不同濃度P-15 多肽作用下對人軟骨細胞增殖的影響分析

李源力，聶君蘭

（川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院骨科 四川 南充 637002）

關節(jié)軟骨作為一種特殊性的分化結締組織，主要覆蓋于關節(jié)表面，可為關節(jié)活動提供摩擦平臺，并且可起到分散壓力，對于軟骨下具有支持和保護作用。對于軟骨細胞外基質(zhì)（extra cellular matrix, ECM）來說，其是培養(yǎng)細胞附著的最佳“場所”，能夠有效地維持細胞處于正常的生長狀態(tài)，是維持細胞正常分化和關節(jié)運動的優(yōu)質(zhì)外環(huán)境。人體軟骨細胞占據(jù)人軟骨組織細胞干重的5%，甚至更少比例，是關節(jié)軟骨組織中唯一細胞。在本研究中選取不同濃度的P-15 多肽培養(yǎng)液，對人體軟骨細胞進行培養(yǎng)實驗，旨在分析P-15 不同濃度對于體外軟骨細胞的生物特性的基本影響，以期為P-15 多肽培養(yǎng)基用于體外人軟骨細胞的有效培養(yǎng)提供數(shù)據(jù)資料，現(xiàn)報道如下。

1.資料與方法

1.1 一般資料

選取2020 年3 月—2021 年3 月川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院接受股骨頸骨折開展全髖置換術的患者120 例，隨機分為對照組和觀察組各60 例。納入標準：①骨折部位明顯；②股骨頸骨折時間＜3 周；③年齡＜75 周歲；④知情并簽署同意書。排除標準：①患有腫瘤患者；②病理性的骨折患者及髖關節(jié)患有類風濕的患者。對照組年齡36 ～65 歲，平均年齡（48.34±0.23）歲；觀察組年齡37 ～66 歲，平均年齡（49.02±0.26）歲。兩組患者的一般資料比較，差異無統(tǒng)計學意義（＞0.05），具有可比性。本研究符合《赫爾辛基宣言》要求。

1.2 方法

（1）主要的實驗儀器： 多用恒溫箱（Multi-Heater2800A）、低速離心機（TDL-5-A）、倒置顯微鏡（2×71（BX71））、熒光顯微鏡（BX51）、生物安全柜等；主要的實驗試劑包含有：青霉素（華北制藥）、鏈霉素（魯抗制藥）、胰蛋白酶（美國）、Ⅱ型膠原酶（美國Sigma）等。甲苯按藍染液的配置：NaCl 1%的濃度，酒精選取70%濃度，甲苯胺藍原液的濃度為1%，甲苯胺藍工作液為1 mL 的甲苯胺藍原液+9 mL 1%的NaCl 溶液，實驗時現(xiàn)配現(xiàn)用，保證試劑的新鮮度。（2）軟骨細胞分離及培養(yǎng)：①軟骨細胞分離。收集股骨頸骨折行全髖關節(jié)置換的人股骨頭，轉(zhuǎn)至無菌操作臺進一步處理；無菌刀片去凈關節(jié)表面滑膜及可能覆蓋其上的軟組織，再將軟骨組織盡可能薄層切下來（不能切到軟骨下組織），用盛有PBS 液培養(yǎng)皿收集軟骨組織片，用PBS 液漂洗3 次，盡可能去掉軟骨表面貼附的滑膜及血液；將漂洗后軟骨片移至裝有PBS 液的小玻璃瓶中，用眼科剪將軟骨片剪成1 ～3 mm大小碎片，將碎片移入50 mL 無菌離心管中，加入0.25%胰蛋白酶至剛好淹沒所有碎片，蓋上離心管蓋（使離心管蓋保持擰松狀態(tài)，保證CO可以進出離心管），保持直立狀態(tài)放入37 ℃ CO孵箱中30 ～35 min。加入胎牛血清終止消化，并用PBS 液浸洗3 遍，倒掉離心管中液體；加入0.2%的Ⅱ型膠原酶至剛好淹沒軟骨碎片為宜，同樣擰松離心管蓋、直立狀態(tài)放入孵箱中，每小時震蕩離心管5 min 使軟骨組織和膠原酶充分接觸。肉眼觀察到液體變渾濁且有大片絮狀物出現(xiàn)時使用200 目金屬篩網(wǎng)過濾，剩余殘渣為未消化軟骨組織，回收到離心管中，加入Ⅱ型膠原酶繼續(xù)消化；消化時間據(jù)消化程度而定，但消化時間最好不超過12 h。②軟骨細胞的單層原代的培養(yǎng)。將檢測活力大于90%的原代軟骨細胞按照4×10個/mL 密度接種到25 cm的無菌塑料瓶中，培養(yǎng)基中含有20%的胎牛血清，DMEM 液，將培養(yǎng)瓶蓋擰松，放入孵化箱體中，箱內(nèi)的環(huán)境設計為：溫度37 ℃、二氧化碳的濃度為5%、濕度設計為95%。2 ～3 d 進行換液處理。③軟骨細胞的傳代。將培養(yǎng)瓶底部的軟骨細胞的覆蓋率要達到85%以上，將原有的培養(yǎng)液廢棄，PBS 液對培養(yǎng)瓶進行洗滌，消化時長最好設計為2 min 以內(nèi)，整個的消化過程中可選取使用培養(yǎng)瓶加上加速鐵壁軟骨細胞脫落，鏡下主要觀察細胞是否變圓。在培養(yǎng)液懸浮以后，加入含胎牛血清DMEM 溶液，終止消化處理，移入15 mL 無菌離心管中，1 000 r/min 離心5 min，棄上清液，加入含20%胎牛血清DMEM 液，吹打混勻，細胞計數(shù)后按1:2 接種于兩個新25 cm無菌塑料細胞培養(yǎng)瓶中，放回孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)，等待軟骨細胞長滿細胞培養(yǎng)瓶的底部85%及以上時，按照相同的方法進行傳代培養(yǎng)。（3）軟骨細胞的鑒定：主要包含使用甲苯胺藍染色進行鑒定處理。作為一種人工合成的醌亞胺類堿性染料，是由胺基、醌型苯環(huán)兩個發(fā)色團構成色原顯色；甲苯胺藍中存在陽離子，具備良好的染色作用；甲苯胺藍中還含有軟骨細胞糖胺多糖類酸性及陽性離子相結合的物質(zhì)，甲苯胺藍具有兩個助色團，可促進染料產(chǎn)生分離，進而形成鹽類，幫助發(fā)色團染色力。（4）收集細胞培養(yǎng)上清液：主要包含有收集用于檢測細胞因子的細胞培養(yǎng)液上清液、收集用于檢測Ⅰ型和Ⅱ型膠原蛋白含量的上清液。（5）軟骨細胞分泌Ⅰ、Ⅱ型膠原蛋白水平檢測：采用細胞增殖檢測試劑（Cell Counting Kit-8, CCK-8）檢測。依據(jù)標準品不同濃度對應OD 值計算出標準直線回歸方程，其中標準品對應孔位在1、2 孔位的濃度為30 pg/mL、3/4 孔位濃度為20 pg/mL、5/6 孔位濃度為10 pg/mL、7、8 濃度為5 pg/mL、9、10 濃度為2.5 pg/mL、11、12 濃度為0 pg/mL。

1.3 觀察指標

觀察并比較兩組軟骨細胞培養(yǎng)指標，外形狀態(tài)、貼壁時間及在瓶底聚集覆蓋率（%）、Ⅱ型膠原免疫組化鑒定軟骨細胞顏色變化及細胞核形態(tài)、甲苯胺藍染色后陽性表達情況；CCK-8 測定P-15 多肽作用后軟骨細胞增殖變化，主要評估增殖時間（d）；細胞培養(yǎng)上清液中P-15 濃度及FGF 濃度（pg/mL）。

1.4 統(tǒng)計學方法

2.結果

2.1 軟骨細胞的培養(yǎng)

對于剛消化下來的軟骨細胞來說，其細胞的結構主要呈現(xiàn)圓形，且呈現(xiàn)懸浮狀態(tài)分布，部分細胞呈現(xiàn)出集落性生長，并且在培養(yǎng)12 h 時，會出現(xiàn)少量的細胞貼壁現(xiàn)象，大多數(shù)的細胞貼壁時間＞24 h，7 ～10 d 在培養(yǎng)瓶底部結構的覆蓋率可達到85%以上。

2.2 Ⅱ型膠原免疫組化鑒定軟骨細胞

經(jīng)過染色后，軟骨細胞質(zhì)可見棕黃色顆粒，細胞核不著色。

2.3 甲苯胺藍染色

經(jīng)過甲苯胺藍染色處理后，陽離子與軟骨細胞分泌酸性糖胺多糖，并結合異染成紫紅色，呈現(xiàn)陽性表達。

2.4 CCK-8 測定不同濃度P-15 多肽作用后軟骨細胞增殖變化

CCK-8 測定不同濃度P-15 多肽作用后軟骨細胞增殖變化，兩組增殖變化比較，差異有統(tǒng)計學意義（＜0.05），見表1。

表1 CCK-8 檢測軟骨細胞的增殖統(tǒng)計分析（OD 值）

2.5 細胞培養(yǎng)上清液中

FGF、BMP-2、PDGF-BB、IGFBP-34 因子水平FGF 隨培養(yǎng)時間增加，細胞培養(yǎng)上清液中FGF 濃度越高，第8、10 d 上清液中FGF 差異不明顯，其他不同培養(yǎng)天數(shù)間上清液中FGF 比較，差異有統(tǒng)計學意義（＜0.05）。選取第8 天培養(yǎng)上清液檢測，空白組FGF 濃度最低，與觀察組P-15 100 mg/L 及200 mg/L 濃度比較該因子濃度差，差異有統(tǒng)計學意義（＜0.05）；空白組與觀察組P-15 50 mg/L 之間比較，差異無統(tǒng)計學意義（＞0.05），見表2。BMP-2 與上清液中FGF 檢測結果相似，第8、10 d 上清液中BMP-2 差異不顯著，其他不同培養(yǎng)天數(shù)間上清液中BMP-2 比較，差異有統(tǒng)計學意義（＜0.05）。取第8 天培養(yǎng)上清液檢測，空白組與觀察組P-15 不同濃度組比較，差異不顯著（＞0.05），見表3。

表2 第8 天培養(yǎng)上清液中FGF 濃度（±s）

表3 第8 天培養(yǎng)上清液中BMP-2 濃度（±s）

3.討論

通過上述分析得出主要結論：（1）軟骨細胞的培養(yǎng)：從細胞結構的形狀看，大多呈現(xiàn)懸浮狀態(tài)，大都呈現(xiàn)集落性的生長，經(jīng)過12 h 的培養(yǎng)后，出現(xiàn)貼壁現(xiàn)象，貼壁時間超過1 日，培養(yǎng)7 h 后的瓶底貼壁覆蓋率高于85%；（2）I 型膠原免疫組化鑒定軟骨細胞，細胞核不著色；（3）甲苯胺藍染色。經(jīng)過與軟骨細胞所分泌酸性糖胺多糖相比，可充分的結合染色，呈現(xiàn)陽性居多。

與同類實驗進行對比，本實驗先進處在于選取軟骨細胞表型變化，去分化發(fā)生“交界”的第三代人類軟骨細胞進行培養(yǎng)。大多數(shù)的實驗選取與人類近似的細胞，如兔關節(jié)軟骨單位體積的細胞，但是動物細胞比人類細胞的生長活躍。本實驗選取患者關節(jié)置換術所獲取的軟骨組織消化所得的軟骨細胞，排除關節(jié)炎，更加符合人體實際生理狀態(tài)。

結合理論研究，本實驗結果顯示，體外軟骨細胞生長明顯快速于平臺期，但是由于軟骨細胞培養(yǎng)前24 h 不適宜實驗，因此未觀察到明確的潛伏期。相關研究也得出，體外培養(yǎng)細胞前3 d 高濃度的P-15 可以間接性的抑制細胞的增殖，本實驗中，所觀察到的體外培養(yǎng)6 d后細胞呈現(xiàn)出生長停滯的狀態(tài)，同時需要考慮到多方面的原因。

綜上所述，P-15 多肽可高效的促進經(jīng)體外培養(yǎng)的人軟骨組織的增生，當其濃度在100 mg/L 時，對軟骨細胞擴增作用最強；P-15 多肽濃度在100 mg/L 時效果最強。此外，自體軟骨細胞的移植術作為一項較為先進的技術，仍然存在很多的難點問題，例如軟骨細胞的有效獲取、耗材費用較高，體外培養(yǎng)細胞用血清對人體免疫排斥反應等。因此在日后的相關研究中，手術技術、生物因子及材料等都需要進一步的改進和優(yōu)化。