歸脾丸對(duì)小鼠抑郁行為及單胺遞質(zhì)的影響*

韋宇婷，鐘 靜，鐘振國(guó)，梁明坤

1 廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530001；2 廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院

歸脾湯是治療心脾兩虛的經(jīng)典名方，出自宋代嚴(yán)用和《濟(jì)生方》，由黨參、白術(shù)、當(dāng)歸、茯苓、黃芪、遠(yuǎn)志、龍眼肉、酸棗仁、木香、炙甘草、生姜、大棗等12 味中藥組成，具有益氣補(bǔ)血，健脾安神功效，可用于神經(jīng)衰弱、失眠、頭暈等癥，對(duì)抑郁癥社會(huì)認(rèn)知、社會(huì)交往、抑郁焦慮及失眠等有改善作用［1-2］。歸脾丸（濃縮丸）是歸脾湯的成方劑型之一，其具體抗抑郁作用和機(jī)制尚不明確。本研究旨在觀察歸脾丸對(duì)抑郁模型小鼠血漿5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)、去 甲 腎 上 腺 素(norepinephrine，NE)、多巴胺（dopamine,DA)含量及行為學(xué)、體溫、眼瞼下垂的影響，探討歸脾丸的抗抑郁作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物雄性SPF 級(jí)ICR 小鼠，7～8周齡，體質(zhì)量20～22g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（湘）2016-0002。飼養(yǎng)溫度（24±1）℃，12 h 人工循環(huán)光照（光照期8∶00～20∶00），自由攝食飲水。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周。每只動(dòng)物僅用于一個(gè)單一的實(shí)驗(yàn)并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用3R原則給予人道主義關(guān)懷。

1.2 儀器ANY-maze型動(dòng)物行為分析系統(tǒng)（美國(guó)Stoelting 公司）；M200PRO 型連續(xù)波長(zhǎng)檢測(cè)儀（INFINITE）；KD3311型醫(yī)用電子體溫計(jì)（北京康祝醫(yī)療器械有限公司）；自制全透明強(qiáng)迫游泳圓筒及懸尾實(shí)驗(yàn)、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)箱。

1.3 藥品與試劑歸脾丸（仲景宛西制藥股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z41021897）；鹽酸氯米帕明（江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H32022974）；利血平注射液（天津金耀藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H12020905）；小鼠5-HT 酶聯(lián)免疫分析試劑盒（上海將來實(shí)業(yè)股份有限公司，貨號(hào)：JL12087）；小鼠NE 酶聯(lián)免疫試劑盒（武漢華美生物工程有限公司，批號(hào)：C0129030154）；小鼠DA 酶聯(lián)免疫試劑盒（武漢華美生物工程有限公司，批號(hào)：C0129050156）。

1.4 方法

1.4.1 利血平拮抗實(shí)驗(yàn)［3］將小鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、陽性藥組（鹽酸氯米帕明40 mg/kg）及 歸 脾 丸 高（2.73g/kg）、中（1.65g/kg）、低（0.6825 g/kg）劑量組，每組10 只，均按20 mL/kg灌胃給藥。每日1次，連續(xù)給藥7天，空白組、模型組給予等量0.9%NaCl 溶液。末次給藥前測(cè)小鼠基礎(chǔ)肛溫，將電子體溫計(jì)探頭經(jīng)甘油潤(rùn)滑后插入小鼠肛內(nèi)約1.5 cm處測(cè)量，除空白組外，其余各組按2 mg/kg腹腔注射利血平，同時(shí)灌胃藥物或生理鹽水，空白組腹腔注射等量0.9%NaCl 溶液［4］。注射利血平4 h 后，用溫度計(jì)測(cè)量小鼠肛溫；觀察各組小鼠眼瞼閉合狀況：完全開眼0 分，1/4 閉眼1分，1/2閉眼2分，3/4閉眼3分，完全閉眼4分。

1.4.2 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)（forced swimming test，F(xiàn)ST）［5］小鼠具體分組及給藥方式、劑量、時(shí)間同“1.4.1”項(xiàng)，于末次給藥1 h 后，將小鼠放于直徑25 cm，高40 cm 的透明圓柱形玻璃缸中，缸內(nèi)水深15 cm，水溫（24±1）℃。小鼠在水中停止掙扎，僅有微小肢體運(yùn)動(dòng)以保持頭部浮在水面，即表現(xiàn)出絕望狀態(tài)，則視為小鼠FST 不動(dòng)時(shí)間。從小鼠入水后共計(jì)時(shí)6 min，其中適應(yīng)2 min，記錄后4 min內(nèi)累計(jì)不動(dòng)時(shí)間（s）。

1.4.3 懸 尾 實(shí) 驗(yàn)（tail suspension test，TST）［6］小鼠具體分組及給藥方式、劑量、時(shí)間同“1.4.1”項(xiàng)，于末次給藥1 h后，用膠布將小鼠尾部1 cm處粘掛于懸尾箱內(nèi)，使其呈倒懸狀態(tài)，小鼠頭部距離地面30 cm，小鼠為了克服倒懸異常體位而掙扎，但掙扎一段時(shí)間后出現(xiàn)間斷性不動(dòng)，即表現(xiàn)出失望狀態(tài)，小鼠停止掙扎或無任何活動(dòng)的時(shí)間視為小鼠TST不動(dòng)時(shí)間。用攝像設(shè)備記錄，小鼠放入懸尾箱內(nèi)共6 min，其中適應(yīng)2 min，記錄后4 min累計(jì)不動(dòng)時(shí)間（s）。

1.4.4 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)（open field test，OFT）［7］小鼠具體分組及給藥方式、劑量、時(shí)間同“1.4.1”項(xiàng)，于末次給藥1 h 后，將小鼠放入敞箱，敞箱裝置為長(zhǎng)寬各60 cm，高25 cm，底面劃一個(gè)30 cm×30 cm 等邊方格木箱，使其與外框組成“回”字形方格，內(nèi)面用黑漆涂滿。將小鼠從邊緣放入裝置內(nèi)，用攝像設(shè)備觀察小鼠共7 min，其中適應(yīng)2 min，記錄后5 min內(nèi)總運(yùn)動(dòng)距離及穿越至中心方格次數(shù)（四爪均進(jìn)入方格方可計(jì)數(shù)），用75%酒精、1%次氯酸鈉徹底清潔敞箱后再觀察下一只小鼠。

1.4.5 單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量測(cè)定最末次行為實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，立即麻醉，心臟采血0.5～1.0 mL，放入有EDTA抗凝劑的離心管內(nèi)，室溫下靜置30 min，4℃離心半徑10 cm，3000 r/min 離心15 min 后，取上清液，-80℃保存待測(cè)實(shí)驗(yàn)小鼠血漿單胺遞質(zhì)含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 19.0 軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠體溫和眼瞼下垂情況與空白組比較，模型組小鼠體溫急劇下降，小鼠完全閉眼，提示利血平誘發(fā)小鼠體溫下降及眼瞼下垂成功。與模型組比較，歸脾丸高、中、低劑量組可對(duì)抗小鼠腹腔注射利血平所引起的體溫下降（P＜0.001）及眼瞼下垂（P＜0.05，P＜0.01），說明歸脾丸具有抗利血平作用。見表1。

表1 各組小鼠體溫及眼瞼下垂情況比較（±s）

表1 各組小鼠體溫及眼瞼下垂情況比較（±s）

注：與空白組比較，#表示P＜0.05，##表示P＜0.01，###表示P＜0.001；與模型組比較，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001（下同）

組別空白組模型組陽性藥組歸脾丸高劑量組歸脾丸中劑量組歸脾丸低劑量組鼠數(shù)10 10 10 10 10 10劑量（g/kg）- -40 2.73 1.65 0.6825體溫（℃）37.8±0.6 32.1±0.6###35.5±0.6***36.8±0.5***36.1±0.8***35.6±0.7***眼瞼下垂評(píng)分（分）0 3.5±0.8###1.7±1.0**2.0±0.6**2.2±0.4*2.3±0.5*

2.2 小鼠FST 情況與空白組比較，模型組強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），提示抑郁造模成功。與模型組比較，陽性藥組和歸脾丸高劑量組均可縮短小鼠強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05 或P＜0.01）。提示歸脾丸高劑量具有拮抗小鼠獲得性絕望行為的作用。見表2。

表2 各組小鼠強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間比較（±s）

表2 各組小鼠強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間比較（±s）

組別空白組模型組陽性藥組歸脾丸高劑量組歸脾丸中劑量組歸脾丸低劑量組鼠數(shù)10 10 10 10 10 10劑量（g/kg）- -40 2.73 1.65 0.6825不動(dòng)時(shí)間（s）14.9±11.0 107.9±41.6##50.5±38.4*33.0±5.9**81.5±36.0 79.3±64.9

2.3 小鼠TST 情況與空白組比較，模型組懸尾不動(dòng)時(shí)間增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），提示抑郁造模成功。與模型組比較，陽性藥鹽酸氯米帕明可縮短小鼠懸尾不動(dòng)時(shí)間，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。歸脾丸各劑量組與模型組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表3。

表3 各組小鼠懸尾不動(dòng)時(shí)間比較（±s）

表3 各組小鼠懸尾不動(dòng)時(shí)間比較（±s）

組別空白組模型組陽性藥組歸脾丸高劑量組歸脾丸中劑量組歸脾丸低劑量組鼠數(shù)10 10 10 10 10 10劑量（g/kg）- -40 2.73 1.65 0.6825不動(dòng)時(shí)間（s）59.3±10.0 139.5±49.6##52.7±36.7**114.9±27.9 98.8±44.1 110.3±35.6

2.4 小鼠OFT 情況與模型組比較，陽性藥鹽酸氯米帕明組5 min內(nèi)總運(yùn)動(dòng)距離增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。歸脾丸高劑量組5 min 內(nèi)總運(yùn)動(dòng)距離增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。模型組小鼠5 min 內(nèi)進(jìn)入中心方格次數(shù)為（1.5±2.3）次，與各給藥組相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表4。

表4 各組小鼠總運(yùn)動(dòng)距離及進(jìn)入中心方格次數(shù)比較（±s）

表4 各組小鼠總運(yùn)動(dòng)距離及進(jìn)入中心方格次數(shù)比較（±s）

組別空白組模型組陽性藥組歸脾丸高劑量組歸脾丸中劑量組歸脾丸低劑量組鼠數(shù)10 10 10 10 10 10劑量（g/kg）- -40 2.73 1.65 0.6825總運(yùn)動(dòng)距離（m）19.2±5.3 2.8±3.3###19.5±6.9***25.8±20.9*19.3±24.0 13.0±14.3進(jìn)入中心方格次數(shù)（次）15.3±5.8 1.5±2.3###2.8±2.9 4.2±3.0 2.6±3.7 2.3±2.7

2.5 小鼠血漿單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量與空白組比較，模型組小鼠血漿5-HT、NE、DA 含量下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.05），造模成功。與模型組比較，陽性藥鹽酸氯米帕明和歸脾丸高、中、低劑量均能提高小鼠血漿NE、DA 含量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；高劑量組能提高5-HT 含量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表5。

表5 各組小鼠血漿單胺遞質(zhì)含量比較（±s）

表5 各組小鼠血漿單胺遞質(zhì)含量比較（±s）

組別空白組模型組陽性藥組歸脾丸高劑量組歸脾丸中劑量組歸脾丸低劑量組鼠數(shù)10 10 10 10 10 10劑量（g/kg）- -40 2.73 1.65 0.6825 5-HT（ng/mL）549.3±67.4 227.9±41.6##401.5±59.7**438.1±64.9**288.6±90.0 246.4±58.8 NE（pg/mL）30.67±6.1 12.67±5.5#39.26±7.1***38.87±8.1***20.88±19.8*29.28±15.8**DA（pg/mL）94.97±63.2 31.51±13.4#51.41±24.9*87.61±38.2***62.36±28.1*44.66±13.1*

3 討論

抑郁癥是多方因素綜合引發(fā)的情感性病癥，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜。通過破壞機(jī)體與情緒有關(guān)的神經(jīng)環(huán)路影響5-HT、NE 和DA 神經(jīng)元及其通路，導(dǎo)致單胺遞質(zhì)水平降低，可使機(jī)體功能紊亂而引起抑郁［8］。中醫(yī)學(xué)對(duì)抑郁癥的認(rèn)識(shí)較早，對(duì)本病的描述內(nèi)容散見于郁證、百合病等疾病中。中醫(yī)認(rèn)為引發(fā)抑郁癥的原因主要是肝氣郁結(jié)、心脾兩虛、氣血肝腎不足等。中醫(yī)“郁證”以心情抑郁，痛無定處，納呆少寐，或急躁易怒，或多疑易驚為主要臨床表現(xiàn)［9］。齊元玲等［10］對(duì)抑郁癥中醫(yī)證候?qū)W臨床流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)心脾兩虛證在6 種常見中醫(yī)證候中排第二位，占15.0%。徐春燕等［11］研究發(fā)現(xiàn)心脾兩虛是抑郁癥常見中醫(yī)證候之一，占10.7%。孫志高等［12］調(diào)查了906 例抑郁癥患者，發(fā)現(xiàn)心脾兩虛占14.2%。歸脾湯具有益氣補(bǔ)血、健脾養(yǎng)心功效，主治心脾兩虛證，被廣泛應(yīng)用于健忘失眠、體倦食少、盜汗、便血等疾病。以往研究證明，歸脾湯具有改善模型動(dòng)物認(rèn)知、記憶力及增強(qiáng)神經(jīng)細(xì)胞增殖的作用［13］，同時(shí)，歸脾湯的安全性已經(jīng)過臨床實(shí)踐驗(yàn)證，大、小鼠體內(nèi)的急性毒性和遺傳毒性實(shí)驗(yàn)研究也證明歸脾湯的安全性，無遺傳毒性影響［14］。目前，臨床尚未研制出一種治療抑郁癥的理想藥物。歸脾湯等傳統(tǒng)復(fù)方中藥用于治療本病療效較好［15］。研究表明，歸脾湯能提高抑郁模型動(dòng)物腦內(nèi)BDNF、5-HT、NE、DA 等神經(jīng)遞質(zhì)水平［9，13］，但歸脾丸抗抑郁機(jī)制是否與歸脾湯一致未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。單胺遞質(zhì)不足是抑郁癥發(fā)病的重要因素之一。單胺遞質(zhì)不足易引發(fā)腦內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞病變，破壞腦內(nèi)神經(jīng)元及其傳導(dǎo)通路，使中樞神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)情感活動(dòng)有調(diào)控作用的遞質(zhì)降低［16］。本研究結(jié)果顯示：抑郁小鼠血漿中5-HT、NE、DA 水平較空白組降低，提示抑郁癥的發(fā)病機(jī)制可能與單胺遞質(zhì)神經(jīng)元及其通路被破壞有關(guān)。歸脾丸干預(yù)后抑郁小鼠血漿5-HT、NE、DA 水平較模型組升高，提示血漿中5-HT、NE、DA 的改變可能參與了抑郁行為的改善，推測(cè)歸脾丸可能促進(jìn)了單胺遞質(zhì)合成，從而發(fā)揮抗抑郁作用。

利血平誘發(fā)的抑郁癥動(dòng)物模型被廣泛應(yīng)用于抗抑郁藥物的篩選和評(píng)價(jià)［17］。利血平是一種囊泡再攝取抑制劑，易被單胺氧化酶（monoamine oxidase，MAO）降解，使單胺遞質(zhì)（5-HT、NE、DA）耗竭，妨礙交感神經(jīng)沖動(dòng)傳遞，從而引起行為和生理的變化。給予利血平后小鼠即出現(xiàn)體溫下降、眼瞼下垂等癥狀［18］。本實(shí)驗(yàn)以體溫下降和眼瞼下垂為考察指標(biāo)，結(jié)果顯示歸脾丸高、中、低劑量均具有改善抑郁小鼠體溫下降的作用，同時(shí)對(duì)利血平引起的眼瞼下垂有一定改善作用。

小鼠FST、TST和OFT均為行為絕望實(shí)驗(yàn)，該狀態(tài)與人類抑郁癥發(fā)病時(shí)的生理病癥相似，故而此3 種模型可作為研究抑郁癥的主要模型［4］。歸脾丸具有改善利血平誘導(dǎo)的抑郁癥模型小鼠體溫下降和眼瞼下垂的作用，且能縮短小鼠強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間，增加曠場(chǎng)總運(yùn)動(dòng)距離，提示歸脾丸具有較好的抗抑郁作用。歸脾丸中、低劑量對(duì)小鼠強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間無影響，而高劑量組表現(xiàn)出明顯差異。提示歸脾丸抗抑郁作用存在量效關(guān)系，歸脾丸劑量越大，抗抑郁效果越好，但不同個(gè)體之間也存在差異。歸脾丸高、中、低劑量對(duì)小鼠懸尾不動(dòng)時(shí)間均無影響。歸脾丸高劑量組能增加小鼠OFT總運(yùn)動(dòng)距離，但對(duì)小鼠進(jìn)入中心方格次數(shù)無影響，可能由于利血平化較嚴(yán)重及中心方格距離太遠(yuǎn)。提示歸脾丸高劑量有良好的改善抑郁癥癥狀的效果。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明歸脾丸對(duì)抑郁癥有較好的改善作用，表現(xiàn)出與歸脾湯［12］相似的抗抑郁作用，其中高劑量抗抑郁效果較好，提示歸脾丸具有劑量方向性特點(diǎn)，但最佳劑量確定還需進(jìn)一步研究。其中，歸脾丸對(duì)利血平所致抑郁小鼠體溫下降及眼瞼下垂具有拮抗作用，能提高抑郁小鼠血漿5-HT、NE、DA 含量，表明其作用機(jī)制可能與增加血漿單胺遞質(zhì)含量有關(guān)。