濾紙法在三種溫度條件下保存標(biāo)準(zhǔn)菌株應(yīng)用初探

文德學(xué)，莫梢梢，吳 健，李 瑩，王 麗，張 杰

黔西南州人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，貴州興義 562400

實(shí)驗(yàn)室質(zhì)控工作需要保存各種標(biāo)準(zhǔn)(質(zhì)控)菌株，而保證質(zhì)控菌株的穩(wěn)定是做好質(zhì)控工作的前提條件。菌種保存的方法很多，根據(jù)不同的菌株或不同的實(shí)驗(yàn)要求，可選用不同的保存方法，常見的方法有傳代培養(yǎng)保存法、液體石蠟覆蓋保存法、冷凍保存法、冷凍干燥保存法等[1]。大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌等非苛養(yǎng)菌質(zhì)控菌株生長條件要求不高，通常用斜面瓊脂培養(yǎng)基和半固體瓊脂培養(yǎng)基覆蓋液狀石蠟等方法均可很好保存[2-3]，但需要頻繁移種以保證存活率，而反復(fù)傳代又易導(dǎo)致細(xì)菌變異并造成菌種污染。在保存過程中，需使微生物的代謝處于相對靜止?fàn)顟B(tài)，以在一定的時間內(nèi)使其不發(fā)生變異又保持很好的活性。低溫、干燥和隔絕空氣是使細(xì)菌代謝能力降低的重要因素。本課題組前期曾應(yīng)用濾紙法保存標(biāo)準(zhǔn)菌株，基本滿足上述3個條件，保存效果也很好[4]。但是，溫度條件對一些基層醫(yī)院還是有一定的制約，尤其是-80 ℃醫(yī)用冰箱在基層醫(yī)院目前尚未完全普及，且菌種從-80 ℃復(fù)溫至室溫，對人員操作技術(shù)要求更高，溫差較大對菌株也會產(chǎn)生一定的影響。本實(shí)驗(yàn)室在0 ℃條件下可保存非苛養(yǎng)類標(biāo)準(zhǔn)菌株至少3年，在-20 ℃、-80 ℃條件下可較長期(至少7年)保存非苛養(yǎng)類標(biāo)準(zhǔn)菌株。這可為基層醫(yī)院微生物室在質(zhì)控工作中對標(biāo)準(zhǔn)菌株的有效保存提供依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1標(biāo)準(zhǔn)菌株 大腸埃希氏菌(ATCC25922)、銅綠假單胞菌(ATCC27853)、金黃色葡萄球菌(ATCC25923)、糞腸球菌(ATCC29212)4種標(biāo)準(zhǔn)菌株購于國家衛(wèi)生健康委員會臨檢中心。

1.1.2儀器與試劑 血平皿(安圖公司)；營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(杭州天合微生物試劑有限公司)；0 ℃、-20 ℃、-80 ℃冰箱(海爾公司)；二氧化碳培養(yǎng)箱(HF212)，全自動細(xì)菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)(PhoenixM50)；配套的革蘭陽性PMIC/ID-55(448911)、革蘭陰性NMIC/ID-4(448505)鑒定藥敏試驗(yàn)復(fù)合板。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備 (1)自封袋：根據(jù)需要購買適宜大小的自封袋。(2)無菌EP管：將市售直徑2 cm的EP管置于密閉的消毒盒內(nèi)，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min備用。(3)無菌濾紙條制備：將市售濾紙用剪刀剪成約0.5 cm × 1.0 cm 濾紙條，置于帶塞的小試管內(nèi)，經(jīng)121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min備用。(4)營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基配制：按照說明書配制成成品肉湯后，分裝于有塞小試管，每管1 mL，經(jīng)121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min后備用。

1.2.2標(biāo)準(zhǔn)菌株的保存 將標(biāo)準(zhǔn)菌株在血平皿上劃線分離培養(yǎng)18～24 h，獲取純菌落，然后用無菌眼科鑷夾取1張無菌濾紙條，根據(jù)菌落大小，粘取1到數(shù)個菌落(以粘菌面積不超過濾紙1/3，濾紙條尚未完全被水分浸濕為宜)，放入無菌EP管中，蓋緊EP管蓋。根據(jù)需要，一次可制備數(shù)10管，將1～2條無菌濾紙條裝一個EP管，貼上標(biāo)簽，標(biāo)簽上注明菌種名稱和保存日期，再置于自封袋內(nèi)，排盡袋內(nèi)空氣封嚴(yán)袋口，分別放入0 ℃、-20 ℃、-80 ℃冰箱保存。

1.2.3標(biāo)準(zhǔn)菌株的生物學(xué)性狀觀察和檢測 將上述方法保存的4種標(biāo)準(zhǔn)菌株大腸埃希菌(ATCC25922)、銅綠假單胞菌(ATCC27853)、金黃色葡萄球菌(ATCC25923)、糞腸球菌(ATCC29212)在保存了1、2、3、7年后，取出上述各種菌種的一個EP管，直接置于室溫環(huán)境平衡5～10 min，無菌操作取出相應(yīng)菌種濾紙條，放入無菌營養(yǎng)肉湯管中復(fù)融5～10 min，輕輕振搖混勻后取一環(huán)營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基轉(zhuǎn)種在血平皿上，置于35 ℃二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24 h，觀察菌株的存活情況、菌落形態(tài)特征等有無變化。用PhoenixM50全自動細(xì)菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)進(jìn)行鑒定和藥敏試驗(yàn)，比較標(biāo)準(zhǔn)菌株的基本生物學(xué)性狀和藥敏試驗(yàn)結(jié)果變化情況。

2 結(jié) 果

2.1保存于0 ℃的4種標(biāo)準(zhǔn)菌株 保存于2014年的大腸埃希菌(ATCC25922)、銅綠假單胞菌(ATCC27853)、金黃色葡萄球菌(ATCC25923)、糞腸球菌(ATCC29212)，在保存1年(2015年)、2年(2016年)、3年(2017年)時，用營養(yǎng)肉湯復(fù)融后分別移種到血平皿培養(yǎng)基上，置于35 ℃二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24 h，觀察4種標(biāo)準(zhǔn)菌株均生長良好，存活率為100%，菌落形態(tài)特征沒有明顯改變，用PhoenixM50全自動細(xì)菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)進(jìn)行鑒定和藥敏試驗(yàn)，4種菌株相應(yīng)的基本生物學(xué)性狀無改變，儀器鑒定菌種符合率為100%，藥敏試驗(yàn)結(jié)果無明顯變化。見表1、2。

表1 0 ℃保存的革蘭陰性標(biāo)準(zhǔn)菌株藥敏試驗(yàn)結(jié)果[最低抑菌濃度(MIC)法，μg/mL]

續(xù)表1 0 ℃保存的革蘭陰性標(biāo)準(zhǔn)菌株藥敏試驗(yàn)結(jié)果[最低抑菌濃度(MIC)法，μg/mL]

2.2保存于-20 ℃、-80 ℃冰箱的4種標(biāo)準(zhǔn)菌株 保存于2014年的4種標(biāo)準(zhǔn)菌株大腸埃希菌(ATCC 25922)、銅綠假單胞菌(ATCC27853)、金黃色葡萄球菌(ATCC25923)、糞腸球菌(ATCC29212)在保存1年(2015年)、2年(2016年)、3年(2017年)、7年(2021年)時用營養(yǎng)肉湯復(fù)蘇分別移種到血平皿培養(yǎng)基上，置于35 ℃二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24 h，觀察4種標(biāo)準(zhǔn)菌株均生長良好，存活率為100%，除金黃色葡萄球菌(ATCC25923)在-20 ℃、-80 ℃條件下保存到第7年(2021年)時，用接種環(huán)取菌落時出現(xiàn)輕微拉絲現(xiàn)象外，其余菌落形態(tài)特征沒有明顯改變，用PhoenixM50全自動細(xì)菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)進(jìn)行鑒定和藥敏試驗(yàn)，4種菌株相應(yīng)的基本生物學(xué)性狀無改變，儀器鑒定菌種符合率為100%，藥敏試驗(yàn)結(jié)果無明顯變化，結(jié)果見表3、4、5、6。

表2 0 ℃保存的革蘭陽性標(biāo)準(zhǔn)菌株藥敏試驗(yàn)結(jié)果(MIC法，μg/mL)

表3 大腸埃希菌(ATCC25922)-20 ℃、-80 ℃保存4個時間段藥敏試驗(yàn)結(jié)果(MIC法，μg/mL)

表4 銅綠假單胞菌(ATCC27853)-20 ℃、-80 ℃保存4個時間段藥敏試驗(yàn)結(jié)果(MIC法，μg/mL)

表5 金黃色葡萄球菌(ATCC25923)-20 ℃、-80 ℃保存4個時間段藥敏試驗(yàn)結(jié)果(MIC法，μg/mL)

表6 糞腸球菌(ATCC29212)-20 ℃、-80 ℃保存4個時間段藥敏試驗(yàn)結(jié)果(MIC法，μg/mL)

續(xù)表6 糞腸球菌(ATCC29212)-20 ℃、-80 ℃保存4個時間段藥敏試驗(yàn)結(jié)果(MIC法，μg/mL)

3 討 論

菌種保存溫度條件始終是重要的影響因素，4 ℃條件最容易獲取，試驗(yàn)證明穩(wěn)定性不好[5]，只能用于臨時性保存，不宜用于質(zhì)控菌株的長期保存。在-80 ℃條件下菌種保存的穩(wěn)定性是得到肯定的，多數(shù)研究證明可保存5～10年[6-7]。但是-80 ℃醫(yī)用冰箱在基層醫(yī)院目前尚未完全普及，且菌種從-80 ℃復(fù)溫至室溫，對人員操作技術(shù)要求要高一些，溫差較大對菌株也會產(chǎn)生一定的影響。在-20 ℃條件下，有報道濾紙片冷凍保存、滅菌牛奶保存、甘油保存可保存至少2年[8]，其他用多種方法保存多種菌種，一般保存1～5年[9-10]，根據(jù)不同菌種的特性，選擇適宜的保存方法和相應(yīng)的溫度條件，才能獲得理想的保存效果[11]。本研究用濾紙法保存的4種標(biāo)準(zhǔn)菌株大腸埃希菌(ATCC 25922)、銅綠假單胞菌(ATCC27853)、金黃色葡萄球菌(ATCC25923)、糞腸球菌(ATCC29212)，在0 ℃條件下保存3年或在-20 ℃、-80 ℃條件下保存7年，4種標(biāo)準(zhǔn)菌株均生長良好，存活率為100%，菌落形態(tài)特征沒有明顯改變，用PhoenixM50全自動細(xì)菌鑒定儀及配套鑒定藥敏試驗(yàn)復(fù)合板進(jìn)行鑒定和藥敏試驗(yàn)，菌株相應(yīng)的基本生物學(xué)性狀無改變，儀器鑒定菌種符合率為100%，藥敏試驗(yàn)無明顯變化，少部分檢測值有變化，但不排除儀器及試劑的原因。這提示該方法保存的標(biāo)準(zhǔn)菌株在 0 ℃條件下保存3年或在-20 ℃、-80 ℃條件下保存7年，菌株相應(yīng)的基本生物學(xué)性狀和藥敏試驗(yàn)結(jié)果是穩(wěn)定的。

本研究結(jié)果表明，濾紙保存法在0 ℃條件下保存非苛養(yǎng)菌標(biāo)準(zhǔn)菌株，3年內(nèi)能滿足實(shí)驗(yàn)室室內(nèi)質(zhì)控的要求，在-20 ℃、-80 ℃條件下保存非苛養(yǎng)菌標(biāo)準(zhǔn)菌株，7年內(nèi)能滿足實(shí)驗(yàn)室內(nèi)質(zhì)控的要求。基層醫(yī)院微生物實(shí)驗(yàn)室，在扎實(shí)做好菌種保存管理工作的前提下[12]，用濾紙法選擇在0 ℃、-20 ℃條件下保存非苛養(yǎng)菌標(biāo)準(zhǔn)菌株，是一個能滿足實(shí)驗(yàn)室室內(nèi)質(zhì)控要求，操作簡便，實(shí)用有效、安全的菌種保存方法。