高效液相色譜法測(cè)定兩面針?biāo)幉闹?種成分含量*

馬 慶，魏偉鋒，袁煥合，許 雷，張洪勝，鄔國(guó)松，陳劍洪，韓正洲，林錦鋒△

（1.華潤(rùn)三九醫(yī)藥股份有限公司，廣東 深圳 518110；2.廣東省藥品檢驗(yàn)所，廣東 廣州 510663；3.廣東省廣州市白云區(qū)人民醫(yī)院，廣東 廣州 510006）

兩面針Zanth oxylum nitidum（Roxb.）DC.以蔓椒之名始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》［1］，列為下品，亦收載于《名醫(yī)別錄》《本草經(jīng)集注》《本草圖經(jīng)》《本草術(shù)原》等本草名著，別名甚多。其味苦、辛，性平，有小毒，歸肝、胃經(jīng)，有活血化瘀、行氣止痛、祛風(fēng)通絡(luò)、解毒消腫功效，可外用治療跌撲損傷、胃痛、牙痛、風(fēng)濕痹痛、毒蛇咬傷、燒燙傷等［2］。兩面針是60余種中成藥的組方藥材之一，藥理作用廣泛，臨床應(yīng)用價(jià)值較高，市場(chǎng)需求逐年上升。2020年版《中國(guó)藥典（一部）》收錄兩面針的藥用部位為根，對(duì)其質(zhì)量要求為含氯化兩面針堿（C21H18NO4·Cl）不得少于0.13%，加之其生長(zhǎng)年限長(zhǎng)、產(chǎn)量低、可再生能力差、土地沙漠化等因素，致使其嚴(yán)重供不應(yīng)求。而歷代本草、地方標(biāo)準(zhǔn)及方劑均有其不同藥用部位（包括果實(shí)、根、莖、葉）的記載，但多以根和莖入藥（見表1）。有研究證實(shí)，兩面針根部和莖的成分種類基本一致［3-4］，且藥理作用及其對(duì)應(yīng)的藥效也基本相似［5-6］。兩面針?biāo)幉闹械闹饕钚猿煞譃槁然瘍擅驷槈A、白屈菜紅堿、8-甲氧基二氫白屈菜紅堿及橙皮苷等化合物，其中前兩種成分含量較高［3，7］。因此，本研究中擬采用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定上述2種成分含量，以期為兩面針?biāo)幉馁Y源的可持續(xù)發(fā)展、合理開發(fā)利用提供參考?，F(xiàn)報(bào)道如下。

表1 兩面針?biāo)幱貌课籘ab.1 Medicinal parts of Zanthox yl um nit id um

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1100型高效液相色譜儀（含DAD檢測(cè)器，美國(guó)Agilent公司）；CP225D型分析天平（德國(guó)Sartorius公司）；UV-2550型紫外-可見分光光度計(jì)（日本Shimadzu公司）；Milli-Q超純水處理系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司）。

1.2 試藥

氯化兩面針堿對(duì)照品（批號(hào)為110848-201604，含量91.0%），白屈菜紅堿對(duì)照品（批號(hào)為111718-201402，含量80.5%），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。兩面針根部與莖部樣品共21批（編號(hào)1～21，相關(guān)情況見表2），經(jīng)廣西壯族自治區(qū)中醫(yī)藥研究院賴茂祥研究員鑒定為正品（憑證標(biāo)本存放于該研究院標(biāo)本館）。

表2 樣品信息Tab.2 Information of the samples

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Thermo BETASIL C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：含0.2%三乙胺的0.3%磷酸溶液-乙腈（77∶23，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：273 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10μL。

2.2 溶液制備

稱取氯化兩面針堿對(duì)照品12.51 mg、白屈菜紅堿對(duì)照品10.78 mg，精密稱定，置20 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，即得含氯化兩面針堿569.205μg/mL、白屈菜紅堿433.895μg/mL的混合對(duì)照品溶液。取藥材樣品適量，研為粉末，取0.5 g（過二號(hào)篩），精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入90%甲醇100 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流60 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用90%甲醇溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：精密吸取2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、供試品溶液各適量，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。供試品溶液色譜中，在與混合對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置有吸收峰。理論板數(shù)按氯化兩面針堿峰及白屈菜紅堿峰計(jì)均應(yīng)不低于3 000，分離度均大于1.5，基線分離良好。詳見圖1。

線性關(guān)系考察：取2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，加甲醇稀釋，得氯化兩面針堿質(zhì)量濃度分別為113.841，45.536，22.768，11.384，4.554，1.821μg/mL，白屈菜紅堿質(zhì)量濃度分別為86.779，34.712，17.356，8.678，3.471，1.388μg/mL的系列混合對(duì)照品溶液。按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以待測(cè)成分進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X，μg）、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得氯化兩面針堿回歸方程為Y1=4 112.864X1-18.523（r=0.999 9，n=5），白屈菜紅堿回歸方程為Y2=5 594.700X2-20.357（r=0.999 9，n=5）。結(jié)果表明，氯化兩面針堿、白屈菜紅堿進(jìn)樣量分別在0.018 2～1.138μg和0.013 9～0.868μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：取藥材樣品（編號(hào)為1），按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，平行測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果氯化兩面針堿、白屈菜紅堿峰面積的RSD分別為1.00%和0.80%（n=6），表明方法精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取2.2項(xiàng)下供試品溶液，室溫下放置0，2，4，8，16，24，48 h時(shí)，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果氯化兩面針堿和白屈菜紅堿峰面積的R S D分別為0.30%和1.00%（n=7），表明供試品溶液室溫放置48 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取1號(hào)樣品，按2.2項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，再按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算含量。結(jié)果氯化兩面針堿和白屈菜紅堿含量的RS D分別為0.70%和2.10%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含0.168 6%（未扣除水分）氯化兩面針堿、0.138 7%（未扣除水分）白屈菜紅堿為的1號(hào)樣品共6份，每份約0.25 g，精密稱定，分別精密加入一定質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液，再定容至100 mL，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算回收率。結(jié)果見表3。

表3 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.3 Results of the recovery test（n=6）

2.4 樣品含量測(cè)定

取21批藥材樣品，分別按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，以外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算含量。結(jié)果見表4。

表4 樣品含量測(cè)定結(jié)果（%）Tab.4 Results of content determination of nitidine chloride and chelerythrine in the samples（%）

可見，21批藥材樣品中氯化兩面針堿和白屈菜紅堿總含量為0.068%～0.395%，平均0.219%，因各批次間的測(cè)定結(jié)果較分散，以該值下調(diào)30%，即得含量為0.153%。故建議，規(guī)定本品含氯化兩面針堿和白屈菜紅堿的總含量不得少于0.150%。在該條件下，21批藥材樣品中有6批不符合規(guī)定。

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇

預(yù)試驗(yàn)中，分別在200～500 nm紫外波長(zhǎng)范圍內(nèi)對(duì)氯化兩面針堿對(duì)照品溶液、白屈菜紅堿對(duì)照品溶液和混合對(duì)照品溶液進(jìn)行掃描，結(jié)果分別在272，282，273 nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰。因本研究需同時(shí)測(cè)定此兩種成分含量，故確定紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為273 nm。

3.2 色譜柱和流動(dòng)相選擇

預(yù)試驗(yàn)中，以含0.2%三乙胺的0.3%磷酸溶液-乙腈（78∶22，V/V）為流動(dòng)相，比較了Thermo公司BETASIL C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）和BDS HYPERSIL C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm），結(jié)果前者峰形較好，而后者色譜峰拖尾較嚴(yán)重，故采用前者作為本研究的色譜柱。還比較了（A）0.1%甲酸（用三乙胺調(diào)pH至4.5）-乙腈（75∶25，V/V）、（B）含0.2%三乙胺的0.3%磷酸溶液-乙腈（77∶23，V/V）、（C）1 mmol/L庚烷磺酸鈉（用3 mol/L磷酸調(diào)pH至2.6）-乙腈（70∶30，V/V）3種流動(dòng)相，結(jié)果以流動(dòng)相（B）峰形最好。

3.3 提取方式考察

預(yù)試驗(yàn)中，考察了2種提取方式（超聲提取、加熱回流），并在此基礎(chǔ)上采用3因素、3水平的正交試驗(yàn)考察提取溶劑（50%，70%，90%甲醇）、提取時(shí)間（30，60，90 min）、溶液用量（25，50，100 mL）對(duì)提取效果的影響。結(jié)果表明，加熱回流提取效果略優(yōu)于超聲提取，故選擇加熱回流提??；對(duì)提取得率的影響從大到小為甲醇體積分?jǐn)?shù)＞溶劑體積＞提取時(shí)間，故最佳的提取條件以90%甲醇100 mL為溶劑，提取60 min。由此制備的供試品溶液色譜峰數(shù)目最多，峰面積較大，峰形較好。

3.4 方法評(píng)價(jià)

兩面針含較多種化學(xué)成分，目前標(biāo)準(zhǔn)中的薄層色譜鑒別和含量測(cè)定項(xiàng)目?jī)H針對(duì)其個(gè)別成分，不能綜合反映兩面針?biāo)幉闹懈髦饕煞趾?。因此，本研究中利用HPLC法對(duì)氯化兩面針堿和白屈菜紅堿進(jìn)行定量分析。本方法重復(fù)性好，可操作性強(qiáng)，可用于兩面針?biāo)幉恼w化學(xué)質(zhì)量的一致性評(píng)價(jià)。

藥材樣品中氯化兩面針堿和白屈菜紅堿總含量（以下簡(jiǎn)稱總含量）最高的是20號(hào)（越南-2），最低為14號(hào)（廣東高州市鎮(zhèn)江鎮(zhèn)）。在栽培的藥材樣品中，同樣為5年生栽培樣品，2號(hào)（廣西大新縣福隆鄉(xiāng)）總含量明顯高于1號(hào)（廣東電白區(qū)麻崗鎮(zhèn)），且廣東藥材樣品指標(biāo)性成分含量普遍低于廣西藥材樣品。就本研究中建議總含量不得少于0.150%的結(jié)果而言，廣西更適合兩面針的種植，且種植時(shí)間為5～6年，該結(jié)果在一定程度佐證了廣西為兩面針的道地產(chǎn)區(qū)，同時(shí)也為兩面針的采收時(shí)間提供了一定參考。由于本研究中收集的21批藥材采收時(shí)期、生長(zhǎng)年份不同，同時(shí)也受到地域水土、氣候等因素影響，可能導(dǎo)致藥材化學(xué)成分含量差異較大，后續(xù)將會(huì)收集更多的藥材樣品對(duì)本研究進(jìn)行深入分析。

綜上所述，本研究中對(duì)不同來源（栽培、野生、藥材市場(chǎng)）21批兩面針?biāo)幉臉悠罚ㄇo、根）進(jìn)行含量測(cè)定，并制訂了氯化兩面針堿和白屈菜紅堿總含量限度，可有效評(píng)價(jià)兩面針根及莖的質(zhì)量，為兩面針資源的可持續(xù)發(fā)展及合理開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。