酶聯(lián)免疫分析法檢測(cè)乙型肝炎表面抗原常見(jiàn)影響因素分析

李達(dá)

（汝陽(yáng)縣中醫(yī)院 檢驗(yàn)科，河南 洛陽(yáng) 471200）

乙型肝炎是臨床常見(jiàn)疾病。我國(guó)慢性乙型肝炎患者高達(dá)2 億，其中1%患者會(huì)發(fā)展成為重度乙型肝炎［1］。目前關(guān)于乙型肝炎發(fā)生機(jī)制尚未完全明確，與乙型肝炎病毒（HBV）、肝細(xì)胞免疫損傷有關(guān)，及早診斷乙型肝炎有利于預(yù)后［2］。乙型肝炎主要作用的靶器官是肝臟，通過(guò)引起肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，造成肝炎、肝硬化和肝功能衰竭等疾病［3］。乙型肝炎患者及乙肝病毒攜帶者是主要污染源，傳播途徑為血液、血制品、體液傳播和母嬰傳播等。乙型肝炎病毒包含乙型肝炎表面抗原（HBsAg）［4］，是機(jī)體感染乙肝病毒最早出現(xiàn)在血清中的物質(zhì)，也是診斷是否感染乙肝病毒的重要標(biāo)志物。酶聯(lián)免疫吸附法是臨床常用的病毒檢查方法，但往往會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性，不利于臨床診治。本研究對(duì)酶聯(lián)免疫分析法檢測(cè)乙肝表面抗原常見(jiàn)影響因素進(jìn)行探討，旨在為臨床提高診斷質(zhì)量提供可靠數(shù)據(jù)支持。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性選擇汝陽(yáng)縣中醫(yī)院醫(yī)院2019 年10 月至2021 年5 月接收的慢性乙型肝炎患者44 例血清樣本作為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合全國(guó)中西醫(yī)結(jié)合肝病學(xué)術(shù)會(huì)議制定乙型肝炎診斷標(biāo)準(zhǔn)；②患者知情同意；③既往病史明確。排除標(biāo)準(zhǔn)：①血樣污染的患者；②合并其他肝疾病患者；③合并嚴(yán)重性基礎(chǔ)疾病患者；④妊娠期、哺乳期患者。收集44 例患者血樣，獲得44 份HBsAg 陽(yáng)性血清樣本。試劑盒是安圖試劑盒檢測(cè)OD 值。檢測(cè)儀器是URUANS 酶聯(lián)免疫吸附檢查儀。44 例患者中男21 例，女12 例；年齡18～74 歲，平均（52.57±3.74）歲；病程1～8 年，平均（5.17±0.39）年。

1.2 方法

抽取患者肘靜脈血5 mL，離心處理后留下血清，將44 份血清平均分成四等份，計(jì)為A、B、C、D。

A 等份：44 份HBsAg 陽(yáng)性血清樣本按照陰性、陽(yáng)性和空白對(duì)照組各設(shè)置2 個(gè)孔。加顯色劑后，使用空白孔調(diào)零，為了更好的了解不同時(shí)間底物的顯色情況，不加終止劑，但要在酶標(biāo)儀上每5 min 檢測(cè)1 次410 nm OD 值。

B 等份：在44 份HBsAg 陽(yáng)性血清樣本上做上下兩排雙孔，進(jìn)行常規(guī)檢測(cè)，空白對(duì)照處理同A份。加顯色劑，將其再分成兩等份。一份放在37℃水浴箱孵育15 min。另一份放在12℃室溫內(nèi)，孵育15 min，加上終止劑，在酶標(biāo)儀上測(cè)定450 nm OD 值。

C 等份：將44 份HBsAg 陽(yáng)性血清樣本上做上下兩排的雙孔，進(jìn)行常規(guī)檢測(cè)，空白對(duì)照處理同A、B 份。加顯色劑，將其再分成兩等份，一份用試劑盒洗液洗板5 次，另一份使用自來(lái)水洗板5 次，并在37℃水育15 min，終止檢測(cè)OD 值。

D 等份：將44 份HBsAg 陽(yáng)性血清樣本做三排孔檢測(cè)，使用酶標(biāo)記抗體40 μL、50 μL、60 μL，其余按照酶標(biāo)操作說(shuō)明書(shū)測(cè)定OD 值。

陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)：參考臨界值進(jìn)行評(píng)定。臨界值=陰性對(duì)照孔OD 均值乘以2.1。臨界值＜0.05 時(shí)計(jì)算結(jié)果，且結(jié)果需乘以0.05。陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)：臨界值≥1，陰性＜1。

1.3 評(píng)價(jià)指標(biāo)

比較不同時(shí)間HBsAg 陽(yáng)性血清樣本滴度平均OD 值、不同溫度HBsAg 陽(yáng)性血清樣本滴度的OD值、不同洗扳OD 值和三種不同酶標(biāo)記抗體加入量OD 值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本文數(shù)據(jù)均使用SPSS 19.00 軟件處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩兩比較用t檢驗(yàn)，三組及以上比較用方差分析；計(jì)數(shù)資料以百分率（%）表示，用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同時(shí)間HBsAg 陽(yáng)性血清樣本滴度平均OD值比較

不同時(shí)間點(diǎn)5 min、10 min、15 min、20 min、25 min、30 min、35 min、40 min 平均OD 值比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=260.01,P＜0.001）。其中40 min 平均OD 值（0.71±0.02）最高，5 min 平均OD 值（0.41±0.02）最低。見(jiàn)表1。

表1 不同時(shí)間HBsAg 陽(yáng)性血清樣本滴度平均OD 值比較（n=44,）

表1 不同時(shí)間HBsAg 陽(yáng)性血清樣本滴度平均OD 值比較（n=44,）

2.2 兩種不同溫度HBsAg 陽(yáng)性血清樣本滴度OD值比較

37℃時(shí)HBsAg 陽(yáng)性血清樣本滴度OD 值為（0.99±0.32），高于12℃時(shí)HBsAg 陽(yáng)性血清樣本滴度OD 值（0.81±0.36），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.94,P＜0.001）。

2.3 不同洗扳HBsAg 陽(yáng)性血清樣本OD 值比較

自來(lái)水HBsAg 陽(yáng)性血清樣本OD 值為（0.62±0.16），高于試劑盒洗液HBsAg 陽(yáng)性血清樣本OD 值（0.51±0.14），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=8.09,P＜0.001）。

2.4 三種不同的酶標(biāo)記抗體加入量OD 值比較

酶標(biāo)記抗體加入量分別為40 μL、50 μL、60 μL 時(shí)的OD 值比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=8.87,P＜0.001）。其中50 μL 酶標(biāo)記抗體加入量OD 值（0.77±0.19）最高，40 μL 酶標(biāo)記抗體加入量OD值（0.72±0.12）最低，見(jiàn)表2。

表2 三種不同的酶標(biāo)記抗體加入量OD 值比較（n=44,）

表2 三種不同的酶標(biāo)記抗體加入量OD 值比較（n=44,）

3 討論

乙型肝炎是臨床一種常見(jiàn)和多發(fā)的疾病，病情較隱秘，在我國(guó)常見(jiàn)。最近幾年，乙型肝炎發(fā)生率呈上升趨勢(shì)。乙型肝炎臨床表現(xiàn)有惡心、乏力和腹脹等癥狀?；颊卟∏橥砥冢卫w維化明顯，嚴(yán)重影響患者生命健康。酶聯(lián)免疫吸附法最早見(jiàn)于1971 年，是一種非均相高通量免疫分析技術(shù)，其原理是通過(guò)固相載體表面進(jìn)行免疫學(xué)反應(yīng)，使用酶作為免疫標(biāo)記，建立起與檢測(cè)物之間的反應(yīng)署聯(lián)合關(guān)系［5］。酶聯(lián)免疫吸附法常見(jiàn)方法有雙抗體較夾心法測(cè)抗體、雙抗原夾心法測(cè)抗體、間接法測(cè)抗體、競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗體和捕獲包被法測(cè)抗體等。其中雙抗體夾心法測(cè)抗原主要用于二價(jià)或二價(jià)以上的大分子抗原。雙抗原夾心法測(cè)抗體主要適用于小分子激素、藥物或毒素［6］。捕獲包被法主要適用于病毒性感染的早期診斷。與其他檢測(cè)方法相比，酶聯(lián)免疫吸附法有成本低、穩(wěn)定性好、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，對(duì)HBsAg 的檢測(cè)對(duì)診斷、治療和預(yù)防等有重要意義［7］。但酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)HbsAg 結(jié)果容易受到溶血、酶標(biāo)記抗體加入量和溫度等影響，其OD 值存在差異［8］。

本研究發(fā)現(xiàn)，在酶聯(lián)免疫吸附法中加樣、孵育和洗板等整個(gè)過(guò)程中的各個(gè)細(xì)胞中出現(xiàn)問(wèn)題會(huì)導(dǎo)致乙型肝炎病毒表面抗體假陽(yáng)性的情況。尤其是在此過(guò)程中要注意患者的OD 值較大時(shí)要進(jìn)行復(fù)查。研究結(jié)果顯示，不同時(shí)間點(diǎn)5 min、10 min、15 min、20 min、25 min、30 min、35 min、40 min平均OD 值存在明顯不同。其中40 min 平均OD值最高，5 min 平均OD 值最低。37℃下HBsAg 陽(yáng)性血清樣本滴度OD 值高于12℃。不同洗板中，自來(lái)水HBsAg 陽(yáng)性血清樣本OD 值最高。40 μL、50 μL、60 μL 酶標(biāo)記抗體加入量OD 值中50 μL 酶標(biāo)記抗體加入量OD 值最高，40 μL 酶標(biāo)記抗體加入量OD 值最低。說(shuō)明檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)、反應(yīng)溫度、洗板和酶標(biāo)記抗體加入量均影響HbsAg 的OD 值。隨著時(shí)間延長(zhǎng)，OD 值顯色越深，因此要準(zhǔn)確把握顯色時(shí)間。過(guò)早或過(guò)晚檢測(cè)均會(huì)導(dǎo)致靈敏度的樣本漏檢，其中過(guò)長(zhǎng)時(shí)間會(huì)導(dǎo)致浪費(fèi)。顯色溫度過(guò)低會(huì)導(dǎo)致結(jié)合反應(yīng)速度延緩，導(dǎo)致顯色不充分［9］，會(huì)導(dǎo)致低值陽(yáng)性樣本的漏檢。一般來(lái)說(shuō)，洗板并不是酶聯(lián)免疫吸附法的反應(yīng)步驟，但卻影響著試驗(yàn)結(jié)果。通過(guò)洗板分離和固相抗原、抗體結(jié)合的游離物質(zhì)，可以顯著減少血清樣品中與反應(yīng)無(wú)關(guān)的蛋白質(zhì)和其他雜質(zhì)從而提升特異性吸附［10］。洗板處理不徹底，會(huì)導(dǎo)致底本增高。酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定中PBS 洗滌液中洗滌效果較好，但自來(lái)水洗板會(huì)增加本底增高，使假陽(yáng)性增加［11］。

目前關(guān)于酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)導(dǎo)致HbsAg 假陽(yáng)性原因包括：①試劑盒因素。試劑盒是最直接影響酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)結(jié)果的因素，選擇合格、靈敏的試劑盒能提升檢查結(jié)果。②血液標(biāo)本。目前認(rèn)為溶血會(huì)導(dǎo)致酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)假陽(yáng)性，溶血后，血清中含有血紅蛋白，血紅蛋白會(huì)減弱過(guò)氧化酶活性，一步法難以完全脫洗，殘留的過(guò)氧化酶能與包被抗體結(jié)合，從而增加假陽(yáng)性風(fēng)險(xiǎn)［12］。③標(biāo)本離心。部分血樣離心不全，血液未能完全凝固導(dǎo)致血清沒(méi)有分離完全時(shí)進(jìn)行檢查會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)反應(yīng)孔出現(xiàn)凝血現(xiàn)象或殘留細(xì)胞成分干擾，其中免疫復(fù)合物吸附在塑料表面，導(dǎo)致非特異性結(jié)果，從而影響檢測(cè)結(jié)果，檢測(cè)過(guò)程中盡可能選擇血清，靜止2 h 后再實(shí)行檢測(cè)，同時(shí)加樣后要及時(shí)孵育。④加樣時(shí)間和洗板影響。前后血樣標(biāo)本加樣時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，特別是夏天溫度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致HbsAg結(jié)果影響較大，溫度和時(shí)間對(duì)顯色非常重要，溫度37℃的時(shí)間與顯色的顏色深淺呈正比。加樣過(guò)程中要保持顯色劑不會(huì)出現(xiàn)外流現(xiàn)象。⑤操作不當(dāng)。在檢測(cè)過(guò)程中操作不當(dāng)會(huì)影響HbsAg 結(jié)果，加樣不準(zhǔn)確或錯(cuò)誤使用標(biāo)本會(huì)影響檢測(cè)質(zhì)量。加樣時(shí)必須使用一次性吸頭，最好使用洗板機(jī)代替人工操作，堅(jiān)持室內(nèi)質(zhì)控和陰、陽(yáng)性空白對(duì)照組同時(shí)進(jìn)行。

綜上所述，酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)HbsAg 結(jié)果多受溫度、孵育時(shí)間和洗板和酶標(biāo)記抗體加入量等影響，應(yīng)準(zhǔn)確處理。