lncRNA DILC在精神分裂癥患者外周血單核細胞中的表達及其與炎癥因子的相關(guān)性分析*

陳秋瑩，殷海波，夏雯瑩，周 錦，舒 銘

1.上海市浦東精神衛(wèi)生中心檢驗科，上海 200123；2.上海健康醫(yī)學(xué)院周浦醫(yī)院檢驗科，上海 201318

精神分裂癥是一種高致殘率、高復(fù)發(fā)率的嚴(yán)重精神疾病，影響了全球1%的人口[1]，其核心癥狀包括陽性癥狀、陰性癥狀和認知功能障礙。研究發(fā)現(xiàn)，精神分裂癥是基因與環(huán)境共同作用的結(jié)果，但具體病理生理機制不明[2]。目前，精神分裂癥患者的診斷主要依賴于臨床精神科醫(yī)生依據(jù)患者及家屬的主訴和患者的異常行為做出經(jīng)驗性診斷，尚無客觀的診斷方法。同時，精神分裂癥患者治療也主要依賴醫(yī)生的主觀判斷及量表評估。因此，迫切需要客觀有效地診斷精神分裂癥的生物標(biāo)志物，以及提供了新的治療靶點。

長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類長度大于200 bp，不具有編碼蛋白能力的RNA[3]。研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA可通過改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)、調(diào)控表觀遺傳、調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄前和轉(zhuǎn)錄后等多種方式干擾基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)的表達[4-6]。精神分裂癥相關(guān)的全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)結(jié)果顯示，大量單核苷酸多態(tài)性(SNP)的位點位于lncRNA區(qū)域[7]；轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究也顯示，精神分裂癥患者的外周及中樞神經(jīng)均有 lncRNA 表達譜的改變[8]；上述研究說明lncRNA與精神分裂癥密切相關(guān)。有研究證明，炎癥在精神分裂癥的病理過程中起重要作用[9]，在精神分裂癥患者血液中也發(fā)現(xiàn)了免疫標(biāo)志物的變化，如C反應(yīng)蛋白(CRP)或各種白細胞介素[10]。此外，圍生期感染與晚年精神分裂癥發(fā)生有關(guān)[11]。流行病學(xué)研究表明，精神分裂癥風(fēng)險的增加與嚴(yán)重感染或自身免疫性疾病存在聯(lián)系[12]。有研究發(fā)現(xiàn)，肝癌干細胞下調(diào)lncRNA(lncRNA DILC)通過抑制白細胞介素-6(IL-6)的轉(zhuǎn)錄和STAT3的激活來抑制肝癌干細胞的擴張[13],也就是說，lncRNA DILC可以通過炎癥通路來調(diào)控肝癌的發(fā)生。目前，關(guān)于lncRNA DILC與精神分裂癥的關(guān)系的研究較少，本文探索lncRNA DILC在首次發(fā)作未經(jīng)抗精神病藥物治療的精神分裂癥患者外周血單核細胞中的表達，同時分析lncRNA DILC與炎癥因子CRP、IL-6，以及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的相關(guān)性，探索其可能的病理機制。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年1月至2020年12月在上海浦東精神衛(wèi)生中心就診的76例精神分裂癥患者作為精神分裂癥組，另選取76例體檢健康者作為對照組。精神分裂癥組納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)依據(jù)國際疾病分類第10版(ICD-10)精神分裂癥診斷標(biāo)準(zhǔn)，由2名副主任職稱及以上職稱的精神科醫(yī)生進行診斷；(2)首次發(fā)作，未曾服用過抗精神病藥物；(3)無藥物濫用史。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)其他精神疾??；(2)其他嚴(yán)重的軀體疾病，如癌癥、血液系統(tǒng)疾病等。對照組納入標(biāo)準(zhǔn)：3代之內(nèi)親屬無精神疾病患者。精神分裂癥組男44例，女32例；平均年齡(28.48±3.22)歲；平均體質(zhì)量指數(shù)(22.36±1.46)kg/m2；有吸煙史21例，無吸煙史55例。對照組男39例，女37例；平均年齡(29.61±1.82)歲；平均體質(zhì)量指數(shù)(23.01±1.27)kg/m2；有吸煙史18例，無吸煙史58例。兩組性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)及吸煙史比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有研究對象及家屬知情同意，并簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1血液標(biāo)本采集 分別采集所有受試者清晨空腹靜脈血2管，一管為肝素抗凝管，另一管為乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管，各5 mL，3 500 r/min 離心 10 min。肝素管保留上清，-80 ℃ 保存?zhèn)溆?。EDTA管用淋巴細胞分離液(P8670，北京索萊寶科技有限公司)分離單核細胞，將分離出來的單核細胞用 4 ℃預(yù)冷的 D-Hanks 緩沖液(H1045，北京索萊寶科技有限公司)沖洗 2次，離心沉淀后加入 1 mL 細胞裂解液TRIzol(WE0213A，上海聯(lián)邁生物工程有限公司)，置于冰上反復(fù)輕輕吹打細胞至混勻，-80 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2檢測方法 使用實時熒光定量PCR儀(SLAN-96p，上海創(chuàng)賽科技有限公司)檢測單核細胞中l(wèi)ncRNA DILC的表達。檢測步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行操作。用 TRIzol試劑和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(WD3126，美國 Life Technologies公司)提取總RNA，隨后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。引物均由蘇州泓迅生物科技股份有限公司設(shè)計并提供。DILC：上游引物為5′-CGCACAGAGCAAAGCCATTT-3′，下游引物為5′-GCAAGGGGCTAGAAGAAGGG-3′；內(nèi)參β-action：上游引物為5′-GGCCCAGAATGCAGTTCGCCTT-3′，下游引物為5′-AATGGCACCCTGCTCACGCA-3′。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，共40個循環(huán)。用2-ΔΔCt法計算lncRNA DILC的相對表達量。CRP測定使用QickRead比濁儀及其配套試劑(Aidian Oy奧瑞雅診斷有限公司，批號：KN75/K011)，IL-6和TNF-α使用IMMULITE 1000化學(xué)發(fā)光分析儀及其相應(yīng)試劑盒(西門子醫(yī)學(xué)診斷有限公司，批號分別為：20210506、0382)測定。

1.2.3陽性和陰性精神癥狀評定量表(PANSS)評分 采用PANSS評分判斷疾病的嚴(yán)重程度，共30個基本條目，組成3個分量表：陽性、陰性和一般精神病理量表。陽性和陰性量表每個條目均為7級評分，一般精神病理量表為16級評分，按精神病理水平遞增排列。PANSS評分越高表示癥狀越嚴(yán)重。由2名副主任醫(yī)師職稱的精神科醫(yī)生獨立做出評估，且評估結(jié)果一致。

2 結(jié) 果

2.1兩組外周血單核細胞lncRNA DILC相對表達量、炎癥因子水平及PANSS評分比較 精神分裂癥組外周血單核細胞lncRNA DILC相對表達水平,CRP、IL-6、TNF-α水平及PANSS評分明顯高于對照組(P<0.001)。見表1。

表1 兩組外周血單核細胞lncRNA DILC相對表達量、炎癥因子水平及PANSS評分比較

2.2lncRNA DILC對首發(fā)精神分裂癥患者的診斷效能分析 ROC曲線分析顯示，lncRNA DILC對首發(fā)精神分裂癥患者有較高的診斷效能，曲線下面積(AUC)為0.899(95%CI：0.839～0.960，P<0.001)，靈敏度為97.4%，特異度80.3%，cut-off值為1.41。

2.3lncRNA DILC表達水平與炎癥因子的相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)性分析顯示，首發(fā)精神分裂癥患者外周血單核細胞lncRNA DILC相對表達水平與CRP、IL-6、TNF-α及PANSS評分均呈正相關(guān)(r=0.861、0.877、0.915、0.901，均P<0.001)。見圖1。

圖1 lncRNA DILC與CRP、IL-6、TNF-α及PANSS相關(guān)性散點圖

3 討 論

目前，精神分裂癥病理生理機制尚不明確，研究者們在不斷地探索中提出了幾種假說，如神經(jīng)遞質(zhì)假說、神經(jīng)炎癥假說、易感-應(yīng)激-炎癥模型等假說，這些假說中均有炎癥的參與。其中，易感-應(yīng)激-炎癥模型假說表明精神分裂癥是神經(jīng)炎癥、激活的小膠質(zhì)細胞、多巴胺能、5-羥色胺能、去甲腎上腺素能和谷氨酸神經(jīng)遞質(zhì)相互作用的結(jié)果[14]。有研究認為，免疫系統(tǒng)、免疫過程和炎癥因子在精神分裂癥的神經(jīng)生物學(xué)中具有重要作用[15]。DERRIEN等[16]將人類的 lncRNA 表達數(shù)據(jù)進行聚類分析發(fā)現(xiàn)，約40%表達于腦部。MERCER等[17]通過原位雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)，大部分腦表達lncRNA具有神經(jīng)解剖區(qū)域、細胞類型或亞細胞特異性，說明中樞神經(jīng)系統(tǒng)正常功能的執(zhí)行與lncRNA 密切相關(guān)。精神分裂癥是一種神經(jīng)系統(tǒng)疾病，已有研究報道lncRNA與精神分裂癥的相關(guān)，如MAIT rs1894720在中國漢族偏執(zhí)型精神分裂癥患者中明顯表達，但由于具體機制不明確，限制了MAIT在臨床中的使用[18]。通過抑制人類神經(jīng)母細胞中及小鼠神經(jīng)細胞中的lncRNA HOTAIRM1表達發(fā)現(xiàn)，多巴胺神經(jīng)元的標(biāo)志物酪氨酸羥化酶(TH)及代謝物囊泡單胺轉(zhuǎn)運體(VMAT2)減少，從而說明HOTAIRM1影響了多巴胺神經(jīng)元的分化、成熟和代謝，但谷氨酸神經(jīng)遞質(zhì)沒有變化[19]。大量研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA DILC通過調(diào)控炎癥通路，如STAT3和(或)NF-κB通路參與了肝癌、膽囊癌、膀胱癌等的發(fā)生[13,20-21]。同時有研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA DILC在骨關(guān)節(jié)炎中呈低表達，并調(diào)控軟骨細胞中炎癥因子的表達[22]?？梢妉ncRNA DILC通過調(diào)控炎癥通路參與了許多疾病的發(fā)生和進程，但鮮見與精神分裂癥相關(guān)性的報道。

從本研究中可發(fā)現(xiàn)，精神分裂癥組外周血單核細胞lncRNA DILC的相對表達量明顯高于對照組(P<0.001)，精神分裂癥組炎癥因子CRP、IL-6和TNF-α與對照組相比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，這與前期國內(nèi)外的研究結(jié)果一致[23-24]。ROC曲線分析顯示，lncRNA DILC對首發(fā)精神分裂癥患者有良好的診斷效能，AUC為0.899(95%CI：0.839～0.960，P<0.001)，靈敏度為97.4%，特異度80.3%；Pearson相關(guān)分析表明，lncRNA DILC與炎癥因子CRP、IL-6、TNF-α及PANSS均呈明顯正相關(guān)(P<0.001)。

綜上所述，lncRNA DILC可作為精神分裂癥診斷的潛在生物標(biāo)志物，并且與首發(fā)精神分裂癥患者病情的嚴(yán)重程度明顯相關(guān)，其可能通過調(diào)控炎癥因子參與精神分裂癥的病理過程。然而，本研究樣本量較小，可能會影響本研究的信度，有待下一步增大樣本量驗證lncRNA DILC在精神分裂癥病理機制中的作用，為精神分裂癥的診斷和療效判斷提供可靠的生物標(biāo)志物。