OGP對低氧環(huán)境中小鼠BMSCs成脂分化影響的研究

張磊 龔躍昆 尹勇*

1. 云南大學(xué)附屬醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科，云南 昆明 650000 2. 昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科，云南 昆明 650000

骨質(zhì)疏松癥是一種全身代謝性骨病，其特征為骨密度降低、骨組織顯微結(jié)構(gòu)破壞及易于骨折，顯著增加患者死亡率和致殘率[1-2]，已經(jīng)對全球公共衛(wèi)生構(gòu)成極大挑戰(zhàn)。然而骨質(zhì)疏松癥的病因及發(fā)病機制目前仍然不清楚，其中BMSCs成骨與成脂肪分化失衡是骨質(zhì)疏松發(fā)病的重要機制之一，即BMSCs向成脂肪分化增加而向成骨分化明顯減少，因此如何促進BMSCs向成骨分化而減少成脂分化是目前研究的熱點[3-4]。成骨生長肽(OGP)由14個氨基酸殘基組成的多肽，羧基端五肽為其活性形式?，F(xiàn)在已經(jīng)可以人工合成OGP，其能夠明顯促進BMSCs增殖和成骨分化[5-6]，但是關(guān)于OGP對間充質(zhì)干細胞成脂分化影響的報道非常少[7]。越來越多的研究[8-9]表明低氧環(huán)境培養(yǎng)能明顯影響B(tài)MSCs成骨成脂分化，同時我們前期研究表明低氧環(huán)境及OGP均能促進BMSCs的成骨分化[10]；而現(xiàn)有研究[11-12]關(guān)于低氧對BMSCs成脂肪分化影響的報道并不一致。本文擬探討OGP、低氧及二者聯(lián)合對BMSCs成脂肪分化的影響，以期為骨質(zhì)疏松癥的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SPF級昆明小鼠(昆明醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心)，成骨生長肽(北京博奧森)，PPARγ抗體(Bioss公司)，C/EBPα抗體(Proteintech公司)，GAPDH抗體(CST公司)，HIF-1α ELISA試劑盒(R&D公司)，低糖DMEM培養(yǎng)基(Sigma公司)，3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(Sigma公司)，胰島素(Sigma公司)，Platinum? SYBR? Green qPCR試劑盒(Invitrogen公司)，Golden Taq PCR試劑盒(北京天根生化公司)，Superscript III cDNA合成試劑盒(Invitrogen公司)，Trizol裂解液(Invitrogen公司)，地塞米松(Sigma公司)。

1.2 骨髓間充質(zhì)干細胞分離、培養(yǎng)與鑒定

骨髓單個核細胞分離于小鼠股骨骨髓腔，分離后檢測CD44、CD34、CD90、CD29細胞表面標志，同時結(jié)合細胞多向分化鑒定BMSCs[13]。

1.3 實驗分組

實驗共分為4組：A組(常氧條件下培養(yǎng))；B組(1% O2條件下培養(yǎng))；C組(常氧培養(yǎng)條件下添加10-9mol/L OGP)；D組(1%O2條件下添加10-9mol/L OGP)。根據(jù)既往實驗，本研究選擇1% O2與 10-9mol/L OGP作為干預(yù)濃度[10]。實驗均采用成脂肪誘導(dǎo)細胞培養(yǎng)基(含10%胎牛血清的低糖DMEM+10-6mol/L+0.5 mmol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤+10 μg/mL胰島素+100 μg/mL吲哚美辛)。

1.4 ELISA法檢測HIF-1α的表達

培養(yǎng)1 d后收集細胞上清液測定蛋白濃度，采用雙抗體夾心法檢測HIF-1α，最后在450 nm處檢測光密度值。具體實驗方法依照課題組既往實驗步驟進行法檢測[10]。HIF-1α檢測結(jié)果以pg/mg總蛋白表示。

1.5 油紅O染色

棄培養(yǎng)液，用1×PBS洗滌2次，中性甲醛固定30 min；隨后加入油紅O染液染色30 min，最后鏡下觀察脂滴。隨機選取5個高倍視野，計數(shù)陽性細胞，統(tǒng)計學(xué)處理。

1.6 實時熒光定量PCR檢測

培養(yǎng)14 d后收集細胞，隨后RNA提取及反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。引物序列見表1，擴增反應(yīng)條件為95 ℃變性2 min，40個循環(huán)(95 ℃ 15 s，54 ℃ 30 s，65 ℃ 20 s)。β-actin作為內(nèi)參，目的基因表達量以2-ΔΔCt法進行相對定量分析，將A組各基因表達量設(shè)定為1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.7 Western blot檢測

14 d后收集細胞，每組取等量蛋白進行電泳轉(zhuǎn)膜，5% 牛血清白蛋白封閉2 h，加入抗PPARγ(1∶1 000)及抗C/EBPα (1∶1 000)單克隆抗體4 ℃孵育過夜，隨后二抗GAPDH 抗體(1∶2 000)37 ℃孵育2 h；GAPDH 為內(nèi)參蛋白。目的蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值比值作為目的蛋白相對表達量。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 ELISA檢測

A組與C組幾乎未能檢測到HIF-1α蛋白表達。與A組對比，B組與D組能明顯上調(diào)HIF-1α蛋白的表達(P<0.01)；B組與D組HIF-1α蛋白表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 油紅O染色分析

油紅O染色將脂肪染成紅色。A組可見大量含脂滴的陽性細胞，B組與C組細胞脂滴生成減少，D組細胞脂滴生成明顯減少。B組、C組及D組與A組相比，B組、C組及D組脂肪滴形成明顯減少(P<0.01)；B組與C組相比，脂肪滴形成差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與B組及C組相比，D組脂肪滴形成明顯減少(P<0.01)。見圖1及圖2。

圖1 各組細胞培養(yǎng)14 d油紅O染色圖片F(xiàn)ig.1 Oil red O staining observation at 14d of culture in each group注：A：A組，B：B組，C：C組，D：D組。

圖2 脂肪滴形成細胞數(shù)Fig.2 The lipid positive BMSCs注：與A組相比，*P<0.01；與D組相比，△P<0.01。

2.3 實時熒光定量PCR分析

培養(yǎng)14 d后，低氧環(huán)境及成骨生長肽均能明顯降低PPARγ與C/EBPα mRNA的表達。與A組相比，B組、C組及D組中PPARγ與C/EBPα mRNA的表達明顯下調(diào)(P<0.01)；B組與C組相比差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與B組及C組相比，D組PPARγ與C/EBPα mRNA表達明顯降低(P<0.01)。見圖3。

圖3 PPARγ mRNA與C/EBPα mRNA表達水平的qPCR分析Fig.3 The mRNA expression of PPARγ and C/EBPα detected with qPCR注：與A組相比，*P<0.01；與D組相比，△P<0.01。

2.4 Western blot分析

Western blot檢測顯示，培養(yǎng)14 d后，低氧環(huán)境及成骨生長肽均能明顯降低PPARγ與蛋白水平的表達。與A組相比，B組、C組及D組中PPARγ與C/EBPα 蛋白表達明顯下調(diào)(P<0.01)；B組與C組差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與B組及C組相比，D組PPARγ與C/EBPα 蛋白表達降低(P<0.01)。見圖4。

3 討論

低氧適應(yīng)性反應(yīng)由hypoxia inducible factor (HIF)介導(dǎo)，在包括紅細胞生成、新生血管生成、血管舒張、無氧代謝等多方面發(fā)揮重要作用。HIF-α包括HIF-1α與HIF-2α[10]。α亞基是功能亞基，在常氧條件下不穩(wěn)定，因此不能檢出[10,14-15]。本實驗中ELISA法檢測到B組與D組培養(yǎng)24 h后HIF-1α蛋白表達明顯上調(diào)，而C組與D組未能檢測到HIF-1α蛋白的表達。表明我們實驗中采用1%的O2能引起低氧適應(yīng)性反應(yīng)。

圖4 PPARγ與C/EBPα 蛋白表達水平的Western-blot分析Fig.4 The protein expression of PPARγ and C/EBPα detected with western-blot注：與A組相比，*P<0.01；與D組相比，△P<0.01。

越來越多的研究表明HIF在干細胞的定向分化中發(fā)揮著重要作用，包括成肌分化、成骨分化、成神經(jīng)分化、成軟骨分化、成肌腱定向分化等[16-18]。課題組前期研究已經(jīng)表明1%低氧培養(yǎng)能促進BMSCs成骨分化，而關(guān)于低氧環(huán)境對BMSCs成脂肪分化影響的研究相對較少，且不同研究結(jié)論并不一致。Park等[11]研究表明1%O2培養(yǎng)通過HIF-1α依賴的方式阻止GSK3β入核及C/EBP與DNA結(jié)合能力，從而阻止3T3-L1細胞的成脂肪分化。Camacho-Cardenosa等[19]的研究表明在(17.2±0.3)% FiO2下12周高強度間歇訓(xùn)練比正常氧環(huán)境中(20.9% FiO2)12周高強度間歇訓(xùn)練更能降低肥胖女性減少脂肪含量，同時增加肌肉含量。Wagegg等[12]的研究表明2%O2培養(yǎng)環(huán)境能以HIF依賴的方式抑制干細胞成脂肪分化而促進成骨分化。Wang等[20]的研究發(fā)現(xiàn)間歇低氧，即每個循環(huán)1%O210 min隨后21% O25 min，能促進脂肪前體祖細胞向脂肪細胞的分化。伍志偉等[21]的研究發(fā)現(xiàn)3%、6%、12%、20% O2培養(yǎng)均能促進骨髓間充質(zhì)干細胞的成脂肪分化。Jiang等[22]研究發(fā)現(xiàn)0.2%的低氧環(huán)境培養(yǎng)通過上調(diào)HIF-1α和C/EBP表達，促進間充質(zhì)干細胞的成脂分化。Weiszenstein等[23]的研究發(fā)現(xiàn)4%的低氧環(huán)境明顯促進小鼠3T3-L1細胞脂滴形成和成脂分化，而1%低氧環(huán)境減少細胞脂滴聚集并抑制成脂分化。本實驗結(jié)果表明1% O2培養(yǎng)能夠明顯減少細胞中脂滴的形成及下調(diào)成脂肪分化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子PPARγ和C/EBPαmRNA和蛋白水平的表達，抑制小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞成。筆者推測不同研究中低氧對間充質(zhì)干細胞成脂分化作用不一致，可能與不同實驗中低氧的濃度不同、低氧的給養(yǎng)方式及不同的細胞種類有關(guān)。這需要下一步對上述不同因素進行對比研究以確定相關(guān)不同因素的影響作用。

成骨生長肽是一種內(nèi)源性多肽。已經(jīng)有大量的體外研究表明OGP能促進成骨前體細胞的成骨分化，顯示出其在骨質(zhì)疏松癥治療中的潛在作用靶點[24-25]；同時也有研究[5-6]表明OGP與支架材料復(fù)合后能增強支架材料的骨誘導(dǎo)性能，促進骨組織的修復(fù)。Chen等[7]研究發(fā)現(xiàn)OGP不僅能促進BMSCs成骨分化，同時也能明顯抑制其成脂分化。本研究表明在體外OGP能明顯減少BMSCs脂滴的形成，同時下調(diào)PPARγ和C/EBPα的表達，抑制小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞成脂肪分化，且與低氧環(huán)境對BMSCs成脂分化抑制具有協(xié)同作用。

BMSCs能夠定向分化為多種終末細胞。越來越多的研究[1,4]表明MSCs成骨成脂分化失衡是骨質(zhì)疏松癥發(fā)病的重要機制之一。間充質(zhì)干細胞的成脂分化受到信號通路的調(diào)控，其中PPARγ和C/EBPα是間充質(zhì)干細胞成脂分化中最為重要的轉(zhuǎn)錄因子，能夠誘導(dǎo)脂肪細胞關(guān)鍵基因的表達，是終末脂肪細胞形成所必須的[26-27]。本實驗結(jié)果顯示，1%O2與OGP均能明顯抑制PPARγ和C/EBPα mRNA和蛋白水平的表達，表明二者均能抑制干細胞的成脂分化。同時，課題組前期研究已經(jīng)表明低氧及OGP均能明顯促進間充質(zhì)干細胞的成骨分化[10]，因此筆者認為低氧與OGP在包括骨質(zhì)疏松癥在內(nèi)的成骨成脂分化失衡等脂代謝紊亂疾病中具有良好的臨床應(yīng)用前景。但是，目前尚未見到關(guān)于OGP對BMSCs成脂分化影響相關(guān)分子機制的報道，而關(guān)于低氧對BMSCs成脂分化影響相關(guān)分子機制報道也相對較少。Wang等[28]的研究表明低頻間歇低氧可能是通過巨噬細胞極化導(dǎo)致小鼠皮下脂肪組織的成脂肪分化能力降低。Wang等[20]的體外研究表明低頻間歇低氧是通過激活(IGF-1R)/Akt信號通路而促進脂肪前體細胞的成脂肪分化。

綜上，本實驗研究發(fā)現(xiàn)1%O2環(huán)境培養(yǎng)與OGP均能明顯抑制間充質(zhì)干細胞的成骨分化，且二者聯(lián)合應(yīng)用時具有協(xié)同效應(yīng)，對間充質(zhì)干細胞具有更強成脂肪分化抑制作用。但是目前關(guān)于低氧與OGP對BMSCs成脂分化影響的分子機制并不清楚，我們下一步將就OGP與低氧對BMSCs成脂分化影響的相關(guān)分子機制進行研究。