞濱誘導(dǎo)后小鼠單核巨噬細胞的存活率。體內(nèi)研究表明,復(fù)方中藥提取物可明顯改善長春瑞濱誘發(fā)的斑馬魚巨噬細胞及T 細胞數(shù)量的減少,同時增強體內(nèi)巨噬細胞的活性和吞噬能力;復(fù)方中藥提取物可明顯恢復(fù)模型對照組中rag1、rag2 基因相對表達量被下調(diào)的情況,復(fù)方中藥提取物上調(diào)免疫因子IL-12 的表達量、IFN-γ基因的相對表達量,復(fù)方中藥提取物可顯著下調(diào)TNF-α基因相對表達量。體內(nèi)、外實驗表明復(fù)方中藥提取物具有明顯的增強免疫力作用。綜上所述,復(fù)方中藥提取物具有明顯的抗炎及增強免疫力的作用。本研究可為復(fù)方中藥提取物作為新的免疫保健食品和二次開發(fā)提供指導(dǎo)性依據(jù)。