液質(zhì)聯(lián)用法同時(shí)測(cè)定特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品中泛酸煙酰胺和左旋肉堿的含量

黎小蘭，蔡良平，付小蓉，潘拾朝，陳彩云，吳斯燕

（湯臣倍健股份有限公司，廣東珠海 519040）

隨著社會(huì)的發(fā)展和生活節(jié)奏的加快，人們的飲食習(xí)慣和結(jié)構(gòu)都有所改變，各類的慢性病患數(shù)量也隨之上升，一些患者在生理機(jī)能上的需求跟普通人存在一定的差異，老年人機(jī)體代謝能力的衰退引起了食欲下降、胃腸道功能下降[1]，年輕的白領(lǐng)久坐和加班加點(diǎn)工作缺乏運(yùn)動(dòng)也有引起慢性病的危險(xiǎn)。換言之，普通的食品已經(jīng)滿足不了他們的需求，所以特殊醫(yī)學(xué)配方食品便迎合了他們的需求。特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品是為了滿足進(jìn)食受限、消化吸收障礙、代謝后特定疾病人群對(duì)營(yíng)養(yǎng)素的特殊需要，經(jīng)專門加工研制而成的。其可以為正在治療、康復(fù)及機(jī)體功能維持過程中的患者提供營(yíng)養(yǎng)支持，糾正代謝失衡，增強(qiáng)治療效果，促進(jìn)康復(fù)[2-4]。特殊醫(yī)學(xué)配方食品在使用時(shí)需要遵守醫(yī)生或營(yíng)養(yǎng)師的建議和指導(dǎo)，以特定的疾病患者為使用人群，因而其在產(chǎn)品管理和配方上有一定的特殊性。該類產(chǎn)品建立在醫(yī)學(xué)和營(yíng)養(yǎng)學(xué)的基礎(chǔ)之上，需要科學(xué)的依據(jù)來(lái)證明其安全性和有效性[5-6]。

而在特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品中添加維生素等是常見的加工配制手段。水溶性維生素，如B 族維生素中的泛酸、維B1、維B2、維B6、煙酰胺，以及近年熱門的左旋肉堿，都是特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品里添加的營(yíng)養(yǎng)素。

泛酸又稱維B5、遍多酸，是一種水溶性維生素，幾乎存在于所有活細(xì)胞中[7]，參與人體中類固醇、褪黑激素、抗體和亞鐵血紅素合成的重要物質(zhì)[8]，泛酸可以加強(qiáng)皮膚的新陳代謝，對(duì)皮膚有水合功能，繼而能改善皮膚的干燥、脫屑、粗糙、止癢等癥狀[9-10]。

煙酰胺與蛋白質(zhì)的代謝及兒童智力發(fā)育關(guān)系密切[11]，并在維持皮膚和消化器官正常功能中起重要作用。

左旋肉堿又稱肉毒堿或維生素BT，是人類必需的一種營(yíng)養(yǎng)素，其主要功能是轉(zhuǎn)運(yùn)脂肪進(jìn)入線粒體，促進(jìn)脂肪酸氧化，為機(jī)體提供能量[12-13]。

而隨著新原料、新技術(shù)及市場(chǎng)需求的變化，以某一類成分總量作為標(biāo)志性功能成分的評(píng)判方法難以評(píng)估產(chǎn)品質(zhì)量，因此，對(duì)特定功能成分進(jìn)行有效測(cè)定，對(duì)特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品的質(zhì)量控制具有重要的意義。目前，檢測(cè)泛酸、煙酰胺和左旋肉堿的方法有薄層色譜法、毛細(xì)管電泳法、紫外分光光度法、液相色譜法、液相色譜質(zhì)譜法等[14]。主要通過方法學(xué)驗(yàn)證以建立一種高效、準(zhǔn)確、適用實(shí)際工作、能同時(shí)有效檢測(cè)這3 種成分的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1260 型高效液相色譜儀、API3200 型質(zhì)譜聯(lián)用儀、Agilent Eclipse XDB-phenyl 色譜柱（4.6 mm×100 mm，3.5 μm），美國(guó)安捷倫公司產(chǎn)品；EQ-500型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；PHS-3C 型pH 計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司產(chǎn)品。

甲醇（色譜純）、一級(jí)用水、甲酸（色譜純），德國(guó)CNW 科技公司提供；鹽酸（分析純）、氫氧化鈉（分析純），廣州化學(xué)試劑廠提供；煙酰胺（對(duì)照品來(lái)源：SUPELCO，批號(hào)：LC22915V，純度：99.9%）；泛酸鈣（對(duì)照品來(lái)源：中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100370-201402，純度：97.5%）；左旋肉堿（對(duì)照品來(lái)源：Dr，批號(hào)：G139676，純度：95.5%）。

特殊醫(yī)學(xué)配方粉（主要成分為蛋白質(zhì)、低聚果糖、多種維生素、DHA、EPA 等），湯臣倍健股份有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 液相色譜法儀器條件

液相條件：色譜柱Phenomenex，Kinetex，XBC18，100 mm×4.6 mm，3.5 μm；柱溫40 ℃；流動(dòng)相A：0.1%甲酸溶液，流動(dòng)相B：甲醇；梯度洗脫程序，進(jìn)樣量為5.0 或2.0 μL。

流動(dòng)相條件見表1。

表1 流動(dòng)相條件

質(zhì)譜條件：離子模式為ESI+模式；運(yùn)行時(shí)間為13 min。

1.2.2 對(duì)照品溶液制備

分別精密稱取泛酸鈣對(duì)照品24.69 mg，左旋肉堿對(duì)照品24.94 mg 于25 mL 棕色容量瓶中，煙酰胺對(duì)照品10.20 mg 于50 mL 容量瓶中，用0.1%甲酸水溶解、定容，制成泛酸鈣質(zhì)量濃度為0.962 9 mg/mL對(duì)照品溶液，左旋肉堿質(zhì)量濃度為0.952 7 mg/mL 對(duì)照品溶液，煙酰胺質(zhì)量濃度為0.203 8 mg/mL 對(duì)照品溶液，作為儲(chǔ)備液；再分別稀釋為泛酸鈣質(zhì)量濃度為0.962 9 μg/mL，左旋肉堿質(zhì)量濃度為0.952 7 μg/mL對(duì)照品溶液，煙酰胺質(zhì)量濃度為0.203 8 μg/mL 對(duì)照品溶液，作為對(duì)照品使用液，搖勻，經(jīng)0.45 μm 濾膜過濾后待進(jìn)樣。

1.2.3 供試品溶液制備

取特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品粉末約5 g，精密稱定，置燒杯中，加入濃度為0.1 mol/L 的鹽酸溶液約適量，室溫超聲處理30 min，放冷，用濃度為1 mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH 值至4.0~4.5，轉(zhuǎn)移并用水定容至50 mL 容量瓶中，搖勻后取50 mL 溶液至離心管中，以轉(zhuǎn)速8 000 r/min 離心5 min，取上清液，用水稀釋10 倍，經(jīng)0.45 μm 濾膜過濾后，即得供試品溶液。

1.2.4 測(cè)定

精密吸取對(duì)照品溶液進(jìn)樣量1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0 μL 與供試品溶液進(jìn)樣量5.0 μL 或2.0 μL，注入高效液相色譜儀，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。在1.2.1分析方法的條件下，進(jìn)行分析測(cè)定。

質(zhì)譜條件見表2。

表2 質(zhì)譜條件

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

試樣中泛酸的含量按如下公式計(jì)算：

試樣中煙酰胺/ 左旋肉堿的含量按如下公式計(jì)算：

式中：X——試樣中泛酸的含量，%；

V——試樣稀釋的體積，mL；

C——試樣溶液中泛酸鈣/煙酰胺/左旋肉堿的濃度，mg/mL；

m——試樣的質(zhì)量，g；

k——單位轉(zhuǎn)換系數(shù)，k=0.1；

0.92——泛酸鈣換成泛酸的轉(zhuǎn)換系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法空白試驗(yàn)

稱取空白樣品，按1.2.4 試樣制備方法處理空白溶液，按1.2.1 色譜條件測(cè)定空白溶液，與泛酸鈣、左旋肉堿和煙酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液的出峰時(shí)間對(duì)比。

特殊醫(yī)學(xué)配方粉中空白色譜圖（左圖） 與泛酸色譜圖（右圖） 見圖1，特殊醫(yī)學(xué)配方粉中空白色譜圖（左圖） 與煙酰胺色譜圖（右圖） 見圖2，特殊醫(yī)學(xué)配方粉中空白色譜圖（左圖） 與左旋肉堿色譜圖（右圖） 見圖3。

圖1 特殊醫(yī)學(xué)配方粉中空白色譜圖（左圖） 與泛酸色譜圖（右圖)

圖2 特殊醫(yī)學(xué)配方粉中空白色譜圖（左圖） 與煙酰胺色譜圖（右圖)

圖3 特殊醫(yī)學(xué)配方粉中空白色譜圖（左圖） 與左旋肉堿色譜圖（右圖)

空白溶液在對(duì)照品溶液的各成分出峰時(shí)間處均無(wú)吸收峰，表明空白對(duì)測(cè)定結(jié)果無(wú)干擾。

2.2 線性范圍確認(rèn)

2.2.1 試驗(yàn)數(shù)據(jù)

標(biāo)準(zhǔn)曲線見表3。

表3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2.2 線性試驗(yàn)結(jié)論

線性評(píng)價(jià)：相關(guān)性分別為0.999 9，0.999 5，0.999 9，所以用該方法測(cè)定泛酸、煙酰胺、左旋肉堿在質(zhì)量濃度為0.2~2.2 μg/mL 呈現(xiàn)良好的線性。

2.3 檢出限和定量限

分析方法的檢出限D(zhuǎn)L 和定量限QL 由信噪比（S/N） 計(jì)算。DL 定義為S/N=3 時(shí)對(duì)應(yīng)的待分析濃度，QL 定義為S/N=10 時(shí)對(duì)應(yīng)的待分析濃度。

2.3.1 檢出限

當(dāng)信噪比（S/N） 為3 時(shí)，泛酸檢出限為0.001 94 μg/mL；當(dāng)稱取量為5.0 g，定容至50 mL 時(shí)，該方法的泛酸檢出限為0.019 4 μg/g；煙酰胺檢出限為0.005 43 μg/mL；當(dāng)稱取量為5.0 g，定容至50 mL時(shí)，該方法的煙酰胺檢出限為0.054 3 μg/g；左旋肉堿檢出限為0.003 97 μg/mL；當(dāng)稱取量為5.0 g，定容至50 mL 時(shí)，該方法測(cè)定的左旋肉堿檢出限為0.039 7 μg/g。

2.3.2 定量限

當(dāng)信噪比（S/N） 為10 時(shí)，該方法的泛酸定量限為0.006 4 μg/mL；當(dāng)稱取量為5.0 g，定容至50 mL時(shí)，該方法的泛酸定量限為0.064 μg/g；煙酰胺定量限為0.018 1 μg/mL；當(dāng)稱取量為5.0 g，定容至50 mL 時(shí)，該方法的泛酸定量限為0.181 μg/g；左旋肉堿定量限為0.013 2 μg/mL；當(dāng)稱取量為5.0 g，定容至50 mL 時(shí)，該方法的泛酸定量限為0.132 μg/g。

2.4 精密度試驗(yàn)

2.4.1 試驗(yàn)方法

稱取6 份樣品，按1.2.3 試樣制備方法處理樣品，按1.2.1 色譜條件測(cè)定檢測(cè)樣品含量，計(jì)算其RSD（%）。

2.4.2 試驗(yàn)數(shù)據(jù)

精密度結(jié)果見表4。

表4 精密度結(jié)果

2.4.3 試驗(yàn)結(jié)論

6 份樣品泛酸含量的RSD 為2.8%，煙酰胺含量的RSD 為0.7%，左旋肉堿含量的RSD 為0.7%，表明該方法有較好的精密度。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

2.5.1 試驗(yàn)方法

將樣品溶液分別在室溫下放置0，30，60，120，240，640 min 后，按2.2.1 條件測(cè)定峰面積，計(jì)算其RSD（%）。

2.5.2 試驗(yàn)數(shù)據(jù)

耐用性試驗(yàn)結(jié)果見表5。

表5 耐用性試驗(yàn)結(jié)果

2.5.3 試驗(yàn)結(jié)論

樣品溶液分別在室溫下放置0，30，60，120，240，640 min 后，RSD（%） 分別為1.8%，1.8%，1.1%，表明樣品溶液在室溫下8 h 內(nèi)泛酸、煙酰胺和左旋肉堿的穩(wěn)定性良好。

2.6 回收率試驗(yàn)

2.6.1 試驗(yàn)方法

加標(biāo)：精密稱取約5.0 g 樣品9 份（已知樣品的泛酸含量1.92 mg/100 g；煙酰胺含量為4.39 mg/100 g；左旋肉堿含量為17.20 mg/100 g），分成3 組，每組3 份，各組分別精密加入泛酸加標(biāo)液（質(zhì)量濃度0.096 31 mg/mL） 1.5，2.0，2.5 mL，煙酰胺加標(biāo)液（質(zhì)量濃度為0.225 1 mg/mL） 2.0，2.5，3.0 mL，左旋肉堿加標(biāo)液（質(zhì)量濃度為0.263 8 mg/mL） 0.6，0.8，1.0 mL。按2.2.3 試樣制備方法處理樣品。

2.6.2 試驗(yàn)方法

回收率結(jié)果見表6。

表6 回收率結(jié)果

2.6.3 試驗(yàn)結(jié)論

平均回收率分別為96.48%，97.03%，95.11%；相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD） 分別為5.3%，8.2%，6.2%。

4 結(jié)論

建立了一種酸堿沉淀法沉淀蛋白質(zhì)后，經(jīng)液相-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)特殊醫(yī)學(xué)配方食品中泛酸、煙酰胺和左旋肉堿含量的方法。結(jié)果表明，通過選用優(yōu)化后的質(zhì)譜條件下，在MRM 掃描模式下，樣品中的泛酸、煙酰胺和左旋肉堿能在13 min 內(nèi)實(shí)現(xiàn)快速分離檢測(cè)，并無(wú)雜質(zhì)干擾，可實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物的針對(duì)性檢測(cè)，并通過對(duì)該方法的檢出限、空白試驗(yàn)、穩(wěn)定性試驗(yàn)、線性確認(rèn)、回收率試驗(yàn)等確認(rèn)，證明該方法能同時(shí)準(zhǔn)確快速地檢測(cè)特殊醫(yī)學(xué)配方食品中的泛酸、煙酰胺和左旋肉堿含量，具有快速、簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、靈敏等特點(diǎn)，有助于實(shí)驗(yàn)室的分析效率，確保產(chǎn)品質(zhì)量, 降低成本，為特殊醫(yī)學(xué)配方食品中泛酸、煙酰胺和左旋肉堿含量的測(cè)定提供參考。