衍生-氣相色譜法測定食品中亞硝酸鹽*

溫伊蕾,劉國平,丁麗燕

(中山市疾病預(yù)防控制中心，廣東 中山 528403)

亞硝酸鹽和硝酸鹽是自然界中普遍存在的含氮無機化合物。硝酸鹽的重要來源是由自然界中的氮循環(huán)以及人類的活動所構(gòu)成。在其形成的過程中，由于微生物的作用，常伴有亞硝酸鹽的產(chǎn)生。常見的亞硝酸鹽主要有亞硝酸鈉和亞硝酸鉀，外觀與食鹽類似，呈白色至淡黃色，粉末或顆粒狀，無臭，味微咸，易潮解和溶于水，因其獨特的化學(xué)屬性常被作為食品的添加劑、防腐劑和發(fā)色劑，廣泛應(yīng)用于食品加工中。一般情況下，人體中的亞硝酸鹽主要是食物和飲水中的硝酸鹽在口腔及胃中細菌的作用下轉(zhuǎn)化而來[1]。亞硝酸鹽還可以通過一定途徑被還原為一氧化氮。攝入含有低水平亞硝酸鹽的食物可補充人體內(nèi)的亞硝酸鹽。但由于其物理性質(zhì)與食鹽相類似，日常管理不善和使用不當(dāng)導(dǎo)致誤食中毒事件時有發(fā)生。人攝入0.3～0.5 g亞硝酸鹽即可引起中毒，一次性食入超過3 g則可導(dǎo)致死亡[2]。人體攝入亞硝酸鹽后，體內(nèi)過量的亞硝酸鹽可使血液中二價鐵離子氧化為三價鐵離子，使正常血紅蛋白轉(zhuǎn)化為高鐵血紅蛋白，失去攜氧能力，引起組織缺氧，發(fā)生中毒[3]。亞硝酸鹽中毒的潛伏期長短不等，視攝入亞硝酸鹽的數(shù)量、濃度而定。一般潛伏期為1～3小時，長者可達1～2天，短者僅10分鐘左右。通常中毒表現(xiàn)為發(fā)紺(皮膚或粘膜呈現(xiàn)青紫色)、胸悶、呼吸困難、呼吸急促、頭暈、頭痛、心悸等。中毒嚴(yán)重者還可出現(xiàn)惡心、嘔吐、心率變慢、心律不齊、煩躁不安、血壓降低、肺水腫、休克、驚厥或抽搐、昏迷，最后可因呼吸、循環(huán)衰竭而死亡[4]。馬巖、王霄曄等的研究表明[5]，近年來在全國性化學(xué)食物中毒事件中，由誤食誤用亞硝酸鹽而引發(fā)的食物中毒事件占所有化學(xué)性食物中毒事件的比例高達50%。

目前，常用的食品中亞硝酸鹽檢測方法有分光光度法、離子色譜法、熒光法、電化學(xué)法、化學(xué)發(fā)光法、示波極譜法等[4-12]，而國家標(biāo)準(zhǔn)對日常食品中亞硝酸鹽限量和檢測方法都有了相應(yīng)的規(guī)定。但是各方法都存在一定的局限性，其中分光光度法在日常檢測過程中亞硝酸鹽含量較大時,過量的亞硝酸鹽對耦合反應(yīng)產(chǎn)生影響，使耦合的組分發(fā)生氧化、硝化反應(yīng)，容易出現(xiàn)褪色現(xiàn)象。在中毒事件發(fā)生時，往往樣品的亞硝酸鹽含量都比較大，容易造成結(jié)果的誤判。離子色譜法也存在操作步驟繁瑣，干擾因素多，檢測范圍窄等缺點[6]。熒光法對環(huán)境因素較敏感,干擾因素較多且由于發(fā)生熒光強度的物質(zhì)較少,此方法應(yīng)用范圍較窄[7-8]。電化學(xué)法對于電極的選擇及電極表面的修飾材料要求較嚴(yán)苛,實驗方法不穩(wěn)定性大[9]?；瘜W(xué)發(fā)光法則需要高燃燒溫度來保持一氧化氮的存在，且氣相化學(xué)發(fā)光法檢測對于還原劑的強度有很大的選擇性要求[10]。示波極譜法分析技術(shù)后樣品的峰型復(fù)雜，需要耗時分析，影響檢測時效[4]。因此，在食物中毒事件中的檢測采用快速定性和定量方法，對臨床救治、保障人民群眾生命安全以及監(jiān)督管理工作有著十分重要的意義。

本文研究利用在酸性條件下亞硝酸鹽與環(huán)己基氨基磺酸鈉作用生成環(huán)己基氨基磺酸酯，建立食品中亞硝酸鹽氣相色譜測定方法，為日常食品檢測和食物中毒事件檢測提供一種快速、靈敏、準(zhǔn)確的方法。

1 材料與方法

1.1 儀 器

6890N氣相色譜儀，安捷倫公司；FID檢測器，安捷倫公司；石英毛細管柱HP-5(30 m×0.32 mm×0.25 μm)，安捷倫公司；Milli-Q Advantage A10超純水儀，美國密理博公司；AB265-S電子天平(感量0.0001g)，瑞士METTLER TOLEDO 公司；G560E 渦旋混合器，美國SCIENTIFIC INDUSTRIES 公司。

1.2 試 劑

環(huán)己基氨基磺酸鈉(純度>98%)，TCI化成工業(yè)發(fā)展有限公司；濃硫酸(分析純)，廣州化學(xué)試劑廠；正己烷(色譜純)，美國默克公司；氯化鈉(分析純)，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；乙酸鋅(分析純)，廣州化學(xué)試劑廠；亞鐵氰化鉀(分析純)，廣州化學(xué)試劑廠；硼砂(分析純)，廣州化學(xué)試劑廠。

1.3 色譜條件

色譜柱：HP-5毛細管柱，30 m×0.32 mm×0.25 μm；溫度：進樣口200 ℃，檢測器250 ℃；柱溫：80 ℃恒溫；空氣：400 mL/min;氫氣：40 mL/min；載氣：高純N2，恒流30 mL/min；進樣方式：分流進樣，分流比20:1；進樣體積：1.0 μL。

1.4 試驗方法

1.4.1 方法原理

在硫酸介質(zhì)中，樣品中的亞硝酸鹽與環(huán)己基氨基磺酸鈉生成環(huán)己醇亞硝酸酯，經(jīng)正己烷提取后，用帶FID檢測器的氣相色譜儀進行定量分析。

1.4.2 樣品處理方法

將樣品放置到勻漿機中進行打碎，取5 g樣品放入三角瓶中，再加純水25 mL充分振搖混勻，經(jīng)過過濾，將濾液置入50 mL帶蓋離心管中，再把帶蓋離心管放置入冰浴5 min后，迅速把5 mL正己烷、2.5 mL環(huán)己基氨基磺酸鈉、2.5 mL硫酸溶液準(zhǔn)確加入離心管后，蓋緊、搖勻并在冰浴中放置30 min，后加入2.5 g氯化鈉振搖，離心取上清液冷藏備用。

1.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別吸取適量的亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液于6個10 mL容量瓶中，用適量的超純水配制成0，5.00 μg/mL，10.0 μg/mL，20.0 μg/mL，80.0 μg/mL，100.0 μg/mL(相當(dāng)于0，50 μg，100 μg，200 μg，800 μg，1000 μg亞硝酸鈉)，同樣品相同步驟衍生化后，上機檢測。

2 結(jié)果討論

2.1 線性范圍和檢出限

將標(biāo)準(zhǔn)系列溶液按照本方法色譜條件進行測定，亞硝酸鹽衍生后生成的環(huán)己醇亞硝酸酯的保留時間為3.036 min(圖1)。本方法在0～1000 μg線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(圖2)，相關(guān)系數(shù)0.9993，回歸方程Y=0.09232X-0.7558，檢出限為0.70 μg。若取樣5 g樣品，測得亞硝酸鹽的最低檢出濃度為0.14 mg/kg。因國標(biāo)GB 5009.33-2016中的分光光度法通過筆者研究發(fā)現(xiàn)，在亞硝酸鹽含量大于500 μg時，過量的亞硝酸鹽對耦合反應(yīng)產(chǎn)生影響，使耦合的組分發(fā)生氧化、硝化反應(yīng)，繼而出現(xiàn)褪色現(xiàn)象，導(dǎo)致其影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。為此，使用本方法后，因其具有線性范圍廣的特性，則可完全避免褪色現(xiàn)象發(fā)生，進一步提高實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。

圖1 環(huán)己醇亞硝酸酯色譜圖Fig.1 Gas chromatogram of cyclohexanol nitrite

圖2 亞硝酸鹽含量標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 The standard curve of nitrite

2.2 加標(biāo)回收試驗和精密度試驗

以咸菜為例，稱取同一均勻絞碎不含本底的咸菜樣品共18份，分成3組，每組分別加入160 μg、420 μg、800 μg亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液，按本文所述方式進行檢測，連續(xù)開展6次實驗，取得結(jié)果見表1。

表1 加標(biāo)回收率和精密度試驗結(jié)果(n=6)

2.3 衍生條件優(yōu)化試驗

通過加入10% 環(huán)己基氨基磺酸鈉10 μL、50 μL、100 μL、250 μL、500 μL、1000 μL、2000 μL用本試驗方法進行檢測，結(jié)果顯示在500 μL以上時，其信號響應(yīng)不再隨環(huán)己基氨基磺酸鈉的含量增加而升高，因此本試驗選擇加入500 μL的10%環(huán)己基氨基磺酸鈉進行測定。

2.4 衍生溫度的影響

將已知濃度的樣品按本試驗方法在0 ℃冰浴、25 ℃室溫、60 ℃水浴、100 ℃加熱的條件下進行反應(yīng)后，在同一色譜條件下進行分析，其結(jié)果表明在冰浴條件下信號響應(yīng)值最大，因此選擇在冰浴下進行本試驗。

2.5 本法與國標(biāo)方法比較

用本試驗方法與國標(biāo)分光光度法對30個不同類別樣品進行檢測，其結(jié)果見表2。同時用SPSS13.0軟件對衍生-氣相色譜法與分光光度法檢測結(jié)果作兩配對樣品t檢驗(T-Ttest)的統(tǒng)計分析，得到t=1.397，p=0.173，按α=0.05水準(zhǔn)，無統(tǒng)計學(xué)差異，說明兩種方法檢測同一樣品中亞硝酸鹽沒有統(tǒng)計學(xué)差異。

表2 本方法與分光光度法測定亞硝酸鹽結(jié)果比較

3 結(jié) 論

通過本試驗建立了衍生-氣相色譜測定食品中亞硝酸的方法，相對于其它的食品中亞硝酸鹽檢測方法分光光度法、離子色譜法、熒光法、電化學(xué)法、化學(xué)發(fā)光法、示波極譜法等，后者都存在一定的局限性，操作步驟繁瑣，干擾因素多，檢測范圍窄的缺點，容易造成結(jié)果的誤判。而衍生-氣相色譜測定食品中亞硝酸的方法，由于其具有簡化前處理步驟，靈敏度高、線性范圍廣的特性，且準(zhǔn)確度、精密度、回收率均能滿足檢測需求，并可用于食物中毒事件發(fā)生時的亞硝酸鹽測定，對于臨床救治，尤其是保障人民群眾生命安全以及監(jiān)督管理工作有著十分重要的作用。綜上所述，對食品中亞硝酸鹽中的檢測方法多很多種，每一種方法都有其優(yōu)點，也有其不足之處，對亞硝酸鹽的檢測要根據(jù)不同精度的要求選取不同的檢驗方法，不過最終的目的就是把亞硝酸鹽控制在安全范圍之內(nèi)，保證人民的生命安全。