高分子材料在髓核組織工程中的應(yīng)用與研究

祝昊，尚暉，張洋，陳瑞，沈天宇，向治成

（湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院 脊柱外科，湖北 十堰 442000）

椎間盤(pán)退行性病變（intervertebral disc degeneration,IDD）是導(dǎo)致下腰痛的常見(jiàn)原因，全球有80% 以上的人都受到了相關(guān)問(wèn)題的困擾［1］，同時(shí)也成為全球致殘和巨大醫(yī)療開(kāi)支的重要原因［2］。腰椎間盤(pán)由髓核（nucleus pulposus,NP）、纖 維 環(huán)（annulus fibrosus,AF）以 及 終 板（endplate）三部分組成，隨著年齡的增加，椎間盤(pán)的組成成分和微觀結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生一定的變化，如髓核因結(jié)合水的能力降低而收縮變小，進(jìn)而導(dǎo)致椎間盤(pán)在承受負(fù)荷時(shí)纖維環(huán)出現(xiàn)受損或分層，加速椎間盤(pán)及其周?chē)M織的退行性變化，造成嚴(yán)重的后果。目前針對(duì)這種疾病的治療手段主要有兩種，第一種是通過(guò)藥物或其它物理療法進(jìn)行保守治療，第二種是通過(guò)手術(shù)的方式進(jìn)行椎間盤(pán)的切除，達(dá)到解除壓迫，緩解癥狀的目的。盡管手術(shù)方式多樣［3］，但手術(shù)會(huì)造成自身及相鄰組織的進(jìn)一步退變，遠(yuǎn)期預(yù)后不佳［4］。因此，解決退變組織內(nèi)的炎癥問(wèn)題［5］，減少功能細(xì)胞的損失，恢復(fù)細(xì)胞外基質(zhì)含量，才能實(shí)現(xiàn)有效的治愈。細(xì)胞椎間盤(pán)退變的逆轉(zhuǎn)對(duì)脊柱健康有潛在的巨大影響［6］。在這樣的背景下，通過(guò)組織工程的手段對(duì)已損傷的椎間盤(pán)進(jìn)行修復(fù)受到了更多的關(guān)注，相關(guān)領(lǐng)域的探索、創(chuàng)新也在不斷進(jìn)行。

高分子材料的應(yīng)用是組織工程的重要組成，以高分子材料為載體，模仿髓核的理化性質(zhì)，配合種子細(xì)胞、生長(zhǎng)因子的研究在近些年取得了較大的進(jìn)展。目前大多數(shù)研究中，高分子材料主要用于構(gòu)建支架，作為細(xì)胞移植的載體。集成3D 生物打印技術(shù)制備載細(xì)胞腰椎間盤(pán)支架也有一定的可行性［7］。本文從高分子材料在治療椎間盤(pán)退變的應(yīng)用上分析，結(jié)合近幾年的研究作一個(gè)綜述。

1 高分子材料作為支架材料的應(yīng)用

高分子材料作為移植細(xì)胞的載體，可以為植入的細(xì)胞提供適宜的生存環(huán)境，以保證移植細(xì)胞植入后的效果。另外，治療椎間盤(pán)退變的組織工程結(jié)構(gòu)必須適應(yīng)缺氧和炎癥退變的椎間盤(pán)微環(huán)境［8］。目前常用作載體的高分子材料主要分為天然材料與合成材料兩種，通常結(jié)合分子交聯(lián)等手段形成互穿聚合物網(wǎng)絡(luò)水凝膠［9］。

1.1 天然材料

用于構(gòu)建髓核支架的天然高分子材料主要有膠原、透明質(zhì)酸、殼聚糖、海藻酸鈉等。由它們參與構(gòu)成的水凝膠是組織再生的有效結(jié)構(gòu)［10］。天然材料與植入細(xì)胞之間可以產(chǎn)生良好的聯(lián)系［11］，使其擁有更加廣闊的應(yīng)用前途。

殼聚糖（chitosan,CH）化學(xué)名稱(chēng)為聚葡萄糖胺（1-4）-2-氨基-B-D 葡萄糖，擁有良好的生物官能性和相容性，在體內(nèi)也有較高的安全性，同時(shí)，被證明可以用于增加復(fù)合材料的強(qiáng)度［12］。KUANG等［13］利用脫細(xì)胞髓核基質(zhì)與殼聚糖組成的混合水凝膠培養(yǎng)髓核干細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)添加了生長(zhǎng)因子的混合水凝膠中Ⅰ型膠原蛋白、Ⅱ型膠原蛋白和蛋白聚糖的基因表達(dá)得到增強(qiáng)。ADOUNGOTCHODO等［14］在基于殼聚糖的水凝膠中添加了名為L(zhǎng)ink N的天然肽后，發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充有LN 的殼聚糖水凝膠可以幫助在椎間盤(pán)退化的早期階段恢復(fù)NP 的功能。YUAN 等［15］用殼聚糖水凝膠作為在體外構(gòu)造的組織工程椎間盤(pán)的髓核支架，發(fā)現(xiàn)其很好地滿(mǎn)足椎間盤(pán)的天然結(jié)構(gòu)以及力學(xué)的相關(guān)要求。ALINEJAD等［16］研究了幾種新型的溫敏性殼聚糖水凝膠，這些新型水凝膠是由CH 與三種膠凝劑（碳酸氫鈉和/或β-甘油磷酸和/或磷酸鹽緩沖液）的不同組合混合而成，通過(guò)測(cè)量植入的髓核細(xì)胞存活率、新陳代謝和蛋白多糖的合成來(lái)評(píng)估水凝膠的細(xì)胞相容性和功能，發(fā)現(xiàn)了能更好表現(xiàn)出與人NP 組織相似的力學(xué)性能，并能更好地刺激NP 細(xì)胞蛋白多糖的合成和保留的溫敏性殼聚糖水凝膠。SCHMITT等［17］選擇10 只椎間盤(pán)受損的綿羊，每只均有3個(gè)椎間盤(pán)受損，采用注射的方式給每只綿羊的2個(gè)椎間盤(pán)注入裝載脂肪來(lái)源干細(xì)胞（adiposederived stem cells,ASCs）的殼聚糖羧甲基纖維素水凝膠支架，12 個(gè)月后，與未治療的受損IVD 相比，治療后的椎間盤(pán)高度穩(wěn)定，退行性變進(jìn)展明顯減輕。

透明質(zhì)酸（hyaluronic acid,HA），又稱(chēng)糖醛酸、玻尿酸，是一種由雙糖（D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺）基本結(jié)構(gòu)組成的糖胺聚糖，是結(jié)締組織、上皮組織、神經(jīng)組織和天然細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分［18］，它的透明質(zhì)分子具有吸收500 倍體積以上水的能力。RAJAN 等［19］發(fā)現(xiàn)利用石墨烯、殼聚糖以及透明質(zhì)酸制得的復(fù)合材料支架，相對(duì)于普通透明質(zhì)酸水凝膠具有更有利于種子細(xì)胞存活及分化的膠孔隙率、密度、溶脹等特性。YAMAMOTO 等［20］發(fā)現(xiàn)了透明質(zhì)酸可以通過(guò)調(diào)節(jié)p38 和ERK1/2 通路抑制椎間盤(pán)退變，改善椎間盤(pán)的炎癥情況。KAZEZIAN 等［21］證明了透明質(zhì)酸作為一種抗炎分子，通過(guò)將椎間盤(pán)環(huán)境轉(zhuǎn)變?yōu)楦嗟暮铣纱x狀態(tài)，并通過(guò)促進(jìn)天然椎間盤(pán)(intervertebral disc,IVD)基質(zhì)的產(chǎn)生而起到了抗炎分子的作用。CHEN 等［22］開(kāi)發(fā)了一種光交聯(lián)明膠-甲基丙烯酸透明質(zhì)酸水凝膠用于培養(yǎng)脂肪基質(zhì)細(xì)胞髓核樣分化，發(fā)現(xiàn)這種培養(yǎng)條件下的脂肪基質(zhì)細(xì)胞向髓核細(xì)胞分化效果良好，大鼠髓核基質(zhì)明顯增多，椎間盤(pán)高度指數(shù)明顯升高。MOHD ISA等［23］在椎間盤(pán)損傷的大鼠模型中植入透明質(zhì)酸水凝膠，發(fā)現(xiàn)透明質(zhì)酸可以有效減輕炎癥和疼痛。KIM 等［24］利用多孔聚己內(nèi)酯及透明質(zhì)酸水凝膠組建復(fù)合的組織工程椎間盤(pán)，并將其植入大鼠尾棘5周，觀察到5 周后結(jié)構(gòu)仍然保持完整。

海藻酸鈉（sodium alginate,SA）是從褐藻類(lèi)的海帶或馬尾藻中提取碘和甘露醇之后的副產(chǎn)物，其在醫(yī)藥領(lǐng)域用作生物可降解無(wú)毒材料［25］，擁有可以在溫和輻射條件下加工的優(yōu)勢(shì)［26］。海藻酸鹽在與生理環(huán)境接觸時(shí)會(huì)凝膠化成更柔軟的結(jié)構(gòu)，從而限制了其在軟組織再生中的潛力，不適合與承重身體部位相關(guān)的使用［27］。海藻酸鈉易于陽(yáng)離子形成凝膠，同時(shí)也可以在結(jié)構(gòu)中加入多種有機(jī)材料增加其強(qiáng)度，海藻酸鈉中的醛端基可以主導(dǎo)其與明膠的交聯(lián)［28］。ERWIN 等［29］利用海藻酸鈉水凝膠在3D 培養(yǎng)基中培養(yǎng)犬的脊索細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)在缺氧的條件下，脊索細(xì)胞產(chǎn)生了與體內(nèi)觀察到的結(jié)構(gòu)高度相似的結(jié)構(gòu)。MIETSCH 等［30］比較了3D微球培養(yǎng)和海藻酸鹽微球，以及不同培養(yǎng)基組成，通過(guò)加入人富血小板血漿（platelet-rich plasma,PRP）或轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF-1）在靜水壓作用下對(duì)人間充質(zhì)干細(xì)胞與髓核細(xì)胞軟骨分化的影響，發(fā)現(xiàn)在適宜因子的體外誘導(dǎo)下，海藻酸鹽在支架的構(gòu)建中可以發(fā)揮出理想的生物學(xué)作用。WANG等［31］以藻酸鹽水凝膠為載體，比較不同種子細(xì)胞植入后的效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)相同條件下軟骨終板來(lái)源的干細(xì)胞的成骨效應(yīng)相較于纖維環(huán)或髓核來(lái)源的干細(xì)胞優(yōu)越。TSUJIMOTO 等［32］發(fā)現(xiàn)超純化海藻酸鹽（ultra-purified alginate,UPAL）凝膠與人類(lèi)IVD 細(xì)胞具有生物相容性，并在椎間盤(pán)切除術(shù)后促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生，顯示出足夠的生物力學(xué)特性而沒(méi)有材料突出。URA 等［33］在椎間盤(pán)切除術(shù)的動(dòng)物模型中，植入U(xiǎn)PAL 凝膠，證明UPAL 凝膠植入抑制TNF-α 和IL-6 的產(chǎn)生，下調(diào)TrkA 的表達(dá)，抑制IVD 變性，減少傷害性行為。SUN 等［34］采用全氟三丁胺（perfluorotributylamine,PFTBA）作為海藻酸鹽支架的氧氣調(diào)節(jié)劑，發(fā)現(xiàn)富含PFTBA 的海藻酸鹽可恢復(fù)椎間盤(pán)高度和細(xì)胞外基質(zhì)含量，促進(jìn)植入的髓核細(xì)胞的增殖。NAQVI 等［35］研究骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone mesenchymal stem cells,BMSCs）在常氧（20%）和低氧（5%）條件下三維培養(yǎng)時(shí)對(duì)不同pH 環(huán)境［血液（pH 7.4）、健康椎間盤(pán)（pH 7.1）、輕度退變椎間盤(pán)（pH 6.8）和嚴(yán)重退變椎間盤(pán)（pH 6.5）］的反應(yīng)。發(fā)現(xiàn)在低于pH 6.8 時(shí)，由海藻酸鈉包裹的干細(xì)胞增殖出現(xiàn)障礙，細(xì)胞不能存活和積累髓核樣基質(zhì)成分（糖胺聚糖和膠原）。HUDSON 等［36］發(fā)現(xiàn)低氧（1%～5%O2）條件下培養(yǎng)三維結(jié)構(gòu)可以增加原代IVD 細(xì)胞外基質(zhì)成分的產(chǎn)生。DU 等［37］將以包裹NP 細(xì)胞的海藻酸鈉水凝膠為核心的工程化IVD 植入物在裸鼠皮下植入后，發(fā)現(xiàn)隨著時(shí)間的推移，顯示出逐漸的組織形成，表現(xiàn)為細(xì)胞外基質(zhì)的沉積和組織以及機(jī)械性能的增強(qiáng)。

還有一些天然材料也常應(yīng)用于髓核的組織工程中。膠原（collagen）是髓核的重要組成成分之一。WANG 等［38］利用戊二醛交聯(lián)型膠原構(gòu)建一種新的人間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)和分化的支架，發(fā)現(xiàn)與Ⅰ型膠原相比，Ⅱ型膠原涂層板培養(yǎng)的干細(xì)胞表現(xiàn)出了sox-9、Ⅱ型膠原和aggrecan 基因表達(dá)的增加。XU 等［39］將髓核細(xì)胞封裝在膠原蛋白水解物、明膠和甲基丙烯酸酯（GelMA）組成的光敏水凝膠中，通過(guò)調(diào)節(jié)GelMA 水凝膠濃度觀察不同濃度下髓核細(xì)胞增殖、存活的狀態(tài)，得到了最佳的水凝膠濃度（5%）。CHOY 等［40］用膠原蛋白和糖胺聚糖（glycosaminoglycans,GAGs）制作了一個(gè)雙相支架，并且通過(guò)機(jī)械測(cè)試測(cè)得其恢復(fù)率（82%～89%）接近原生椎間盤(pán)（99%），并且動(dòng)態(tài)剛度和阻尼系數(shù)與原生椎間盤(pán)相似。CHIK 等［41］以骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和膠原等高分子材料為原料，采用基于模塊的一體化方法構(gòu)建具有復(fù)雜層次結(jié)構(gòu)的多組分脊柱運(yùn)動(dòng)節(jié)段（spinal motor segmen,SMS），創(chuàng)造了研究組織成熟和功能重塑的三維模型。

通過(guò)脫細(xì)胞過(guò)程獲得的脫細(xì)胞材料也可用作支架材料，這項(xiàng)技術(shù)的特點(diǎn)是其可以保持關(guān)鍵的天然細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）成分［42］。WU 等［43］通過(guò)脫細(xì)胞與凍干、交聯(lián)的處理，制備了豬源脫細(xì)胞基質(zhì)作為集成雙相IVD 支架，熒光顯微鏡和掃描電鏡顯示，該支架為AF 和NP 細(xì)胞的黏附和增殖提供了合適的三維環(huán)境，在保留了大量的膠原蛋白的同時(shí)，提供了較好的力學(xué)性能。CHAN 等［44］利用脫細(xì)胞技術(shù)對(duì)牛IVD 進(jìn)行脫細(xì)胞處理，構(gòu)建完整的終板到終板IVD 支架，通過(guò)改變化學(xué)和物理脫細(xì)胞參數(shù)，實(shí)現(xiàn)了高達(dá)70%的內(nèi)源性細(xì)胞的去除，并能夠保存椎間盤(pán)的糖胺聚糖含量、膠原纖維結(jié)構(gòu)和機(jī)械性能。

1.2 合成材料

目前常用的人工合成材料包括聚乳酸和聚乙醇酸等［44］。聚乳酸（polylactic acid,PLA）又名聚丙交醇，在體內(nèi)可以降解為無(wú)害的乳酸，常用來(lái)作為人體的植入物。XIANG 等［45］利用聚乳酸支架共培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞和胎兒髓核細(xì)胞，在植入兔椎間盤(pán)12 周后，觀察到植入細(xì)胞纖維樣表型，附著在聚乳酸-羥基乙酸（polylactic acid-polyglycolic acid,PLGA）支架上時(shí)形態(tài)正常，說(shuō)明PLGA 支架提供了可行的生長(zhǎng)條件、力學(xué)性能和空間結(jié)構(gòu)。KIM 等［46］開(kāi)發(fā)了不同孔徑的多孔聚乳酸-羥基乙酸支架，用于NP 細(xì)胞的培養(yǎng)，并研究了孔徑大小對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和ECM 合成的影響，發(fā)現(xiàn)小孔隙內(nèi)細(xì)胞密度高，通過(guò)相互連通的孔促進(jìn)膠原合成和細(xì)胞遷移。大孔隙支架細(xì)胞增殖和膠原合成較慢。

醫(yī)用聚乙二醇（polyethylene glycol,PEG）又稱(chēng)聚環(huán)氧乙烷，在一般條件下有著良好的穩(wěn)定性和溫和性。NGUYEN［47］等合成了一類(lèi)新型、結(jié)構(gòu)清晰、機(jī)械強(qiáng)度可調(diào)的聚乙二醇基納米復(fù)合水凝膠，壓應(yīng)力為24.2 MPa，壓縮斷裂應(yīng)變大于98%，展現(xiàn)了強(qiáng)大的抗壓能力。CHEN 等［48］通過(guò)四臂聚乙二醇（PEG-SH）與銀離子溶液的Ag-S 配位作用，合成了一種具有可注射性、自愈性、抗菌、可降解性和高吸水性的PEG 水凝膠，發(fā)現(xiàn)其與椎間盤(pán)的作用機(jī)制完全匹配。JEONG 等［49］以羥基磷灰石（HA-SH）和聚乙二醇乙烯基砜（PEG-VS）大分子單體為原料，制備了8 種不同的水凝膠，并將其作為NP 和AF 細(xì)胞體外培養(yǎng)的基質(zhì)，發(fā)現(xiàn)低分子量HA-PEG 水凝膠的NP 和AF 細(xì)胞數(shù)最高，而低分子量HA-PEG 水凝膠的NP 和AF 細(xì)胞數(shù)也較高。

其它諸如納米高分子材料等。WAN 等［50］以生物相容性、可剪切性和納米纖維結(jié)構(gòu)為特征的新型自組裝肽水凝膠（self-assembling peptide hydrogel,SAPH），作為髓核組織工程的細(xì)胞載體和支架材料，發(fā)現(xiàn)用其培養(yǎng)髓核細(xì)胞過(guò)程中，細(xì)胞存活率很高，同時(shí)，表型與體內(nèi)的髓核細(xì)胞類(lèi)似，活細(xì)胞群保持穩(wěn)定。MA 等［51］設(shè)計(jì)的新型的RADA16-Link N 自組裝肽支架材料，并將其與生物活性基序Link N 直接偶聯(lián)，得到了Link N 納米纖維支架材料（LN-NS），發(fā)現(xiàn)其能顯著促進(jìn)植入細(xì)胞的黏附與細(xì)胞外基質(zhì)的積累。

2 高分子材料的其它應(yīng)用

有一些研究嘗試直接采用復(fù)合合成材料代替髓核。KHANDAKER［52］等使用電紡纖維固定在硅膠盤(pán)上，組成ENAS 盤(pán)，對(duì)植入ENAS 椎間盤(pán)的兔尾進(jìn)行了離體機(jī)械測(cè)試，發(fā)現(xiàn)ENAS 椎間盤(pán)的粘彈性高于硅膠椎間盤(pán)，可與人類(lèi)髓核的粘彈性相媲美。但該法不屬于目前常見(jiàn)的組織工程方法研究范圍，故在這里不作過(guò)多的敘述。

3 結(jié)語(yǔ)與展望

髓核具有優(yōu)良的可塑性，其形態(tài)可隨脊柱作各種運(yùn)動(dòng)時(shí)因重心不同而改變，起著類(lèi)似軸承一樣滾動(dòng)支撐椎體的作用。在醫(yī)用植入材料中，金屬材料應(yīng)用廣泛，但其在體內(nèi)的生物相容性與生物降解性仍存在一定的問(wèn)題。基于水凝膠的新策略可能有助于揭示IVD 退行性疾病的新可能性。高分子材料具有良好的生物相容性，是目前髓核組織工程中用于構(gòu)建支架材料的常用生物材料，也是目前最受關(guān)注的研究對(duì)象。膠原、透明質(zhì)酸、海藻酸鹽等材料制成的水凝膠給種子細(xì)胞適宜的生長(zhǎng)環(huán)境，結(jié)合合適的生長(zhǎng)轉(zhuǎn)化因子，可以達(dá)到誘導(dǎo)分化的目的，對(duì)于控制炎癥、提高椎間盤(pán)的含水量、補(bǔ)充細(xì)胞外基質(zhì)以及恢復(fù)椎間盤(pán)高度有著十分重要的意義；合成材料的創(chuàng)新應(yīng)用也給研究帶來(lái)了更多思路與方向。由于椎間盤(pán)特殊的微觀組成及力學(xué)特性，需要選擇合適的方式對(duì)支架材料進(jìn)行構(gòu)建，進(jìn)一步測(cè)量材料的動(dòng)態(tài)性能，以滿(mǎn)足力學(xué)強(qiáng)度的要求。在此基礎(chǔ)上，選擇種子細(xì)胞及適宜生長(zhǎng)因子，最終構(gòu)建完整的組織工程髓核，實(shí)現(xiàn)受累椎間盤(pán)的修復(fù)再生。目前構(gòu)建的水凝膠載體多以注射的方式注入椎間盤(pán)組織內(nèi)，雖然已有的研究證明了注射的安全性［53］，但注射造成的纖維環(huán)損傷及可能的退變?nèi)匀恍枰P(guān)注，除了注射工具的口徑，注射的部位及路徑還需要更多的實(shí)踐證據(jù)。同時(shí)，也需要建立更多的動(dòng)物模型，進(jìn)一步探究通過(guò)組織工程手段治療椎間盤(pán)退行性病變的時(shí)機(jī)，過(guò)早或過(guò)晚的干預(yù)都達(dá)不到預(yù)期的效果。目前許多組織工程手段如天然高分子的改性、合成高分子的制備等已廣泛應(yīng)用于臨床，還有許多技術(shù)成果未來(lái)將應(yīng)用于臨床.所以，是否能夠解決患者的疼痛問(wèn)題應(yīng)該被重視，疼痛可能來(lái)源于多方面，構(gòu)建疼痛模型，觀察治療效果，也應(yīng)作為目前研究的重點(diǎn)。