UPLC-MS/MS 測(cè)定豆芽中16 種硝唑和喹諾酮類抗生素殘留的研究

朱小嬌，張 亮，張碧宇，項(xiàng)林敏，周建峰

（溫州市質(zhì)量技術(shù)檢測(cè)科學(xué)研究院，浙江溫州 325000）

0 引言

市場(chǎng)上部分蔬菜水果在種植、流通和銷售環(huán)節(jié)中存在比較嚴(yán)重的抗生素殘留問(wèn)題，其中在多批次豆芽類樣品抽檢中，喹諾酮類和甲硝唑類抗生素的快篩結(jié)果呈陽(yáng)性[1-11]。經(jīng)室外試驗(yàn)，恩諾沙星呈陰性豆芽在次日開始腐爛，而相對(duì)的陽(yáng)性豆芽除了根部自然風(fēng)干，在10 日后仍保持新鮮?！妒称钒踩珖?guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》和《豆芽衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》2 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)中均未規(guī)定喹諾酮類和硝唑等抗生素可以添加使用，可知該非法違規(guī)添加抗生素行為，目的在于抗菌保鮮，以牟取非法利益。

國(guó)內(nèi)外關(guān)于檢測(cè)動(dòng)物源中抗生素類藥物文獻(xiàn)的方法眾多[12-14]，檢驗(yàn)方法已經(jīng)較成熟，關(guān)于獸藥在蔬菜中的殘留檢測(cè)報(bào)道卻較少。其中，吳小蓮[8]開發(fā)的檢測(cè)過(guò)程較為復(fù)雜，試劑成本高，后期產(chǎn)生的有害有機(jī)廢液多，不適合用于批量樣品的檢測(cè)。劉暢[7]運(yùn)用QuEChERS 快速凈化測(cè)定法只限于喹諾酮類抗生素。試驗(yàn)利用UPLC-MS/MS 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜，建立一種準(zhǔn)確測(cè)定豆芽中抗生素殘留的方法，能夠?qū)Χ寡款愔械?6 種硝唑和喹諾酮類抗生素，進(jìn)行準(zhǔn)確定性和定量，可操作性強(qiáng)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙腈中11 種喹諾酮混標(biāo)（100 μg/mL），美國(guó)A ChemTek.Inc 公司提供；乙腈中5 種硝基咪唑混標(biāo)（100 μg/mL），德國(guó)Dr.Ehrenstorfer 公司提供；諾氟沙星- D5（99.7%，5 mg），上海安譜公司提供；羥甲基甲硝咪- D3（99.9%，10 mg），德國(guó)WITEGA 公司提供；無(wú)水硫酸鈉（分析純），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供；萃取鹽包（4 g 無(wú)水硫酸鎂和1.5 g無(wú)水乙酸鈉）、凈化管、乙腈、甲醇、甲酸（均為色譜純），上海安譜公司提供；乙酸銨（色譜純），美國(guó)Sigma 公司提供。

1.2 儀器和設(shè)備

Agilent1290/6470 型三重四極桿液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜，配ESI 源，美國(guó)安捷倫公司產(chǎn)品；IKA MS3 型渦旋振蕩器，德國(guó)IKA 公司產(chǎn)品；SIGMA 3K15 型冷凍離心機(jī)（轉(zhuǎn)速≥5 000 r/min），美國(guó)Sigma 公司產(chǎn)品；氮吹儀、針式濾器（0.22 μm） 有機(jī)相微孔濾膜，上海安譜公司產(chǎn)品；Research Plus 微量移液器，德國(guó)艾本德公司產(chǎn)品；Millipore 超純水處理系統(tǒng)，美國(guó)Millipore 公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

（1） 混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中間液（2 000 ng/mL）。分別準(zhǔn)確移取200 μL 混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于10 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度。

（2） 混合內(nèi)標(biāo)中間液（2 000 ng/mL）。分別準(zhǔn)確移取200 μL 內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液10 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度。

（3） 臨用時(shí)，用空白樣品前處理所得基質(zhì)溶液配制成質(zhì)量濃度為5，10，20，40，60，80，100 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（內(nèi)標(biāo)的質(zhì)量濃度為50.0 ng/mL）。

1.3.2 試樣的制備與保存

將樣品500 g，充分均質(zhì)振搖混勻，分裝至潔凈容器內(nèi)作為試樣，于-18 ℃以下保存。

1.3.3 檢測(cè)樣品制備稱取5 g（精確到0.01 g） 樣品，放入50 mL 離心管中，準(zhǔn)確加入25 μL 混合內(nèi)標(biāo)液，避光放置10 min。加入20 mL 酸化乙腈，渦旋混合3 min，再加入4 g

無(wú)水硫酸鎂和1.5 g 無(wú)水乙酸鈉，渦旋混勻，以轉(zhuǎn)速12 000 r/min 離心5 min，使兩相分層，取上層乙腈溶液，過(guò)無(wú)水硫酸鈉后收集在梨形瓶中，以40℃旋蒸近干，用乙腈定容至1.0 mL，加入凈化粉末渦旋混勻1 min，以轉(zhuǎn)速10 000 r/min 離心5 min，上清液過(guò)0.22 μm 有機(jī)相濾膜過(guò)濾后，待測(cè)定。

1.3.4 色譜條件

Zorbax Eclipse Plus C18型色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.8 μm，美國(guó)安捷倫公司產(chǎn)品），液相流速0.2 mL/min，柱溫箱溫度35 ℃，進(jìn)樣體積2 μL，流動(dòng)相A：甲醇，流動(dòng)相B：水（含0.1%甲酸和5 mmoL/L 乙酸銨）。

液相色譜流動(dòng)相梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 液相色譜流動(dòng)相梯度洗脫程序

1.3.5 質(zhì)譜條件

離子源：ESI 電離源，正離子模式，離子源溫度350 ℃，質(zhì)譜毛細(xì)管電壓4 500 V，干燥氣溫度325 ℃，干燥氣流速11 L/min，霧化器壓力45 psi，監(jiān)測(cè)模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）。

16 種硝唑和喹諾酮類抗生素的多質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表2。

表2 16 種硝唑和喹諾酮類抗生素的多質(zhì)譜參數(shù)

1.3.6 化合物MRM 離子圖

化合物MRM 離子圖見(jiàn)圖1。

圖1 化合物MRM 離子圖

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

通過(guò)Masshunter 工作站及數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)采集分析質(zhì)譜圖，內(nèi)標(biāo)定量，采用Excel 2007 進(jìn)行數(shù)據(jù)表格和圖表處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理優(yōu)化

2.1.1 萃取相物質(zhì)的選擇

試驗(yàn)以回收率作為評(píng)價(jià)參數(shù)，測(cè)試乙酸乙酯、酸化乙酸乙酯、乙腈、酸化乙腈4 種萃取試劑的提取效果，測(cè)試步驟參照上文。

在樣品加標(biāo)后，靜置1 h，以萃取回收率對(duì)4 種有機(jī)試劑的提取效果進(jìn)行比較。測(cè)試過(guò)程中，以酸化乙腈作為萃取液，提取效果優(yōu)于純乙腈相，尤其是對(duì)諾氟沙星- D5的提取效果降低得顯著；使用乙酸乙酯和酸化乙酸乙酯的萃取效果，對(duì)喹諾酮響應(yīng)抑制明顯，因此選擇酸化乙腈作為萃取試劑。測(cè)試中，為了延長(zhǎng)不穩(wěn)定化合物的穩(wěn)定性，使用乙酸將乙腈酸化。酸性萃取劑使目標(biāo)化合物變成分子狀態(tài)，免除了酸性化合物的水解效應(yīng)，在萃取過(guò)程中增加了酸性化合物及易受基質(zhì)干擾物質(zhì)的回收率。

2.1.2 萃取鹽包的選擇

由于豆芽含水量較高，蛋白含量不低，組合式的無(wú)水硫酸鎂和無(wú)水乙酸鈉相較于單獨(dú)的氯化鈉來(lái)說(shuō)，鹽析分層效果更好。而在考查不同比例的無(wú)水硫酸鎂和無(wú)水乙酸鈉組合后，參考數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)4 g 無(wú)水硫酸鎂和1.5 g 無(wú)水乙酸鈉的組合效果較好。

2.1.3 凈化過(guò)程的選擇

以固相萃取凈化方式凈化，首先考慮的是使用HLB 凈化小柱，但豆芽的物質(zhì)組成中油脂含量不高，不存在去油問(wèn)題，且在利用HLB 小柱固相萃取凈化時(shí)，需要不斷活化洗脫步驟，試劑廢液產(chǎn)生量較多、耗時(shí)長(zhǎng)，而HLB 固相小柱成本相對(duì)較高，所以排除使用固相萃取凈化法。

在通過(guò)酸化乙腈提取后，考查不同含量?jī)艋?，即無(wú)水硫酸鎂和C18組合的凈化效果，通過(guò)平行加標(biāo)試驗(yàn)比較回收率。凈化管組合分為I 類凈化管（150 mg 無(wú)水硫酸鎂+ 2.5 mg GCB + 25 mg PSA）、II類凈化管（150 mg 無(wú)水硫酸鎂+ 7.5 mg GCB + 25 mg PSA）、III 類凈化管（150 mg 無(wú)水硫酸鎂+ 30 mg GCB + 25 mg PSA）、IV 類凈化管（150 mg 無(wú)水硫酸鎂+50 mg GCB +50 mg PSA）。按上文進(jìn)行加標(biāo)制備試驗(yàn)，在樣品完成加標(biāo)后靜置，以試驗(yàn)回收率對(duì)4 種凈化管的萃取效果進(jìn)行比較。

豆芽中4 類凈化粉末的凈化平均提取回收率比較見(jiàn)如圖2。

圖2 豆芽中4 類凈化粉末的凈化平均提取回收率比較

GCB，PSA 在抗生素殘留檢測(cè)前處理方法中是效果較好的凈化吸附劑。PSA 兼具極性相互作用和較弱的陰離子交換作用，可有效從非極性樣品中除去極性物質(zhì)，如糖類干擾物、有機(jī)酸、脂肪酸、極性色素等。GCB 主要用來(lái)除去疏水性物質(zhì)，但是2 種吸附劑的使用比例不同也會(huì)一定程度上影響對(duì)目標(biāo)物的回收提取效果，依據(jù)測(cè)試數(shù)據(jù)選定以III 類凈化組合作為凈化組分。

2.1.4 定容試劑的選擇

在確定了提取凈化方式后，最后的定容液試劑比較了甲醇、酸化甲醇、乙腈、酸化乙腈的定容效果，分別對(duì)樣品進(jìn)行平行加標(biāo)試驗(yàn)，乙腈的效果較其他好，故選用乙腈。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線、回收率及精密度

配制混合標(biāo)準(zhǔn)工作使用液，以MRM 的分析模式進(jìn)行測(cè)定，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，數(shù)據(jù)顯示：目標(biāo)化合物質(zhì)量濃度含量在10~1 000 ng/mL 內(nèi)可以得到良好線性，曲線系數(shù)均高于0.99。以豆芽為樣品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，在1，2，20 μg/kg 的加標(biāo)水平下，以測(cè)試方法萃取、凈化制備樣品分析測(cè)試，計(jì)算平均線性和回收率，目標(biāo)化合物的回收率為60%~120%。

5 種硝唑和11 種喹諾酮抗生素的檢出限、線性回歸方程和加標(biāo)水平的回收率及精密度見(jiàn)表3。

表3 5 種硝唑和11 種喹諾酮抗生素的檢出限、線性回歸方程和加標(biāo)水平的回收率及精密度

2.3 實(shí)際樣品的測(cè)定

試驗(yàn)依據(jù)開發(fā)的方法對(duì)市售綠豆芽、黃豆芽等120 批次進(jìn)行抗生素殘留檢測(cè)，檢出含恩諾沙星8 批，含量為10.2~112.3 μg/kg；氧氟沙星2 批，含量為7.8 μg/kg和42.4 μg/kg；甲硝唑2 批，含量為38.0 μg/kg 和41.7 μg/kg。陽(yáng)性樣品與浙江省市場(chǎng)監(jiān)督管理局制定的《關(guān)于加強(qiáng)生豬產(chǎn)品、豆芽等重點(diǎn)食品農(nóng)產(chǎn)品排查治理工作的緊急通知》附件2 檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果一致。結(jié)果表明，該方法前處理更加簡(jiǎn)單準(zhǔn)確，陽(yáng)性檢出率與標(biāo)準(zhǔn)方法檢出率一致，適用于豆芽中16 種硝唑和喹諾酮類抗生素殘留的分析檢測(cè)。

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)豆芽中抗生素藥物殘留所使用的萃取溶劑，萃取方法及關(guān)鍵色譜參數(shù)條件進(jìn)行優(yōu)化研究，成功建立了一種快速檢測(cè)的液相串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定方法，在5~100 μg/L 范圍內(nèi)具有較好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.99，加標(biāo)水平在1，2，20 μg/kg 時(shí)，16 種抗生素的回收率在60%~120%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差系數(shù)小于15%。該方法適用于豆芽中16 種硝唑和喹諾酮類抗生素殘留的分析檢測(cè)。通過(guò)該方法能夠?qū)κ袌?chǎng)上的豆芽抗生素殘留做到有效監(jiān)測(cè)，對(duì)于整個(gè)食品行業(yè)安全也具有非常重要的價(jià)值，應(yīng)用前景廣闊。在沒(méi)有明確的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)范要求下，對(duì)行業(yè)檢測(cè)具有重要的風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)意義，同時(shí)也能更好地維護(hù)消費(fèi)者的健康權(quán)益。