SFRP1和β-catenin在食管癌中的作用及相關(guān)機(jī)制*

馬軍偉,王 佳,宋 煒

延安大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤科，陜西延安 716000

食管癌是常見的上消化道腫瘤之一。目前，上消化道腫瘤是我國(guó)城市人口惡性腫瘤的重要死亡原因，同時(shí)也是世界范圍內(nèi)相對(duì)常見、多發(fā)的惡性腫瘤之一，其病因與吸煙、職業(yè)、環(huán)境、電離輻射等有關(guān)[1-2]。近年來，雖然人類對(duì)食管癌的研究加深，但截至目前其發(fā)病機(jī)制尚未完全弄清。分泌型卷曲相關(guān)蛋白1(SFRP1)和β-連環(huán)蛋白(β-catenin)是機(jī)體中的相對(duì)常見的2種生物學(xué)因子，在各種疾病的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸過程中均發(fā)揮了重要作用[3]。SFRP1作為一種新發(fā)現(xiàn)的候選抑癌基因，在人類的多種腫瘤包括上消化道腫瘤中均存在表達(dá)下調(diào)或缺失的現(xiàn)象[4]，而其失活的原因則可能與上消化道腫瘤的子區(qū)高甲基化被啟動(dòng)有關(guān)。β-catenin是CTNNB1基因編碼的蛋白，可與鈣黏蛋白、α-catenin共同組成黏附連接復(fù)合體。既往研究顯示，β-catenin可作為信號(hào)分子介導(dǎo)細(xì)胞黏附和信號(hào)傳導(dǎo)[5]。一項(xiàng)Meta分析顯示，β-catenin在肝癌、腸癌、胃癌等疾病中起重要作用，與食管癌的不良預(yù)后、疾病進(jìn)展及腫瘤侵襲性均密切相關(guān)[6]。本研究選取本院腫瘤科收治的121例食管癌患者作為研究對(duì)象，探討SFRP1、β-catenin在該病中的作用及其相關(guān)機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取本院腫瘤科2014年1月至2018年1月收治的121例食管癌患者作為研究對(duì)象進(jìn)行前瞻性研究。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合中國(guó)抗癌協(xié)會(huì)食管癌專業(yè)委員會(huì)《食管癌規(guī)范化診療指南(2013版)》[7]中食管癌診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)活檢標(biāo)本滿足診斷要求；(3)知情同意并簽署知情同意書；(4)臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)食管癌合并其他惡性病變；(2)病理學(xué)檢查時(shí)有放化療、生物免疫治療史；(3)治療期間死亡、轉(zhuǎn)院、失訪。121例食管癌患者中男78例，女43例；鱗癌51例，腺癌70例；腫瘤分化程度：高分化31例，中分化62例，低分化28例；癌轉(zhuǎn)移53例，未轉(zhuǎn)移68例。根據(jù)國(guó)際抗癌聯(lián)盟(UICC)和美國(guó)癌癥聯(lián)合會(huì)(AJCC)聯(lián)合制定的標(biāo)準(zhǔn)[8]，將121例食管癌患者分成Ⅰ期28例，Ⅱ期41例，Ⅲ期37例及Ⅳ期15例。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)后執(zhí)行。

1.2儀器與試劑 儀器：細(xì)胞質(zhì)分析儀[亞德諾半導(dǎo)體技術(shù)(上海)有限公司]；全自動(dòng)免疫組化檢測(cè)儀[賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司]等。試劑：鼠抗人SFRP1(ELISA)試劑盒(上海江萊生物科技有限公司，規(guī)格：96T/49T)；鼠抗人β-catenin單克隆抗體(北京中山生物技術(shù)有限公司，型號(hào)：CAT-5H10)等。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本采集 操作者均為本院經(jīng)驗(yàn)豐富的檢驗(yàn)科醫(yī)生，對(duì)本課題不知情，也不了解A、B組受試者的基線資料，采用單盲法判斷。采集所有受試者癌組織及癌旁組織標(biāo)本，均于標(biāo)本離體后0.5 h內(nèi)取材，并分成2份：一份放置于-80 ℃低溫冰箱保存，用于DNA提?。灰环菔灠?，采用常規(guī)蘇木精-伊紅(HE)染色法染色，用于免疫組織化學(xué)法(IHC) β-catenin檢測(cè)。

1.3.2檢測(cè)步驟 分別采用甲基化特異性PCR(MSP)和免疫組織化學(xué)法(IHC)檢測(cè)癌組織及癌旁組織SFRP1、β-catenin水平。SFRP1檢測(cè)：提取癌組織及癌旁組織標(biāo)本，提取DNA，采用細(xì)胞質(zhì)分析儀檢測(cè)。β-catenin檢測(cè)：(1)癌組織及癌旁組織標(biāo)本均采用中性福爾馬林脫水固定；(2)常規(guī)石蠟包埋和水化，接著用枸櫞酸鈉緩沖液(陜西興邦藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H61022282)煮沸后孵育10 min，加一抗4 ℃孵育過夜；(3)加生物素標(biāo)記的二抗處理后再次孵育10 min，用蘇木素復(fù)染，乙醇脫水，切片，然后用二甲苯透明中性樹膠(南京森貝伽生物科技有限公司，編號(hào)：SBJ0126)封片；(4)采用全自動(dòng)免疫組化檢測(cè)儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.3SFRP1、β-catenin結(jié)果判定 SFRP1結(jié)果判定每張切片隨機(jī)選取10個(gè)高倍鏡(×40)視野，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。陰性：腫瘤陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<10%；陽(yáng)性：陽(yáng)性表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞質(zhì)有棕黃色顆粒，腫瘤陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≥10%。

1.3.4β-catenin結(jié)果判定 陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)與SFRP1的判定結(jié)果相同。陰性：染色結(jié)果無著色或單純細(xì)胞質(zhì)著色；陽(yáng)性：呈棕黃色顆粒狀，主要位于細(xì)胞膜。

2 結(jié) 果

2.1癌組織及癌旁組織SFRP1、β-catenin表達(dá)水平比較 食管癌癌組織SFRP1表達(dá)水平較癌旁組織明顯降低，β-catenin表達(dá)水平較癌旁組織明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 癌組織及癌旁組織SFRP1、β-catenin表達(dá)水平比較

2.2不同臨床病理特征食管癌患者SFRP1、β-catenin表達(dá)陽(yáng)性率比較 是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移食管癌患者SFRP1表達(dá)陽(yáng)性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，β-catenin表達(dá)陽(yáng)性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；不同病理類型、分化程度、TNM分期食管癌患者SFRP1、β-catenin表達(dá)陽(yáng)性率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 SFRP1、β-catenin表達(dá)與食管癌的臨床病理特征的關(guān)系(n)

3 討 論

既往研究證實(shí)，SFRP1在胚胎發(fā)育階段主要參與腦、血管等重要系統(tǒng)的細(xì)胞分化[9]，但當(dāng)其成體后，存在于機(jī)體的諸多組織中。作為一種重要的抑制因子，SFRP1的作用多集中在Wnt信號(hào)(配體蛋白質(zhì)Wnt和膜蛋白受體結(jié)合激發(fā))上游，有研究證實(shí)，雖然其在正常狀態(tài)下對(duì)抵抗食管癌發(fā)生和發(fā)展、促進(jìn)細(xì)胞凋亡等[10]生物過程均極有幫助，但若超過其臨界值時(shí)，則會(huì)損傷機(jī)體組織。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，食管癌患者癌組織中SFRP1的表達(dá)水平低于癌旁組織(P<0.05)，而不同病理類型、分化程度、TNM分期、是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移食管癌患者SFRP1蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)合文獻(xiàn)[10-12]及本研究結(jié)果，SFRP1在食管癌中的作用機(jī)制可能與以下幾點(diǎn)有關(guān)：(1)SFRP1參與Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)而對(duì)食管癌發(fā)生有影響。通常情況下，Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在成體組織細(xì)胞中的作用主要是協(xié)助細(xì)胞增殖，但若機(jī)體受損時(shí)，這條信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白突變，導(dǎo)致Wnt信號(hào)活化出現(xiàn)異常，繼而參與腫瘤發(fā)生。(2)SFRP1基因的第1個(gè)外顯子周圍有高密度的CpG島，其是發(fā)生甲基化的重要區(qū)域。有研究顯示，當(dāng)機(jī)體中的SFRP1基因甲基化后Wnt信號(hào)通路則會(huì)被激活，繼而導(dǎo)致本途徑中的β-catenin在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)累積、轉(zhuǎn)移或與該途徑中的某些轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合[12]。而在這種情況下，靶基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)也會(huì)隨著被刺激，繼而參與食管癌的發(fā)生、發(fā)展。(3)SFRP1可與Fra相互競(jìng)爭(zhēng)而使Wnt信號(hào)通路被抑制。有研究發(fā)現(xiàn)，SFRP1利用部分類似氨基端序列結(jié)構(gòu)與Wnt蛋白結(jié)合，進(jìn)而抑制Wnt信號(hào)通路[13]。本研究中食管癌癌組織SFRP1陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于癌旁組織，提示SFRP1表達(dá)降低會(huì)抑制Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖。

作為一種細(xì)胞質(zhì)蛋白，β-catenin主要分布于胞膜，可與E-鈣黏蛋白(E-cadherin)相結(jié)合而形成的一種E-cadherin-β-catenin復(fù)合物。這種復(fù)合物在許多細(xì)胞反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，有研究證實(shí)β-catenin變異均會(huì)引起許多人類腫瘤，如結(jié)腸癌、肺癌[14-15]。正常情況下，腫瘤抑制(APC)基因?qū)C(jī)體細(xì)胞中的β-catenin有較好的調(diào)節(jié)，促使β-catenin基因出現(xiàn)特殊片段磷酸化。然而，當(dāng)β-catenin或APC基因突變時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的β-catenin水平隨之遞增，而其部分則會(huì)從胞膜上轉(zhuǎn)移至胞核內(nèi)聚集。本研究結(jié)果顯示，β-catenin在食管癌癌組織中的表達(dá)較癌旁組織明顯升高(P<0.05)。這表明β-catenin在食管癌病變組織呈高表達(dá)[16]，而癌旁組織陽(yáng)性率較低，嚴(yán)重影響食管癌患者的預(yù)后生存率。通常情況下，β-catenin主要分為兩類，一類是游離型β-catenin，二類是結(jié)合型β-catenin。有研究證實(shí)，前者主要表達(dá)于食管癌細(xì)胞的細(xì)胞核中，是重要的靶基因，Wnt信號(hào)通路則是它與轉(zhuǎn)錄因子Tcf/Lef結(jié)合后形成的；后者的主要功能是調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附功能，但無法進(jìn)入細(xì)胞核，而這種調(diào)節(jié)功能還必須與其他細(xì)胞因子結(jié)合才可實(shí)現(xiàn)[17]。食管癌的發(fā)生則主要與游離型β-catenin相關(guān)，而導(dǎo)致這種現(xiàn)象的原因在于β-catenin降低了轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄活性，而使Wnt信號(hào)通路被激活，使信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑異常而過度調(diào)節(jié)食管癌細(xì)胞的增殖[18]。因此，推測(cè)SFRP1與β-catenin之間還存在某種聯(lián)系，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，SFRP1低表達(dá)、β-catenin高表達(dá)可能是食管癌高發(fā)的主要誘因之一，二者主要通過相同的媒介物質(zhì)Wnt信號(hào)通路導(dǎo)致食管癌的發(fā)生。SFRP1、β-catenin均在食管癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸及預(yù)后中發(fā)揮重要作用，可將其作為食管癌發(fā)生的早期腫瘤標(biāo)志物。