基于Wnt/β-catenin信號通路探討太白楤木抗去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松癥的作用和機制

潘亞磊 張玉苗 楊易寧 李引剛 劉艷平*

1.陜西中醫(yī)藥大學，陜西 咸陽 712046 2.陜西中藥資源產(chǎn)業(yè)化省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心/秦藥特色資源研究開發(fā)國家重點實驗室(培育)/陜西省創(chuàng)新藥物研究中心，陜西 咸陽 712083 3.陜西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，陜西 咸陽 712000

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥是指婦女絕經(jīng)后由于卵巢功能迅速衰退，體內(nèi)雌激素水平明顯下降，導(dǎo)致骨量降低為主要特征的一種全身代謝性疾病。目前治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的藥物有膦酸鹽類、生長激素類、氟化物等，這些藥物雖然可調(diào)節(jié)骨代謝，但在療效和不良反應(yīng)上仍然有待改進[1-2]。

中醫(yī)將骨質(zhì)疏松癥歸為“骨痿”“骨枯”等范疇，認為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病與肝、脾、腎關(guān)系最為密切，對于其治療大多從補腎健脾益肝方面進行辨證施治[3]。太白楤木Aralia taibaiensis，又名飛天蜈蚣七，為楤木屬 Aralia Linn.的多年生植物太白楤木的干燥根莖?！侗静菔斑z》中記載太白楤木性溫，味微咸，歸肝、心、腎三經(jīng)，具有補肝腎，壯筋骨，祛風濕，利小便，散瘀血，消腫毒之功效[4]。研究表明，太白楤木主要含有皂苷類、黃酮類、多糖類、揮發(fā)油類和微量元素等活性成分，具有降血糖、降血脂、抗衰老、抗菌、抗病毒以及抗腫瘤等藥理作用[5-6]。在骨科臨床實踐中，著名草醫(yī)徐家成將太白楤木鮮根皮搗爛敷于局部，可促進患者骨折愈合[7]；全國名老中醫(yī)李彥民教授將太白楤木作為治療骨質(zhì)疏松癥的主藥，具有良好療效[8]。前期研究發(fā)現(xiàn)太白楤木提取物可保護成骨細胞的活力、促進增殖、成骨分化和礦化[9]。為了系統(tǒng)考察太白楤木對骨質(zhì)疏松癥的作用，本研究采用去卵巢大鼠構(gòu)建骨質(zhì)疏松癥模型，探討太白楤木防治骨質(zhì)疏松癥的作用和機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

3月齡未經(jīng)產(chǎn)SPF級SD雌性大鼠40只，體重(260±15) g，購自成都達碩實驗動物有限公司[生產(chǎn)許可證號SCXK(川)2020 -030]。大鼠飼養(yǎng)于陜西中醫(yī)藥大學陜西中藥資源產(chǎn)業(yè)化省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心SPF 級動物飼養(yǎng)室[SYXK(陜)2017-004]，室溫22 ℃～26 ℃，相對濕度30%～70%，自由進食飲水，12 h 間隔照明。

1.2 藥物、試劑與器材

太白楤木(產(chǎn)地陜西太白縣)購自寶雞市科興藥業(yè)有限公司，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學王繼濤教授鑒定為五加科楤木屬植物太白楤木 Aralia taibaiensis的干燥根皮；仙靈骨葆膠囊(批號2101002，貴州同濟堂制藥有限公司)。

骨堿性磷酸酶(BALP)、Ⅰ型膠原交聯(lián)氨基端肽(NTX-Ⅰ)和抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)ELISA檢測試劑盒(批號：ml003415、ml028329和ml059485，上海酶聯(lián)生物科技有限公司)；戊巴比妥鈉(批號：20191011，美國Sigma公司)；青霉素鈉(批號：20120603，哈藥集團)；蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(批號：BA-4022，海珠貝索生物技術(shù)有限公司)；骨蛋白提取試劑盒(批號：20201225，上海貝博生物科技有限公司)；BCA 蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGA凝膠制備試劑盒(批號分別為 PC0020、P1200，北京索萊寶科技有限公司)；抗體Wnt3a(2721 T)、β-catenin(8480 T)、p-β-catenin(2009)、RUNX2(12556 S)、β-actin(3700)、兔二抗(7074)均購自美國Cell Signaling Technology公司。

骨結(jié)構(gòu)分析儀(eXplore Locus，美國GE公司)；Mini BionixⅡ材料試驗機(MTS 858，美國MTS公司)；倒置熒光顯微鏡(IX73-DP73，日本Olympus公司)；全波長酶標儀(Multiskan GO，美國Thermo公司)；高速冷凍離心機(5910R，德國Eppendorf公司)；電泳儀(PAC300，美國Bio-Rad公司)；化學發(fā)光分析儀(XRS+，美國Bio-Rad公司)。

1.3 太白楤木提取液的制備

取太白楤木1 kg，加入12 L體積水浸泡6 h后，煎煮2次，每次60 min，過濾后合并提取液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至1 L，即含生藥量1 g/mL，保存于4 ℃冰箱備用。

1.4 造模、分組及給藥

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機分為假手術(shù)組、模型組、仙靈骨葆膠囊組(0.3 g/kg)、太白楤木低劑量組(0.4 g/kg)和太白楤木高劑量組(0.8 g/kg)，每組8只。假手術(shù)組在卵巢周圍切除少量脂肪，其余組行雙側(cè)卵巢摘除術(shù)，術(shù)后連續(xù)3 d青霉素肌注。仙靈骨葆膠囊、太白楤木低劑量和太白楤木高劑量分別用蒸餾水配置成質(zhì)量濃度為0.03 g/mL、0.04 g/mL和0.08 g/mL的溶液。術(shù)后一周各組灌胃給予相應(yīng)藥物，灌胃體積10 mL/kg，假手術(shù)組和模型組給予等量蒸餾水，1次/d，連續(xù)12周。

1.5 樣本的收集與測定

給藥結(jié)束后，大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉后，經(jīng)腹主動脈采血。冰上靜置30 min后，4 ℃下2 000 r/min離心20 min，取上清-80 ℃保存?zhèn)溆?。取大鼠左右?cè)的股骨、脛骨，剔除附著的肌肉及結(jié)締組織。左脛骨置于4%福爾馬林；右脛骨于-80 ℃的冰箱中保存；左股骨用浸泡過生理鹽水的紗布包裹，于-80 ℃的冰箱中保存?zhèn)溆茫挥夜晒怯?5%的乙醇固定保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 生物力學性能測定

左股骨室溫復(fù)溫后，將樣本放置在材料力學測試機兩個支撐的橫桿上，支點距離為20 mm，于股骨中段施加載荷速度2 mm/min，直至股骨斷裂，游標卡尺測定中段內(nèi)外長短徑，軟件記錄參數(shù)值。

1.7 Micro-CT分析

采用micro-CT掃描大鼠右股骨遠端形態(tài)結(jié)構(gòu)，分辨率為20 μm。采用軟件對感興趣區(qū)域的骨密度、骨組織比例、骨小梁數(shù)量及骨小梁連接密度進行分析。所有標本的分析范圍保持一致。

1.8 ELISA法檢測血清骨代謝指標

血清樣本解凍后混勻，按照試劑盒說明書采用ELISA檢測試劑盒檢測血清中骨堿性磷酸酶(BALP)、Ⅰ型膠原交聯(lián)氨基端肽(NTX-Ⅰ)和抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)含量。

1.9 蘇木素-伊紅染色

各組大鼠脛骨固定2周，經(jīng)脫鈣、包埋、切片后，進行蘇木素-伊紅染色。再經(jīng)脫水、透明、封片后，于顯微鏡下觀察骨組織形態(tài)及骨丟失情況。

1.10 Western blot檢測

將脛骨切開，液氮中將其研磨粉碎成粉末，加入細胞裂解液。蛋白定量后，變性上樣，凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜后封閉 2 h，加入一抗4 ℃孵育過夜，更換二抗，室溫孵育 2 h?；瘜W發(fā)光顯色、分析。

1.11 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差表示，采用 SPSS 20.0 軟件進行分析，組間比較采用單因素方差齊性分析，若方差齊，組間比較采用 LSDt檢驗；若方差不齊，組間比較采用 Dunnett’st檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠股骨生物力學變化

股骨三點彎曲試驗表明，假手術(shù)組的最大載荷、剛度和最大應(yīng)力均高于模型組，兩組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與模型組相比，仙靈骨葆膠囊組和太白楤木高劑量組最大載荷、剛度和最大應(yīng)力均顯著提高(P<0.01)，見表1。

表1 各組大鼠左側(cè)股骨三點彎曲試驗結(jié)果Table 1 Three-point bending test results of the left femur of rats in each group

2.2 大鼠股骨骨密度和微結(jié)構(gòu)變化

各組大鼠股骨遠端微結(jié)構(gòu)見圖1，骨密度和骨小梁參數(shù)見表2。與假手術(shù)組相比，模型組骨密度、骨組織比例、骨小梁數(shù)量和骨小梁厚度顯著下降，骨小梁分離度顯著增大(P<0.01)；與模型組相比，仙靈骨葆膠囊組和太白楤木高劑量組可提高骨密度、骨組織比例、骨小梁數(shù)量和骨小梁厚度，減小骨小梁分離度，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

圖1 各組大鼠股骨影像學變化Fig.1 Micro-CT imaging of the distal femurs of rats in each group

表2 各組大鼠股骨骨密度和微結(jié)構(gòu)參數(shù)Table 2 Bone mineral density and microstructure parameters of the distal femurs of rats in each group

2.3 大鼠骨代謝相關(guān)生化指標

與假手術(shù)組相比，模型組血清BALP水平顯著降低，NTX-Ⅰ和TRAP水平則顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，仙靈骨葆膠囊組和太白楤木高劑量組可顯著提高BALP水平(P<0.01)，仙靈骨葆膠囊組、太白楤木低劑量組和太白楤木高劑量組顯著降低NTX-Ⅰ和TRAP水平，見表3。

表3 各組大鼠血清骨代謝指標Table 3 Serum bone metabolism markers of rats in each group

2.4 大鼠骨組織形態(tài)學觀察

脛骨近端骨小梁組織切片如圖2所示，假手術(shù)組大鼠骨小梁致密，骨小梁網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)正常；模型組大鼠骨小梁疏松變薄，導(dǎo)致骨小梁間隙變寬；仙靈骨葆膠囊組骨小梁接近假手術(shù)組；太白楤木低劑量組和太白楤木高劑量組大鼠的骨小梁數(shù)量和連接增加明顯。

圖2 大鼠骨組織形態(tài)學觀察(HE，×40)Fig.2 Bone histomorphometry of rats (HE, ×40)

2.5 大鼠骨組織相關(guān)蛋白表達水平及磷酸化對比

模型組Wnt3a、β-catenin和RUNX2蛋白表達水平均低于假手術(shù)組，p-β-catenin蛋白水平則高于假手術(shù)組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與模型組相比，仙靈骨葆膠囊組和太白楤木高劑量組可提高Wnt3a、β-catenin和RUNX2蛋白表達，降低p-β-catenin蛋白水平，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見圖3、表4。

圖3 Western blot檢測結(jié)果Fig.3 Results of Western blotting注：1：假手術(shù)組；2：模型組；3：仙靈骨葆膠囊組；4：太白楤木低劑量組；5：太白楤木高劑量組

表4 各組大鼠骨組織相關(guān)蛋白表達及磷酸化水平Table 4 Expressions and phosphorylation levels of bone-related proteins in rats in each group

3 討論

骨質(zhì)疏松癥患者初期癥狀不明顯，致使就診率低，老年人多以骨質(zhì)疏松性骨折為首發(fā)癥狀和就診原因，因此防治骨質(zhì)疏松性骨折發(fā)生也成為治療骨質(zhì)疏松癥的重要目標[10]。三點彎曲試驗是測定骨折過程中骨所能承受力學參數(shù)的常用試驗。本研究采用三點彎曲試驗對各組大鼠股骨骨折時的生物力學性能進行測定，結(jié)果顯示太白楤木可在一定程度上逆轉(zhuǎn)因去卵巢導(dǎo)致的大鼠骨生物力學性能下降。此外，骨質(zhì)疏松癥患者骨質(zhì)減少往往導(dǎo)致骨小梁微結(jié)構(gòu)的損傷，也會造成易發(fā)生骨折[11]。本研究顯示，太白楤木可在一定程度上提高去卵巢大鼠骨密度，保護骨小梁微結(jié)構(gòu)不被破壞。

骨形成和骨吸收的偶聯(lián)是骨代謝的基本過程，當長期骨吸收的速率大于骨形成時便引發(fā)骨質(zhì)疏松癥。血清BALP可以反映成骨細胞活性，Song等[12]研究發(fā)現(xiàn)婦女絕經(jīng)后血清BALP 水平降低。血清膠原降解標志物NTX-Ⅰ和破骨細胞分泌的TRAP水平則反映了骨吸收的速率[13]。大鼠去卵巢后骨吸收增強，成骨活性減弱，對照藥仙靈骨葆膠囊可提高去卵巢大鼠骨形成標志物，降低骨吸收標志物，與任世元等[14]研究結(jié)果一致。本研究骨代謝指標結(jié)果顯示，太白楤木可在一定程度上調(diào)節(jié)骨代謝。

Wnt/β-catenin信號通路不僅可通過成骨細胞調(diào)控骨形成，還能負向調(diào)控破骨細胞的分化來維持骨穩(wěn)態(tài)，在骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生中具有重要作用[15]。Wnt3a可調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細胞向成骨細胞分化，提高成骨細胞ALP 的活性和加強骨保護素的表達，最終促進成骨[16]。前期體外研究表明，太白楤木提取物可通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號通路，進而提高大鼠成骨細胞的活力、增殖、分化和礦化[9]。本研究進一步在體內(nèi)水平發(fā)現(xiàn)，太白楤木提取物可激活Wnt/β-catenin信號通路，進而促進下游成骨特異性蛋白RUNX2的表達。RUNX2的高表達可促進成骨細胞合成骨基質(zhì)[17]。太白楤木對Wnt/β-catenin信號通路的調(diào)節(jié)作用可能是其防治去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松癥的機制。

綜上所述，太白楤木可以明顯改善去卵巢誘導(dǎo)的大鼠骨質(zhì)疏松癥，其可能是通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號通路來實現(xiàn)的。