延胡索生物堿的分離純化及抗炎作用研究

江明達(dá),包文麗, 徐 寧,于佳琪,許 良

(內(nèi)蒙古民族大學(xué)天然產(chǎn)物化學(xué)及功能分子合成自治區(qū)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 通遼 028000)

蒙藥延胡索是罌粟科植物延胡索的塊莖，其味辛、苦、性溫、歸心、肝、脾經(jīng)，具有活血化瘀、理氣止痛的功效[1]。目前從延胡索中分離40多種生物堿類(lèi)化合物，可分為原小檗型、阿樸啡型、原阿片型、異喹啉芐咪唑啉型、異喹啉苯并菲啶型和雙芐基異喹啉型等生物堿[2-10]，同時(shí)還有甾體類(lèi)、蒽醌類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)、糖類(lèi)等化合物[11-14]。在現(xiàn)代藥理研究中，延胡索生物堿是消炎陣痛的主要生物活性化合物之一，其中延胡索乙素的鎮(zhèn)靜催眠作用最強(qiáng)，延胡索丑素次之，而延胡索奎素最差[15-16]。Leung等[17]通過(guò)高架迷宮(一種用于抗焦慮評(píng)估的行為模型)證實(shí)當(dāng)給小鼠口服低劑量的延胡索乙素時(shí)，能夠較好的緩解小鼠的焦慮癥狀。延胡索能夠解除坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷所致神經(jīng)病理性疼痛，其鎮(zhèn)痛程度甚至能夠達(dá)到典型鎮(zhèn)痛藥嗎啡作用的40%[18]。除此之外，延胡索具有抗腫瘤、抗?jié)?、抗肝損傷、抗心肌缺血等作用[20-26]。

分子對(duì)接技術(shù)是依據(jù)配體與受體作用的“鎖-鑰原理”，模擬配體小分子與受體生物大分子相互作用的一種技術(shù)方法。配體與受體相互作用是分子識(shí)別的過(guò)程，主要包括靜電作用、氫鍵作用、疏水作用、范德華作用等。通過(guò)計(jì)算，可以預(yù)測(cè)兩者間的結(jié)合模式和親和力發(fā)現(xiàn)配體-蛋白的相互作用方式，用于解釋生物學(xué)實(shí)驗(yàn)、為發(fā)現(xiàn)活性化合物提供指導(dǎo)。分子對(duì)接作為一種虛擬篩選工具，特別適合從藥用植物中篩選出可呈藥性的先導(dǎo)化合物，從而降低實(shí)驗(yàn)篩選化合物的數(shù)量，進(jìn)而縮短研究周期。

本研究采用75%乙醇為溶劑，經(jīng)石油醚、乙酸乙酯和正丁醇依次萃取，獲得乙酸乙酯部位，采用色譜技術(shù)分離純化延胡索中生物堿成分，并應(yīng)用分子對(duì)接技術(shù)篩選生物活性化合物，為蒙藥延胡索的開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試劑

1.1 儀 器

FW100高速萬(wàn)能粉碎機(jī)，天津市泰斯特儀器有限公司；RE-2002旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，鄭州儀器設(shè)備有限公司；SHZ-CB循環(huán)水式多用真空栗，鞏義市子華儀器有限責(zé)任公司；KQ-250DE數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；FA2104N電子分析天平，上海民橋精瓷科學(xué)儀器有限公司；DHG-9140鼓風(fēng)干燥箱，上海賽歐試驗(yàn)設(shè)備有限公司；B-220恒溫水浴鍋，上海亞榮生化儀器廠(chǎng)；JIDI-UP超純水機(jī)，廣州吉迪儀器有限公司；LC-6AD半制備高效液相色譜儀，日本島津有限公司；Bruker Avance 500 MHz核磁共振波譜儀，德國(guó)Bruker公司；ZF-8N智能暗箱式四用紫外分析儀，上海嘉鵬科技有限公司。

1.2 試 劑

無(wú)水乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇、二氯甲烷，分析純，天津大茂化學(xué)試劑廠(chǎng)；柱層硅膠、薄層硅膠、化學(xué)純，青島海洋化工有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 延胡索化學(xué)成分的分離純化

稱(chēng)取3.0 kg粉碎延胡索，用75%乙醇浸泡24.0 h，加熱回流提取后3.0 h，減壓濃縮回收乙醇獲得浸膏。將浸膏用石油醚層、乙酸乙酯和正丁醇依次進(jìn)行萃取，再以甲醇-水為流動(dòng)相經(jīng)過(guò)反相C18柱將乙酸乙酯部位進(jìn)行梯度洗脫，收集餾分Fr 1～Fr 5。

Fr 1采用硅膠柱層析分離，以二氯甲烷-甲醇體系(60:1、40:1、20:1、10:1、1:1)洗脫，獲得餾分Fr 1.1～10。Fr 1.3和Fr 1.7經(jīng)過(guò)反復(fù)硅膠柱層析和硅膠薄層層析純化，獲得化合物1、2和3。

Fr 2采用硅膠柱層析分離，以二氯甲烷-甲醇體系(60:1、40:1、20:1、10:1、1:1)洗脫，獲得餾分Fr 2.1～18。Fr 2.2在室溫下析出固體，過(guò)濾，固體用二氯甲烷反復(fù)重結(jié)晶，獲得化合物4。濾液經(jīng)硅膠柱層析分離，以二氯甲烷-甲醇體系(60:1、40:1、20:1、10:1、1:1)洗脫，獲得餾分Fr 2.2.1～Fr2.2.16。Fr 2.2.2經(jīng)過(guò)反復(fù)硅膠柱層析和硅膠薄層層析純化，獲得化合物化合物5和6。Fr 2.2.4經(jīng)過(guò)反復(fù)硅膠薄層層析純化，獲得化合物7和8。Fr 2.6采用硅膠柱層析分離，以二氯甲烷-甲醇體系(30:1)洗脫，經(jīng)薄層層析檢測(cè)合并，再用半制備高效液相色譜純化，獲得化合物9和10。

Fr 3采用硅膠柱層析分離，以二氯甲烷-甲醇體系(60:1、40:1、20:1、10:1、1:1)洗脫，獲得餾分Fr 3.1～3.14。Fr3.2繼續(xù)用硅膠柱層析分離，以二氯甲烷-甲醇體系(80:1、70:1、60:1、50:1、40:1、30:1、20:1、10:1、1:1)洗脫，收集餾分Fr 3.2.1～3.2.7。Fr 3.2.1經(jīng)反復(fù)硅膠薄層層析純化，獲得化合物11和12。

2.2 蛋白質(zhì)靶點(diǎn)的篩選

根據(jù)生物信息學(xué)和多種數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出與抗炎相關(guān)的3個(gè)蛋白(COX-2、1S1R、1DVX)，下載蛋白的3D結(jié)構(gòu)并保存。

2.3 分子對(duì)接Auto Dock

Auto Dock由Scripps 研究所的Olson實(shí)驗(yàn)室開(kāi)發(fā)與維護(hù)，運(yùn)用拉馬克遺傳算法來(lái)計(jì)算配體與受體之間最佳的結(jié)合狀態(tài)。Auto Dock軟件由Auto Grid和Auto Dock兩個(gè)程序組成，還具備分子可視化輔助對(duì)接軟件 Auto Dock Tools程序。將下載的蛋白受體的3D結(jié)構(gòu)以及蒙藥延胡索中分離出的12個(gè)化合物(四氫小蘗堿、巴馬汀、延胡索乙素、去氫紫堇堿、四氫紫堇薩眀、異紫堇球堿、四氫非洲防己胺、d-紫堇堿、四氫黃連堿、海罌粟堿、脫氫海罌粟堿、普魯托品)導(dǎo)入到對(duì)接軟件Auto Dock Tools中進(jìn)行運(yùn)算，得出對(duì)接自由能及一類(lèi)構(gòu)象數(shù)量。

3 結(jié)果與討論

3.1 化合物的鑒定

從蒙藥延胡索中分離出12個(gè)化合物，經(jīng)1H NMR和13C NMR鑒定，它們分別為去氫紫堇(1)、延胡索乙素(2)、d-紫堇堿(3)、四氫小蘗堿(4)、四氫非洲防己胺(5)、四氫巴馬汀(6)、四氫黃連堿(7)、四氫紫堇薩眀(8)、異紫堇球堿(9)、海罌粟堿(10)、脫氫海罌粟堿(11)、普魯托品(12)，見(jiàn)圖1。

圖1 化合物1～12結(jié)構(gòu)Fig.1 Strcture of compound 1～12

3.2 化合物1～12與蛋白COX-2作用

計(jì)算蒙藥延胡索中化合物與靶點(diǎn)蛋白的自由能以及一類(lèi)構(gòu)象數(shù)量來(lái)評(píng)估小分子的活性，其中接自由能反應(yīng)了配體與蛋白之間的親和力結(jié)合能與對(duì)接的好壞成反比，自由能越低對(duì)接結(jié)果越穩(wěn)定。一類(lèi)構(gòu)像數(shù)量是指最優(yōu)構(gòu)象相似的對(duì)接結(jié)果，數(shù)值越大，反應(yīng)小分子在蛋白此位置結(jié)合的構(gòu)象越多。

通過(guò)Auto Dock軟件計(jì)算12個(gè)生物堿化合物和蛋白COX-2的結(jié)合自由能，結(jié)果見(jiàn)表1和表2。從表中可以看出，延胡索中去氫紫堇、延胡索乙素、d-紫堇堿、四氫小蘗堿、四氫非洲防己胺、四氫巴馬汀、四氫黃連堿、四氫紫堇薩眀、異紫堇球堿、海罌粟堿、脫氫海罌粟堿、普魯托品與蛋白COX-2的最低結(jié)合自由能均低于-6.5，說(shuō)明其與蛋白結(jié)合較好。其中普魯托品的最低自由能值最小，顯示出較強(qiáng)潛在的抗炎活性。

表1 化合物1～6與蛋白COX-2的結(jié)合自由能

表2 化合物7～12與蛋白COX-2的對(duì)接自由能

3.3 化合物1～12與蛋白1S1R作用

通過(guò)Auto Dock軟件計(jì)算12個(gè)生物堿化合物和蛋白1S1R的結(jié)合自由能，結(jié)果見(jiàn)表3和4。從表中可以看出，除四氫紫堇薩眀外，延胡索中去氫紫堇、延胡索乙素、d-紫堇堿、四氫小蘗堿、四氫非洲防己胺、四氫巴馬汀、四氫黃連堿、四氫紫堇薩眀、海罌粟堿、脫氫海罌粟堿、普魯托品與蛋白1S1R的最低結(jié)合自由能均低于-6.5，說(shuō)明其與蛋白結(jié)合較好。其中四氫小蘗堿的最低自由能值最小，顯示出較強(qiáng)潛在的抗炎活性。

表3 化合物1～6與蛋白1S1R的結(jié)合自由能

表4 化合物7～12與抗炎蛋白1S1R的對(duì)接自由能

3.4 化合物1～12與蛋白1DVX作用

通過(guò)Auto Dock軟件計(jì)算12個(gè)生物堿化合物和蛋白1DVX的結(jié)合自由能，結(jié)果見(jiàn)表5和表6。從表5和表6中可以看出，延胡索中去氫紫堇、延胡索乙素、d-紫堇堿、四氫小蘗堿、四氫非洲防己胺、四氫巴馬汀、四氫黃連堿、四氫紫堇薩眀、異紫堇球堿、海罌粟堿、脫氫海罌粟堿、普魯托品與蛋白1DVX的最低結(jié)合自由能均低于-6.5，說(shuō)明其與蛋白結(jié)合較好，但弱于蛋白COX-2和1S1R。其普魯托品的最低自由能值最小，顯示出較強(qiáng)潛在的抗炎活性。

表5 化合物1～6與蛋白1DVX的結(jié)合自由能

表6 化合物7～12 與抗炎蛋白1DVX的對(duì)接自由能

4 結(jié) 論

蒙藥延胡索是蒙醫(yī)常用藥材，具有消炎鎮(zhèn)痛作用。在分子對(duì)接研究中，延胡索含中生物堿原小檗堿型生物堿四氫小蘗堿、巴馬汀、延胡索乙素、去氫紫堇堿、異紫堇球堿、四氫非洲防己胺、d-紫堇堿、四氫黃連堿，阿樸啡型生物堿海罌粟堿、脫氫海罌粟堿，原阿片型生物堿普魯托品與抗炎蛋白COX-2、1S1R、1DVX均有較高的親和力，表明延胡索中生物堿可與多個(gè)靶點(diǎn)蛋白結(jié)合，具有潛在的抗炎生物活性，但仍需要通過(guò)體內(nèi)活性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。