乳疾清合劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高研究*

梁欣健，姜倩娥，王葉茗

1 廣州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，廣東 廣州 510801；2 廣州市天河區(qū)中醫(yī)醫(yī)院

乳疾清合劑是廣州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院的醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑，由延胡索、玄參、青皮、半夏、石菖蒲、雞內(nèi)金、全蝎、薺苨等25 味中藥組成［1］，具有行氣活血、化痰散結(jié)的作用，臨床主要用于治療乳腺增生、乳腺腫瘤等乳腺囊性增生性疾?。?］。

乳疾清合劑已有近二十年的使用歷史，由治療乳腺增生疾病的民間經(jīng)驗(yàn)方“寶丹化積方”開(kāi)發(fā)而成，但乳疾清合劑現(xiàn)行的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)缺乏有效的質(zhì)量控制指標(biāo)，為提高乳疾清合劑的質(zhì)量控制要求，課題組開(kāi)展了乳疾清合劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高研究工作，建立采用薄層色譜鑒定法研究乳疾清合劑的定性鑒別方法，參考《中華人民共和國(guó)藥典》2015 年版四部通則中的微生物限度檢查方法進(jìn)行驗(yàn)證性考察，并建立微生物限度檢查方法，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料

1.1 儀器SW-CJ 型系列潔凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；RS-232 型精密電子天平［西特傳感技術(shù)（天津）有限公司］；HPX-9162 MBE 型數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱（上海海迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；ZRH-150B 型生化培養(yǎng)箱（廣東省醫(yī)療器械廠）；LRH-150-M 型霉菌培養(yǎng)箱（廣東省醫(yī)療器械廠）；立式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；PYX-DHS-35 型電熱恒溫水浴鍋（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；KQ-100DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；RE-2000A 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海左樂(lè)儀器有限公司）。

1.2 試藥乳疾清合劑（廣州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院制劑室，批號(hào)：160501，160502，160503）；延胡索對(duì)照藥材（批號(hào)：120928-201208）、延胡索乙素對(duì)照品（批號(hào)：110726-201213）、玄參對(duì)照藥材（批號(hào)：121008-201308）、法半夏對(duì)照藥材（批號(hào)：121172-201103）及青皮對(duì)照藥材（批號(hào)：121155-200502）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；金黃色葡萄球菌［批號(hào)：CMCC（B）26003］、銅綠假單胞菌［批號(hào)：CMCC（B）10104］、枯草芽孢桿菌［批號(hào)：CMCC（B）63501］、白色念珠菌［批號(hào)：CMCC（B）98001］、黑曲霉［批號(hào)：CMCC（B）98003］、大腸埃希菌［批號(hào)：CMCC（B）44102］、沙門(mén)菌［批號(hào)：CMCC（B）50094］均購(gòu)自中國(guó)藥品食品檢定研究院。硅膠G 薄層層析板、硅膠GF254 薄層層析板購(gòu)自青島海洋化工有限公司；胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)：20160621）、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（批號(hào)：20160702）、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)：20160708）、麥康凱液體培養(yǎng)基（批號(hào)：20160624）、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基（批號(hào)：20160711）、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)：20160224）、RV 沙門(mén)菌增菌液體培養(yǎng)基（批號(hào)：20160405）、木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)：20160408）、無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（批號(hào)：20160316）均購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司；聚山梨酯-80（批號(hào)：20160503）購(gòu)自湖南爾康制藥有限公司，濃氨水、乙醚、甲醇、甲苯、丙酮、正丁醇、三氯甲烷、香草醛、硫酸、乙酸乙酯、甲酸為分析純，購(gòu)自廣州化學(xué)試劑廠，水為制劑生產(chǎn)用純化水。

2 方法和結(jié)果

2.1 薄層鑒別

2.1.1 延胡索取乳疾清合劑60 mL，加濃氨水將其pH值調(diào)至11，加乙醚提取2次，每次30 mL，合并乙醚液，置水浴鍋蒸干，殘?jiān)蛹状? mL 使溶解，作為供試品溶液。另取延胡索對(duì)照藥材1 g，加甲醇50 mL，超聲處理30 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL 使溶解，加濃氨水將其pH 值調(diào)至11，用乙醚振搖提取3 次，每次10 mL，合并乙醚液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL 使溶解，制成延胡索對(duì)照藥材溶液。再取延胡索乙素對(duì)照品，加甲醇制成每毫升含0.5 mg 的溶液，作為對(duì)照品溶液。吸取上述3種溶液各2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-丙酮（9∶2）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品色譜中在與對(duì)照藥材及對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對(duì)照樣品無(wú)干擾，見(jiàn)圖1。

圖1 乳疾清合劑延胡索在紫外光（365 nm）下的薄層色譜圖

2.1.2 玄參取乳疾清合劑80 mL，加水飽和的正丁醇溶液振搖提取2 次，每次30 mL，合并正丁醇液，續(xù)用氨水洗滌2 次，每次20 mL，合并正丁醇部分的溶液，用正丁醇飽和的水溶液洗滌2 次，每次20 mL，合并正丁醇部分的溶液并置水浴鍋蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。另取玄參對(duì)照藥材1 g，加水飽和的正丁醇溶液20 mL，超聲處理20 min，濾過(guò)，濾液用氨試液洗滌2 次，每次20 mL，合并正丁醇部分的溶液，用正丁醇飽和的水洗滌2 次，每次20 mL，合并正丁醇部分的溶液并置水浴鍋蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為玄參對(duì)照藥材溶液。吸取上述兩種溶液各2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以三氯甲烷-甲醇（6∶1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置日光下檢視。供試品色譜中在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照樣品無(wú)干擾，見(jiàn)圖2。

圖2 乳疾清合劑玄參在日光下薄層色譜圖

2.1.3 青皮取“2.1.2”項(xiàng)下供試品溶液作為本項(xiàng)的供試品溶液。另取青皮對(duì)照藥材0.3 g，加水飽和的正丁醇溶液20 mL，超聲處理20 min，濾過(guò)，濾液用氨試液洗滌2 次，每次20 mL，合并正丁醇部分的溶液，用正丁醇飽和的水溶液洗滌2 次，每次20 mL，合并正丁醇部分的溶液并置水浴鍋蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為青皮對(duì)照藥材溶液。吸取上述兩種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以乙酸乙酯-甲醇-水（100∶17∶13）為展開(kāi)劑，展至約3 cm，取出，晾干，再以甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水（20∶10∶1∶1）的上層溶液為展開(kāi)劑，展至約8 cm，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品色譜中在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，見(jiàn)圖3。

圖3 乳疾清合劑青皮在紫外光（365 nm）下薄層色譜圖

2.2 微生物限度檢查

2.2.1 菌液制備參照《中華人民共和國(guó)藥典》2015 年版四部通則中關(guān)于微生物限度檢查方法，分別將金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、沙門(mén)氏菌和枯草芽孢桿菌接種至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基上，在30～35℃下培養(yǎng)18～24 h，然后用pH 為7.0 無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液將上述細(xì)菌培養(yǎng)液配制成適宜濃度的菌懸液。將黑曲霉接種至沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基，20～25℃培養(yǎng)5～7天，然后取3～5 mL 預(yù)先配好的含有0.05%聚山梨酯80的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液，其中加入黑曲霉培養(yǎng)液，將孢子洗脫，吸出孢子菌液至滅菌試管內(nèi)，制成適宜濃度的黑曲霉孢子懸液。將白色念珠菌接種至沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基，20～25℃下培養(yǎng)2～3天，然后將白色念珠菌培養(yǎng)液加入到0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液中，制成適宜濃度的菌懸液。

2.2.2 供試品溶液制備以乳疾清合劑作為供試液。

2.2.3 需氧菌總數(shù)、霉菌及酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)

2.2.3.1 對(duì)照組菌落數(shù) 取供試品溶液1 mL 注入平皿中，傾注加入培養(yǎng)基，待凝結(jié)后按照預(yù)設(shè)定的條件進(jìn)行培養(yǎng)，計(jì)算對(duì)照組計(jì)數(shù)菌落數(shù)（A）。

2.2.3.2 試驗(yàn)組菌落數(shù) 取1 mL供試品溶液，分別加入小于100 CFU的銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌菌液、白色念珠菌和黑曲霉菌菌液，混勻后在其中傾注加入培養(yǎng)基，待凝結(jié)后，按照預(yù)設(shè)定的條件進(jìn)行培養(yǎng)，計(jì)算試驗(yàn)組菌落數(shù)（B）。

2.2.3.3 菌液組 分別取小于100 CFU的銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌菌液、白色念珠菌和黑曲霉菌菌液直接注入培養(yǎng)皿中，然后傾注加入培養(yǎng)基，待凝結(jié)后，按照預(yù)設(shè)定的條件進(jìn)行培養(yǎng)，計(jì)算菌液組菌落數(shù)（C）。

2.2.3.4 回收試驗(yàn) 3 批乳疾清合劑的回收試驗(yàn)結(jié)果表明試驗(yàn)組菌落數(shù)減去供試品對(duì)照組菌落數(shù)的值與菌液組菌落數(shù)的比值均在0.5～2 范圍內(nèi)，符合有關(guān)規(guī)定，見(jiàn)表1。

表1 乳疾清合劑的需氧菌總數(shù)、霉菌及酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證的回收試驗(yàn)比值

2.2.4 控制菌檢查由于乳疾清合劑的處方中含有雞內(nèi)金、全蝎等動(dòng)物組織，按照《中華人民共和國(guó)藥典》2015 年版相關(guān)規(guī)定，控制菌檢查需要檢查大腸埃希菌和沙門(mén)菌。

2.2.4.1 大腸埃希菌檢查 1）供試液組：取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液10 mL，加入pH 為7.0 的無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋至100 mL，搖勻后取10 mL 稀釋液加入到100 mL 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，30～35℃培養(yǎng)18～24 h。2）試驗(yàn)組：取“2.2.4.1”項(xiàng)下稀釋液10 cm加入到100 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基后，再取小于100 CFU的大腸埃希菌菌液加入到培養(yǎng)基中，30～35℃培養(yǎng)18～24 h。3）菌液組：取小于100 CFU的大腸埃希菌菌液加入到胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，30～35℃培養(yǎng)18～24 h。4）取上述3 個(gè)試驗(yàn)組的培養(yǎng)物1 mL 接種于100 mL 的麥康凱液體培養(yǎng)基中，42～44℃培養(yǎng)24～48 h。再將所得培養(yǎng)物劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基中，30～35℃中培養(yǎng)18～72 h，判斷是否有大腸埃希菌生長(zhǎng)。見(jiàn)表2。

2.2.4.2 沙門(mén)菌檢查 1）供試液組：取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液10 mL，加入胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基稀釋至200 mL，搖勻后，30～35℃培養(yǎng)18～24 h。2）試驗(yàn)組：取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液10 mL，加入胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基稀釋至200 mL，搖勻后，再取小于100 CFU的沙門(mén)菌菌液加入到培養(yǎng)基中，搖勻，30～35℃培養(yǎng)18～24 h。3）菌液組：取小于100 CFU 的大腸埃希菌菌液加入到200 mL 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，30～35℃培養(yǎng)18～24 h。4）取上述3 組的培養(yǎng)物0.1 mL 接種于10 mL 的RV 沙門(mén)菌增菌液體培養(yǎng)基中，30～35℃培養(yǎng)18～24 h。再將所得培養(yǎng)物劃線接種于木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基中，30～35℃中培養(yǎng)18～48 h，判斷是否有沙門(mén)菌生長(zhǎng)。見(jiàn)表2。

表2 乳疾清合劑的控制菌檢查方法驗(yàn)證結(jié)果

3 討論

3.1 薄層鑒別乳疾清合劑的制作工藝較為簡(jiǎn)單，直接經(jīng)過(guò)飲用水提取、濃縮、加入輔料后即得，因而使得乳疾清合劑含有多種化學(xué)成分。在本研究中建立的薄層色譜法［3］鑒別乳疾清合劑中的延胡索、青皮兩種成分的方法，分別參考了《中華人民共和國(guó)藥典》2015 年版中延胡索藥材和青皮藥材的薄層鑒別方法［4］。關(guān)于玄參的薄層鑒別方法，筆者曾試用過(guò)不同的展開(kāi)劑：1）以三氯甲烷-甲醇-水（12∶4∶1）的下層溶液作為展開(kāi)劑；2）以三氯甲烷-甲醇（6∶1）為展開(kāi)劑。結(jié)果發(fā)現(xiàn)樣品與對(duì)照藥材在相同位置上均顯相同顏色的斑點(diǎn)，且陰性均無(wú)干擾，但考慮到方法1）的Rf 較為適中，而且展開(kāi)劑配制步驟略為簡(jiǎn)便，因此選擇了三氯甲烷-甲醇（6∶1）為展開(kāi)劑。

玄參主要含有環(huán)烯醚萜苷類化合物［5］，而該類化合物偏于親水性，易溶于水和甲醇，可溶于正丁醇，而且易被酸水解。而青皮的主要化學(xué)成分為橙皮苷，屬二氫黃酮苷類化合物，微溶于甲醇，但可溶于乙醇和正丁醇［6］，因此本研究建立的薄層鑒別法鑒定乳疾清合劑中的玄參、青皮兩種成分的方法，采用相同的供試品溶液制備方法，簡(jiǎn)化了在實(shí)際檢驗(yàn)操作中的步驟。

3.2 微生物限度檢查在微生物限度檢查方法學(xué)驗(yàn)證的過(guò)程中，為確認(rèn)供試品中的微生物能被充分檢出，首先應(yīng)選擇最低稀釋級(jí)的供試液進(jìn)行計(jì)數(shù)方法實(shí)用性檢查［7］。而經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，乳疾清合劑的需氧菌總數(shù)、霉菌及酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)方法和沙門(mén)菌檢查方法中，可直接取乳疾清合劑原液進(jìn)行檢查。而大腸埃希菌的限量檢查，則需要使用稀釋10倍的乳疾清合劑進(jìn)行檢查。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，3 批乳疾清合劑的需氧菌總數(shù)、霉菌及酵母菌總數(shù)的計(jì)數(shù)方法可行，其回收試驗(yàn)結(jié)果顯示試驗(yàn)組菌落數(shù)減去供試品對(duì)照組菌落數(shù)的值與菌液組菌落數(shù)比值在0.5～2 范圍內(nèi)，且控制菌檢查方法可行，均未檢出大腸埃希菌和沙門(mén)菌，符合《中華人民共和國(guó)藥典》2015 年版中關(guān)于非無(wú)菌產(chǎn)品的微生物限度規(guī)定。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)建立的乳疾清合劑中延胡索、玄參和青皮的薄層鑒別方法和微生物限度檢查方法，專屬性強(qiáng)，可作為該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的項(xiàng)目之一。