肉制品中牛源性成分熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法的建立與應(yīng)用

苗麗　李志娟　王珊　張秀平　陳靜

摘 要：為了能夠快速準(zhǔn)確檢測出市場中摻假牛肉制品，采用TaqMan探針法，建立一種用于快速有效檢測牛肉制品中牛源性成分的熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）方法。選擇GenBank中牛β-actin基因的保守序列，設(shè)計并合成特異性引物及TaqMan探針，以構(gòu)建的pMD-18T-96-beef質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)品，優(yōu)化反應(yīng)條件。結(jié)果表明：重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)PCR、測序和酶切鑒定正確，建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線Ct值與模板拷貝數(shù)對數(shù)值之間呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.98，斜率為-3.345，敏感度為46.1 copies/?L。特異性實驗表明，用該方法檢測豬肉、羊肉、雞肉、鴨肉、鵝肉等非牛肉制品結(jié)果均為陰性。批內(nèi)重復(fù)實驗變異系數(shù)均小于0.98%，批間重復(fù)實驗變異系數(shù)均小于0.33%，表明該方法重復(fù)性良好。用建立的熒光定量PCR方法與SN/T 2051—2008《食品、化妝品和飼料中牛羊豬源性成分檢測方法 實時PCR法》同時對市場上40 份牛肉加工品進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，本方法檢測有3 份樣品為牛源成分陰性，與SN/T 2051—2008方法檢測結(jié)果相同?？梢?，本實驗建立的熒光定量PCR方法具有特異、敏感、快速的特點，適用于檢測市場中肉類摻假的行為。

關(guān)鍵詞：肉制品；牛源性成分；熒光定量PCR；肉類摻假

Abstract： A real-time fluorescence-based polymerase chain reaction （PCR） assay that enables rapid and accurate identification of adulterated beef products was developed using TaqMan probe for the rapid and effective detection of bovine-derived materials in meat products. A pair of specific primers and TaqMan probe was designed according to the conserved sequence of the bovine β-actin gene. PCR reaction conditions were optimized using pMD-18T-96-beef plasmid as standard. The results showed that the pMD-18T-96-beef plasmid was confirmed to be valid by PCR， sequencing and enzyme digestion and the developed standard curve produced a good linear relationship between Ct value and initial amounts of total DNA with correlation coefficient and slope of 0.98 and ?3.345， respectively. The sensitivity was 46.1 copies/?L. No cross-reactions were found in specimens containing pork， mutton， chicken， duck and goose. The intra- and inter-assay variable coefficients were less than 0.98% and 0.33%， respectively， suggesting good repeatability. A total of 40 beef product samples from the market were measured by this method and the routine real-time PCR method from the industry standard SN/T 2051—2008. Of the 40 samples， 3 were detected as positive as consistently indicated by the two assays. This real-time PCR method with strong specificity and high sensitivity could provide a useful approach for the identification of meat adulteration.

Key words： meat products； bovine-derived ingredients； fluorescence-based quantitative polymerase chain reaction； meat adulteration

中圖分類號：TS207.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-8123（2015）09-0030-04

隨著市場上牛肉價格的不斷上漲，使其價格遠(yuǎn)高于其他種屬肉制品，部分不法企業(yè)及商販在高成本的牛肉中摻入低廉的其他肉類品種，冒充牛肉進(jìn)行銷售來謀取利益，這種行為在損害消費者利益的同時，也干擾了正常市場競爭秩序的建立[1-3]，造成惡劣的社會影響[4-6]。因此，建立一種快速、準(zhǔn)確檢測肉制品中牛肉含量的方法，具有非常重要的意義。對于肉源成分的檢測，檢疫部門通常采用以線粒體單拷貝基因為基礎(chǔ)的熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）方法。自Tartaglia等[7]首先報道了PCR方法檢測飼料中的牛、羊源性成分至今，大量研究報道了應(yīng)用PCR及多重PCR技術(shù)對食品中不同肉類種屬的鑒別方法[8-14]。實時熒光PCR技術(shù)具有特異性強(qiáng)、敏感性高、操作簡便、快速高效等特點，將種屬鑒定技術(shù)發(fā)展到了一個新的高度[15-18]，而探針法熒光定量PCR由于增加了探針結(jié)合反應(yīng)，更進(jìn)一步增加了該方法的特異性，在肉類摻假檢測方面具有巨大的應(yīng)用潛能。

與線粒體相比，一些管家基因的DNA為單拷貝基因，組織間差異不大[19]，有利于進(jìn)行量化分析。因此，本研究選用牛β-actin基因組單拷貝基因種間保守片段，設(shè)計合成了一對特異性引物與TaqMan探針，構(gòu)建牛源性成分標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立了檢測肉制品中牛源性成分定量檢測方法，為肉類摻假量化研究的進(jìn)一步發(fā)展提供方法借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

生鮮牛肉、醬牛肉、肥牛卷、牛肉干、牛肉松、牛排、牛肉餡餃子、豬肉、羊肉、雞肉、鴨肉、鵝肉均購自鄭州市某超市。

組織裂解液、氯仿-異戊醇（24∶1，V/V）、3 mol/L

醋酸鈉、TE緩沖液均為自配試劑；Tris平衡酚 北京

索萊寶生物科技有限公司；Premix Ex 2×Taq?（Probe qPCR）、pMD-18-T載體、工程菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞 大連

寶生物公司；質(zhì)粒小量制備試劑盒、瓊脂糖凝膠快速回收DNA試劑盒 北京百泰生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ABI 7500實時熒光定量PCR儀 美國應(yīng)用生物系統(tǒng)（中國）公司；BioSpec-nano微量核酸蛋白儀 日本

島津公司；Z36HK高速冷凍離心機(jī) 德國Hermle公司；NTS-4000AM恒溫振蕩水槽 日本Tokyo Rikakikai

公司。

1.3 方法

1.3.1 引物和TaqMan探針

查找Genebank中公布的牛肉單拷貝β-actin基因組的特異區(qū)域進(jìn)行多序列的比對，針對其保守區(qū)域設(shè)計了牛肉的特異性引物bovine-F、bovine-R和探針bovine-P，并用FAM熒光染料基團(tuán)標(biāo)記探針的5端，非熒光淬滅基團(tuán)BHQ1標(biāo)記探針的3端，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長度為96 bp。引物（上海）及探針均由生物工程（上海）技術(shù)有限公司合成。

1.3.2 樣品DNA的提取

肉制品或生鮮樣品，取100 mg充分研磨，置于1.5 mL EP管中，加入1 mL ddH2O，混勻后置-20 ℃反復(fù)凍融2 次，5 000 r/min離心3 min，取上清300 ?L用于酚-氯仿核酸提取，最后加入50 ?L 1×TE緩沖液溶解，作為PCR模板，貯存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的構(gòu)建

按照瓊脂糖凝膠快速回收DNA試劑盒純化PCR產(chǎn)物，并將其連接到pMD-18-T載體上，轉(zhuǎn)入E.coli工程菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，并做酶切鑒定，由生物工程（上海）技術(shù)有限公司完成測序，并將其命名為pMD-18T-96-beef標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒。

1.3.4 牛源性成分熒光定量PCR檢測方法反應(yīng)條件的確定

在Premix Ex Taq?的基礎(chǔ)上，選擇20 μL的反應(yīng)體系，對引物和探針濃度進(jìn)行優(yōu)化，以最小Ct值和最高熒光增量值為判定依據(jù)，從而確定引物和探針的最佳工作濃度。

1.3.5 牛源性成分熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

利用核酸蛋白檢測儀檢測提取標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的含量，取DNA純度在1.8～2.0之間的質(zhì)粒計算其濃度和起始拷貝數(shù)，起始模板量為3.32×106 copies/?L，10倍倍比稀釋，共6 個梯度的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，繪制熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.6 牛源性成分熒光定量PCR檢測方法的評價

1.3.6.1 靈敏度

設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒梯度為3.32×106、4.76×105、3.50×104、3.47×103、5.13×102、4.16×101 copies/?L，熒光定量PCR能擴(kuò)增的最低稀釋度的拷貝數(shù)即為所建方法的靈敏度。

1.3.6.2 特異性

用建立的熒光定量PCR方法分別對豬肉、羊肉、雞肉、鴨肉、鵝肉基因組進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，評價該方法的特異性。

1.3.6.3 重復(fù)性

選取4.76×105、3.50×104、3.47×103 copies/?L稀釋度的pMD-18T-96-beef標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為模板進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，分別做3 次組內(nèi)重復(fù)和組間重復(fù)，評價該方法的重復(fù)性。

1.3.7 市售牛肉加工品的檢測

為驗證所建方法在實際樣品檢測過程中的準(zhǔn)確性，購買市售牛肉加工品（醬牛肉、肥牛卷、牛肉干、牛肉松、牛排、牛肉餡餃子等）40 份，按照1.3.2節(jié)方法提取DNA模板進(jìn)行檢測。同時用SN/T 2051—2008方法對此40 份樣品進(jìn)行檢測，比較2 種方法的符合率。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的鑒定

由圖1可知，對標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定，可擴(kuò)增到1 條約96 bp的片段，與連接前的PCR產(chǎn)物大小一致。由圖2可知，標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒酶切鑒定正確，測序結(jié)果與目的基因序列相符，表明pMD-18T-96-beef標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.2 熒光定量PCR反應(yīng)條件的確定

經(jīng)過對引物和探針濃度的摸索，確定反應(yīng)體系為：2×Premix Ex Taq?（Probe qPCR）12.5 μL，bovine-F、bovine-R終濃度為0.5 ?mol/L，bovine-P終濃度為0.025 ?mol/L，DNA模板2 μL，用雙蒸水補(bǔ)齊至20 μL。實時熒光PCR反應(yīng)條件為：95 ℃/10 s、95 ℃/ 5 s、60 ℃/ 20 s，40 個循環(huán)；35 ℃/10 s。結(jié)果判定，

Ct值<30為陽性，Ct值>40為陰性，兩者之間為可疑，重復(fù)檢驗，結(jié)果一致且呈明顯的對數(shù)增長，判定為陽性，否則為陰性。

2.3 牛源性成分熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

按優(yōu)化的反應(yīng)條件，取6 個稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒pMD-18T-96-beef作為模板進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，從而可以得出拷貝數(shù)對數(shù)值（x）與循環(huán)數(shù)（Ct）值之間的線性關(guān)系表達(dá)式：Ct=-3.345x+36.48，相關(guān)系數(shù)R2=0.98。

2.4 牛源性成分熒光定量PCR檢測方法的評價

2.4.1 牛源性成分熒光定量PCR檢測方法的靈敏度

標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒梯度為3.32×106、4.76×105、3.50×104、3.47×103、5.13×102、4.16×101 copies/?L時，用熒光定量PCR方法對不同質(zhì)粒量的模板進(jìn)行擴(kuò)增，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒在4.16×101 copies/?L模板濃度時，仍然可以檢測到牛源性成分陽性，故本檢測方法的靈敏度為4.16×101 copies/?L。

2.4.2 牛源性成分熒光定量PCR檢測方法的特異性

以不同肉種基因組為模板進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，由圖3可知，只有牛肉有熒光信號，豬肉、羊肉、雞肉、鴨肉、鵝肉均無有效擴(kuò)增，說明所建方法有很好的特異性。

2.4.3 牛源性成分熒光定量PCR檢測方法的重復(fù)性

由表2可知，4.76×105、3.50×104、3.47×103 copies/?L

標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒稀釋度3 次擴(kuò)增的變異系數(shù)均小于0.98%，由批間重復(fù)性實驗可知，3 個標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒稀釋度的變異系數(shù)均小于0.33%?？梢?，本實驗建立的熒光定量PCR檢測方法具有較高的可重復(fù)性，從而保證了樣品檢測結(jié)果的可靠性和穩(wěn)定性。

2.5 市售樣品的熒光定量PCR檢測結(jié)果

使用本研究建立的方法對40 份市售樣品中的牛源性成分進(jìn)行定量檢測，結(jié)果顯示，有2 份肥牛卷和1 份牛肉干存在檢不到熒光信號的現(xiàn)象，表明市場上確實存在假冒牛肉成分的商品。而且該結(jié)果與SN/T 2051—2008方法的檢測結(jié)果符合率達(dá)100%。說明本實驗建立的熒光定量PCR方法可以用于肉制品中牛源性成分的檢測。

3 討 論

肉類鑒別涉及畜牧業(yè)的健康發(fā)展，消費者權(quán)益的保障，進(jìn)出口貿(mào)易等諸多領(lǐng)域。對肉類鑒別方法的研究十分必要，特別是近幾年的核酸擴(kuò)增技術(shù)更給肉類鑒別提供了有利平臺。肉類鑒別的靶基因主要包括3 類：線粒體基因組DNA、細(xì)胞基因組中重復(fù)序列和單拷貝序列。物種基因的正確選擇及基因片段長度的大小是動物源性成分檢測的關(guān)鍵，本研究選擇單拷貝β-actin基因設(shè)計特異性引物和探針，是因為其組織間差異不大，在定量檢測時更能準(zhǔn)確的計算其拷貝數(shù)，對其含量進(jìn)行量化分析。因此單拷貝基因DNA序列已廣泛應(yīng)用于研究物種的遺傳分化，物種進(jìn)化食品及飼料中動物源性成分檢測的靶基因[20]。

本研究基于牛單拷貝基因組序列設(shè)計特異性引物和熒光探針，建立了肉制品中牛源性成分檢測的TaqMan熒光定量PCR方法。經(jīng)驗證，本研究建立的方法特異性良好，檢測靈敏度達(dá)到41.6 copies/?L。應(yīng)用本方法對市售40 份牛肉加工品進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)確實存在牛肉成分肉類摻假的行為，而且該結(jié)果與SN/T 2051—2008方法結(jié)果符合率達(dá)100%。本研究可以滿足日常的檢測工作需要，是防止商家摻假牟利的有效手段之一。

熒光定量PCR方法對樣品中的牛源性成分進(jìn)行了相對定量，這方便了食品檢測部門對樣品中牛源性成分的無意沾染和故意添加做出判定。該方法修補(bǔ)了行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的漏洞，是對行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的有益補(bǔ)充。應(yīng)用熒光定量PCR方法檢測食品中的牛源性成分是我國行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)發(fā)展的必然趨勢，以指導(dǎo)我國食品檢驗檢疫部門對食品的安全進(jìn)行把關(guān)。

應(yīng)用分子技術(shù)來檢測食品安全是未來發(fā)展的重要方向，肉源成分檢測歷經(jīng)了普通PCR方法、實時熒光PCR方法、以及定量PCR方法，雖然各方法還存在著一定的技術(shù)性問題，比如目前還不能通過對樣品中不同肉源性成分的DNA拷貝數(shù)比來計算出其組分的質(zhì)量比，但是隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展必將會日趨完善，在生命科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域有很大的應(yīng)用前景。

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