桃紅四物湯治療骨質(zhì)疏松性骨折的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接研究

白萬(wàn)輝 趙勇 王旋 陳泓穎 韋俊余 秦偉凱

1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029 2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院，北京 100102

骨質(zhì)疏松性骨折(osteoporosis fracture，OF)多是原發(fā)性骨質(zhì)疏松患者首次就診的原因，亦是骨質(zhì)疏松癥最嚴(yán)重的后果，危險(xiǎn)因素包括種族、性別、老齡化、脆性骨折家族史等[1]。骨折部位常見于脊柱、髖部、橈骨遠(yuǎn)端等部位。其治療遵循復(fù)位、固定、功能鍛煉和抗骨質(zhì)疏松的原則，中藥被認(rèn)為對(duì)骨折愈合及預(yù)防再發(fā)骨折具有積極意義[2]。

《景岳全書》指出其屬“骨折病”范疇，腎虛血瘀是重要病機(jī)之一[3-4]，桃紅四物湯是中醫(yī)骨傷科常用方劑，臨床多加味使用治療該病?，F(xiàn)代藥理學(xué)證實(shí)其中藥物具有活血化瘀、鎮(zhèn)痛、促進(jìn)骨折愈合、抗炎、提高免疫力等作用[5-6]。相關(guān)臨床試驗(yàn)表明其對(duì)OF急性期消腫止痛及促進(jìn)骨折愈合顯示出良好療效[7-9]，但相關(guān)作用機(jī)制尚不十分明確。

本研究使用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選方藥中主要活性成分及其潛在作用靶點(diǎn)，并通過分子對(duì)接技術(shù)驗(yàn)證有效成分與作用靶點(diǎn)之間活性，意在發(fā)掘桃紅四物湯治療OF潛在活性成分及作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 藥物主要活性成分和潛在靶點(diǎn)

通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)TCMSP，收集熟地黃、白芍、當(dāng)歸、川芎、桃仁、紅花的化學(xué)成分，構(gòu)建數(shù)據(jù)庫(kù)，利用生物利用度(OB≥30%)和類藥性指數(shù)(DL≥0.18)篩選，選擇不同藥物的主要活性成分及潛在靶點(diǎn)，靶點(diǎn)通過UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)轉(zhuǎn)換為人類相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)基因。

1.2 疾病靶點(diǎn)篩選

以“Osteoporosis fracture”或“Fragility fracture”或“Osteoporotic fracture”為檢索詞分別根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)特性進(jìn)行檢索：GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)、OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)、DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)、DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)，刪除重復(fù)靶點(diǎn)，最終確定OF疾病靶點(diǎn)。

1.3 構(gòu)建“藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”可視化網(wǎng)絡(luò)圖

使用venny2.1軟件將桃紅四物湯有效成分的靶點(diǎn)與OF疾病靶點(diǎn)取交集，得到的共有靶點(diǎn)同有效成分、疾病、藥物為網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點(diǎn)(node)，四者之間的相互作用為網(wǎng)絡(luò)中的連接(edge)，制成表格，并通過 Cytoscape 3.8.2軟件構(gòu)建。

1.4 交集靶點(diǎn)的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

將1.3交集靶點(diǎn)上傳STRING 11.0數(shù)據(jù)庫(kù)，選擇物種為homo sapiens，獲得相關(guān)信息，導(dǎo)入Cytoscape軟件中利用工具cutoHubba，構(gòu)建蛋白相互網(wǎng)絡(luò)(PPI)，分析各靶點(diǎn)之間的作用關(guān)系，并結(jié)合可視化網(wǎng)絡(luò)圖篩選出核心靶點(diǎn)。

1.5 基因本體論(GO)及KEGG通路富集分析

Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)導(dǎo)入交集靶點(diǎn)，選擇物種為homo sapiens，獲取具有顯著性的富集信息(P<0.05)，其中GO及KEGG富集分析結(jié)果各選取P值最小的20條，將相關(guān)信息(富集名稱、P值、Count)運(yùn)用在線工具(http://www.bioinformatics.com.cn/)分別進(jìn)行GO及KEGG富集氣泡圖繪制。

1.6 分子對(duì)接

1.3中degree值前3活性成分作為配體、1.4中degree前3靶蛋白作為受體，從PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取靶蛋白3 D結(jié)構(gòu)，用Pymol2.4.1進(jìn)行預(yù)處理。Pubchem數(shù)據(jù)庫(kù)獲取有效成分的sdf結(jié)構(gòu)，通過OpenBabel轉(zhuǎn)換成mol2文件。通過Autodock Tools1.5.6軟件將受體和配體分別進(jìn)行處理，AutoDock Vina計(jì)算結(jié)合能，最終通過Pymol可視化數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 藥物主要活性成分和潛在靶點(diǎn)

桃紅四物湯中熟地黃(2)、白芍(13)、當(dāng)歸(2)、川芎(7)、桃仁(23)、紅花(22)藥物有效成分69個(gè)，將篩重后44個(gè)有效成分編碼Id(表1)；通過UniProt轉(zhuǎn)化得到的標(biāo)準(zhǔn)基因靶點(diǎn)代碼(Symbol)，篩重后得到潛在靶點(diǎn)229個(gè)。

表1 桃紅四物湯主要活性成分信息Table 1 Information on the main active ingredients of Taohong Siwu decoction

2.2 桃紅四物湯與OF共有靶點(diǎn)

獲得疾病相關(guān)靶點(diǎn)3 752個(gè)，篩重后剩余3 639個(gè)，與桃紅四物湯有效成分潛在靶點(diǎn)，使用Venny2.1軟件取交集，得到共有靶點(diǎn)152個(gè)，見圖1。

圖1 桃紅四物湯活性成分靶點(diǎn)和OF靶點(diǎn)韋恩圖Fig.1 Venn diagram of active component target in Taohong Siwu decoction and disease target in OF

2.3 “藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”可視化網(wǎng)絡(luò)圖

網(wǎng)絡(luò)圖共包括203個(gè)節(jié)點(diǎn)，535條相互作用關(guān)系，見圖2。不同顏色和形狀的節(jié)點(diǎn)代表信息不同，其中紅色三角節(jié)點(diǎn)代表疾病，綠色圓形節(jié)點(diǎn)代表中藥，墨綠色菱形代表共有靶點(diǎn)，各色八邊形代表不同的有效成分，V形代表相同有效成分，連線代表四者之間的相互作用關(guān)系。根據(jù)degree值顯示node大小，越大表示在網(wǎng)絡(luò)中連接程度越高。根據(jù)degree值篩選出前10的關(guān)鍵活性成分，見表2。

圖2 桃紅四物湯“藥物-有效成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 The network of drug-active ingredients-target-disease of Taohong Siwu decoction

表2 藥物-有效成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖有效成分及PPI靶點(diǎn)蛋白(Degree前10)

2.4 交集靶點(diǎn)的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

將共有靶點(diǎn)152個(gè)上傳STRING數(shù)據(jù)庫(kù)獲取蛋白之間的作用關(guān)系，構(gòu)建蛋白相互網(wǎng)絡(luò)(PPI)(圖3)，根據(jù)degree值分析出前10核心靶點(diǎn)，見表2。

圖3 桃紅四物湯治療OF蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 Protein-protein interaction network regarding Taohong Siwu decoction in the treatment of OF

2.5 基因本體論(GO)及KEGG通路富集分析

GO富集分析獲得生物過程(BP)5 881個(gè)、細(xì)胞組成(CC)和分子功能(MF)分別為503和465個(gè)，共6 849個(gè)條目(P<0.01)。從生物過程的相關(guān)條目分析，桃紅四物湯治療骨質(zhì)疏松性骨折的靶點(diǎn)主要參與對(duì)無(wú)機(jī)物及激素、傷害應(yīng)激、細(xì)胞凋亡增殖、生長(zhǎng)因子等過程；細(xì)胞組成方面，治療靶點(diǎn)主要覆蓋細(xì)胞膜閥、囊泡腔、轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體、蛋白激酶復(fù)合物等區(qū)域；分子功能相關(guān)條目主要針對(duì)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、核受體活性、蛋白激酶結(jié)合等過程。每個(gè)模塊分別根據(jù)P值排序前20位(圖4)。KEGG通路富集分析共得到465條信號(hào)通路，篩選排名前20條條目(圖5)。主要涉及癌癥途徑、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE、乙肝、IL17、PI3K-Ak、HIF-1、多種激素、鈣等多種信號(hào)通路，與炎癥反應(yīng)、骨代謝、血管生成和免疫調(diào)節(jié)密切相關(guān)。

圖4 GO富集分析(排名前20)Fig.4 GO enrichment analysis (top 20)

圖5 KEGG 信號(hào)通路分析 (排名前20)Fig.5 KEGG channel analysis (top 20)

2.6 分子對(duì)接驗(yàn)證

關(guān)鍵活性成分與靶蛋白的分子對(duì)接穩(wěn)定，兩者具有較好的結(jié)合活性(表3)。以槲皮素和AKT1蛋白結(jié)構(gòu)對(duì)接模式為例，槲皮素能穩(wěn)定地對(duì)接到AKT1蛋白結(jié)構(gòu)活性口袋中，說明槲皮素與AKT1具有良好的結(jié)合作用，見圖6。

表3 活性成分與核心靶點(diǎn)蛋白的結(jié)合能(kJ/mol)

圖6 槲皮素與AKT1的分子對(duì)接模式圖Fig.6 Molecular docking picture of quercetin and AKT1

3 討論

本研究結(jié)果顯示，桃紅四物湯含有多種有效成分如槲皮素、木犀草素、山奈酚、多種甾醇、黃芩素等均是網(wǎng)絡(luò)中的重要節(jié)點(diǎn)，它們多屬于桃仁、紅花，體現(xiàn)了君藥在方劑中的決定性作用。結(jié)合相關(guān)的基礎(chǔ)與臨床研究，這些成分具有解熱鎮(zhèn)痛抗炎、調(diào)控細(xì)胞增殖分化、改善骨代謝、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)等作用[10-13]，在OF治療中扮演著重要的角色。

從蛋白相互網(wǎng)絡(luò)和可視化網(wǎng)絡(luò)圖的結(jié)果來(lái)看，IL6、JUN、AKT1、MAPK1、TNF等可能是桃紅四物湯治療OF的關(guān)鍵靶點(diǎn)，這也體現(xiàn)了桃紅四物湯治療OF具有多靶點(diǎn)的特點(diǎn)。有研究表明[14-15]，IL-6可作用于破骨細(xì)胞的早期階段，刺激破骨細(xì)胞前體細(xì)胞分裂增殖，影響成骨細(xì)胞活性，同時(shí)使成骨細(xì)胞通過胞間接觸，產(chǎn)生具有前列腺素、IL1、集落刺激因子等的微環(huán)境，并使得破骨細(xì)胞發(fā)揮骨吸收的作用，研究證實(shí)絕經(jīng)后雌激素水平降低導(dǎo)致IL6產(chǎn)生過量，二者表現(xiàn)出負(fù)相關(guān)。JUN屬于AP-1轉(zhuǎn)錄因子家族，主要參與細(xì)胞增殖、免疫相關(guān)、凋亡抑制等信號(hào)通路，有研究表明[16]，JUN通過Wnt通路參與成骨細(xì)胞的形成，使得骨質(zhì)增加，骨長(zhǎng)度變短。AKT1是PI3K/AKT信號(hào)通路中核心因子，主要通過調(diào)控細(xì)胞增殖和生長(zhǎng)，參與包括細(xì)胞凋亡和葡萄糖代謝在內(nèi)的細(xì)胞過程[17]。MAPK1屬于整合多個(gè)生化信號(hào)，參與如轉(zhuǎn)錄調(diào)控、增殖分化及發(fā)育等復(fù)雜的細(xì)胞過程[18]。破骨細(xì)胞樣細(xì)胞及成骨細(xì)胞合成TNF，已證明的TNFα可以直接對(duì)成骨細(xì)胞的增殖、分化產(chǎn)生影響，從而抑制膠原合成、AKP活性和骨鈣素合成[19]。由此可知，桃紅四物湯可通過參與細(xì)胞免疫反應(yīng)、骨細(xì)胞增殖分化、細(xì)胞代謝、炎癥反應(yīng)等治療OF。

富集分析發(fā)現(xiàn)桃紅四物湯治療OF多作用于RANKL-RANK啟動(dòng)的下游信號(hào)通路，如PI3K/Akt、NF-κB、MAPK信號(hào)通路等[20-21]，OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)具有重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用[22]，在介導(dǎo)破骨細(xì)胞分化和功能的過程中，起到抗骨質(zhì)疏松的作用[23]。腫瘤、糖尿病、甲狀腺激素信號(hào)通路可能與繼發(fā)性O(shè)F密切相關(guān)，本研究重點(diǎn)介紹桃紅四物湯活性成分起到抗炎免疫、細(xì)胞修復(fù)、調(diào)節(jié)骨細(xì)胞等的作用通路。IL17家族通過相應(yīng)受體信號(hào)并激活下游信號(hào)通路如NF-KappaB、MAPKs和C/EBPs，誘導(dǎo)多種具有抗炎及修復(fù)功能的因子表達(dá)，從而將髓樣細(xì)胞吸引到炎癥部位[24]。NF-kappaB屬于NF-κb/Rel家族，是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，RANKL的信號(hào)經(jīng)RANK傳遞給TRAF6，TRAF6通過NIK(NF-κB可誘導(dǎo)性激酶)和IKK(NF-κB激酶誘導(dǎo)劑)活化NF-κB，與Ⅰ-KB分離后的NF-κB迅速進(jìn)入細(xì)胞核，并和相應(yīng)啟動(dòng)子結(jié)合，以通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄來(lái)調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的分化、功能和凋亡[25]。IL17A在骨髓中廣泛表達(dá)，其受體編碼蛋白還調(diào)節(jié)NF-κB和絲裂原激活的蛋白激酶的活性，并可以誘導(dǎo)炎癥信號(hào)如IL6和環(huán)氧合酶2(PTGS2/COX-2)的過表達(dá)，并有效增加一氧化氮(NO)的含量，對(duì)宿主防御反應(yīng)、細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)、免疫調(diào)控和組織修復(fù)重建具有重要影響，是炎性及多種疾病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[24]。本研究發(fā)現(xiàn)低氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)通過調(diào)控多種蛋白因子和多個(gè)經(jīng)典信號(hào)通路，起到促進(jìn)細(xì)胞增殖分化；此外，HIF-1高表達(dá)可以促進(jìn)長(zhǎng)骨成骨[26]。桃紅四物湯治療OF是從多信號(hào)通路出發(fā)的，且通路之間存在緊密聯(lián)系。其他相關(guān)通路目前報(bào)道較少，還需要深入研究，以證實(shí)其作用機(jī)制。

綜上所述，桃紅四物湯從多靶點(diǎn)、多成分及多通路出發(fā)治療骨質(zhì)疏松性骨折，證明中醫(yī)藥對(duì)本病的治療具有天然優(yōu)勢(shì)。本研究為骨質(zhì)疏松及其合并癥的治療提供了循證證據(jù)，也為今后深入揭示其核心靶點(diǎn)作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，對(duì)抗骨質(zhì)疏松新藥的研發(fā)同樣具有意義。