野生蜜環(huán)菌(ArmillariaMellea)的分離純化及抑菌作用

穆燕 律鳳霞 艾鑫 趙文君

摘 要：分離純化野生蜜環(huán)菌菌絲培養(yǎng)物，研究菌絲體代謝物質(zhì)對大腸桿菌、金黃葡萄球菌、志賀氏菌和副溶血性弧菌的抑制作用.采集野生蜜環(huán)菌子實體，獲得遺傳同一性菌絲體純培養(yǎng)物，振蕩培養(yǎng)獲得菌絲體代謝液，觀察其對致病菌的抑菌效果.實驗結(jié)果表明，分離純化得到的菌絲體純培養(yǎng)物與蜜環(huán)菌遺傳同一，菌絲體代謝液對大腸桿菌、金黃葡萄球菌、志賀氏菌和副溶血性弧菌等食品中常見的致病菌具有較好的抑制作用

關(guān)鍵詞：蜜環(huán)菌;組織分離;分子鑒定;致病菌

[中圖分類號]180.6140 ? [文獻標志碼]A

隨著人們對食品安全的高度重視，天然食品防腐劑的價值被越來越多的人認可和重視.許多食藥用菌具有天然的抑菌效果[1-3]，既能提供食藥用成份，也可替代化學(xué)防腐劑，保證食品純天然質(zhì)量.蜜環(huán)菌（Armillaria mellea）俗稱榛蘑，屬白蘑科蜜環(huán)菌屬的一種好氧性兼性寄生真菌[4]，廣泛分布于世界各地，在我國的黑龍江、吉林、青海、浙江、湖南、貴州等省常見.[5]本實驗研究蜜環(huán)菌代謝物質(zhì)對食品中常見致病菌的抑制作用，探討蜜環(huán)菌菌絲體在食品中的食藥用價值.

1 材料與儀器

1.1 試驗材料及儀器

實驗材料 9月末10月初野外采集蜜環(huán)菌子實體.采集到的蜜環(huán)菌子實體棕黃色或淺土黃色，中央部顏色稍深，菌蓋表面密生小鱗片或叢卷毛狀鱗片，開傘的菌蓋邊緣多波浪形，內(nèi)部具有放射狀條紋，菌柄長柱形稍彎曲，纖維質(zhì)，內(nèi)部松軟，符合蜜環(huán)菌子實體表型特征.

大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、志賀氏菌（Shigella Castellani）、副溶血性弧菌（Vibrio Parahemolyticus）由牡丹江師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院微生物實驗室提供.

實驗儀器 PCR試劑盒（寶生物工程有限公司產(chǎn)品），真菌DNA提取試劑盒（QIAGEN公司產(chǎn)品），雙面超凈工作臺，恒溫光照培養(yǎng)箱，全自動高溫蒸汽滅菌鍋，PCR儀，恒溫水浴鍋.

1.2 培養(yǎng)基

PDA加富培養(yǎng)基 20%馬鈴薯，2%葡萄糖，1%酵母浸粉，1%瓊脂粉，0.3%磷酸二氫鉀，0.15%硫酸鎂，0.01%維生素B1.

液體培養(yǎng)基配方 20%馬鈴薯、2%葡萄糖、1%酵母浸粉、0.3%磷酸二氫鉀、0.15%硫酸鎂、0.01%維生素B1.

2 試驗方法

2.1 野生蜜環(huán)菌子實體組織分離

組織分離法分離菌絲體.在超凈工作臺上，用75%酒精消毒蜜環(huán)菌子實體表面，掰開蘑菇傘頂組織，無菌解剖刀割取內(nèi)部小塊菌肉，接種于平板PDA加富培養(yǎng)基中.重復(fù)接種三板，23 ℃恒溫暗培養(yǎng).觀察菌絲生長狀態(tài)，保證菌落單一，無污染.

2.2 蜜環(huán)菌液體培養(yǎng)

選擇組織分離后單一無污染的菌落，無菌環(huán)境下挑取邊緣菌絲轉(zhuǎn)接至液體培養(yǎng)基，23℃恒溫振蕩培養(yǎng)15 d.

2.3 蜜環(huán)菌子實體及菌絲體DNA分子鑒定[6]

純培養(yǎng)物液體振蕩再培養(yǎng)，過濾獲得蜜環(huán)菌菌絲體球，用真菌DNA提取試劑盒分別提取子實體和菌絲體DNA，以真菌ITS通識引物對DNA進行PCR擴增，反應(yīng)體系及反應(yīng)條件見表1.

PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳驗證，子實體DNA和菌絲體DNA的PCR產(chǎn)物各選兩個特異條帶清晰的送生物公司測序，測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站BLAST比對，確定分離得到的菌絲體和子實體之間的遺傳同一性.

2.4 蜜環(huán)菌代謝液抑菌實驗

致病菌活化 取出低溫保存的致病菌大腸桿菌、志賀氏菌、金黃葡萄球菌和副溶血性弧菌，無菌環(huán)境下分別轉(zhuǎn)接到LB液體培養(yǎng)基中，37℃，200 rpm恒溫震蕩培養(yǎng)24 h，得到致病菌菌懸液.

蜜環(huán)菌代謝液制備 振蕩培養(yǎng)15 d的蜜環(huán)菌培養(yǎng)液，無菌條件下過濾得濾液，加10%的1×PBC緩沖液.

牛津杯法[7]驗證抑菌效果 超凈工作臺內(nèi)將融化的LB固體培養(yǎng)基10～15 mL倒入培養(yǎng)皿內(nèi)，放置凝固作為底層.將活化后的4種致病菌菌懸液與40 ℃左右的LB固體培養(yǎng)基按1∶2的比例混合，分別倒入已凝固的LB固體培養(yǎng)基平皿上，倒入量約10～15 mL，在混合培養(yǎng)基凝固前迅速均勻擺放4個無菌牛津杯.待培養(yǎng)基凝固后在每個牛津杯中注滿蜜環(huán)菌代謝液，移到37 ℃恒溫環(huán)境靜置培養(yǎng)16～20 h后，觀察抑菌效果，測量抑菌圈直徑.

3 結(jié)果與分析

3.1 蜜環(huán)菌組織分離培養(yǎng)

組織分離法培養(yǎng)的菌絲體表現(xiàn)為白色致密菌絲，培養(yǎng)后期菌落內(nèi)部有菌索形成（圖1）.

3.2 蜜環(huán)菌分離菌液體培養(yǎng)

蜜環(huán)菌純化菌恒溫振蕩液體培養(yǎng)15 d后得到大小均勻的白色菌球，代謝液清澈，菌球清晰可見，無菌條件過濾得清澈濾液.

3.3 蜜環(huán)菌子實體及菌絲體DNA分子鑒定

過濾得到的菌球與子實體同時提取DNA，以真菌ITS通識引物進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳分離（圖2）.

依DNA 2 000 bp maker可見：2個子實體DNA和5個菌絲體DNA的PCR產(chǎn)物均在大于750 bp處出現(xiàn)特異條帶，菌絲體PCR產(chǎn)物比子實體PCR產(chǎn)物條帶清晰且亮度高.測序結(jié)果表明：

子實體DNA和菌絲體DNA序列相同.測序序列在NCBI網(wǎng)站進行Nucleotide BLAST比對，與網(wǎng)站公布MW418 555.1同源性達100%，確定采集的子實體和分離的純培養(yǎng)物為東北蜜環(huán)菌.

3.4 蜜環(huán)菌代謝液抑菌效果

蜜環(huán)菌代謝液對4種致病菌的抑菌效果見圖3.四組試驗培養(yǎng)基中牛津杯周圍均出現(xiàn)明顯的抑菌圈，不同致病菌中的抑菌圈大小和透明度有明顯差異.對大腸桿菌的抑制效果表現(xiàn)為抑菌圈直徑大且透明度高，對金黃葡萄球菌和志賀氏菌的抑制效果為抑菌圈直徑大但透明度不高，對副溶血性弧菌的抑菌效果為抑菌圈直徑較小但透明度高.

4 結(jié)論

蜜環(huán)菌代謝液對食品中常見大腸桿菌、金黃葡萄球菌、志賀氏菌和副溶血性弧菌等食品中常見致病菌具有較好的抑菌效果，蜜環(huán)菌代謝液對不同致病菌抑菌效果的差異可通過提高添加深度和純度進一步進行研究.蜜環(huán)菌生長不需要苛刻的培養(yǎng)條件，組織培養(yǎng)容易獲得大量菌鎖及菌絲體，液體培養(yǎng)容易獲得大量菌球及代謝液，可彌補子實體季節(jié)性生長的限制.

參考文獻

[1]Pinchu k I V，Bressoll ier P，Verneuil B，et al.In vitro anti H eli-cobacter pylori activity of the probiotics train Bacillus subtilis 3 isdue to secretion of antibiotics[J].Antimicrob Agents Chem other，2001，45：3156-3161.

[2]倪錦虹，彭亮聰.食用菌提取物的抑菌作用研究進展[J].食品安全導(dǎo)刊.2021（09）：150-151.

[3]羅青，王國霞.藥食用真菌抑菌作用的研究進展[J].鄭州師范教育，2018，04（3）：30-32.

[4]袁媛，劉景圣.蜜環(huán)菌液體深層發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)選[J].農(nóng)產(chǎn)品加工，2009（7）：57-59.

[5]聶維.黑龍江榛蘑產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀及生長環(huán)境調(diào)查探究[J].種子科技，2021，05（3）：110-112.

[6]趙世明，律鳳霞.番茄早疫病病原菌分離純化及分子鑒定[J].牡丹江師范學(xué)院學(xué)報;自然科學(xué)版，2020（04）：31-34.

[7]熊莉，朱謙慧.在本科微生物實驗教學(xué)中拓展抑菌實驗的探索[J].實驗科學(xué)與技術(shù)，2020，04（09）：88-92.

編輯：琳莉