紅外光譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)快速檢測(cè)熊膽粉真?zhèn)渭皳絺螁?wèn)題

袁明昊，周 濤，鐘文瀟，周 強(qiáng)，雷苛露，曾大富，李建剛，郭 力*

1成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院西南特色中藥資源國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2成都晶博生物科技有限責(zé)任公司，成都 611137

熊膽粉為熊科動(dòng)物黑熊SelenaretosthibetanusCuvies經(jīng)膽囊手術(shù)引流膽汁而得的干燥品，具有清熱、平肝、明目的功效[1]，為我國(guó)四大名貴動(dòng)物藥材之一。由于熊膽粉來(lái)源特殊價(jià)格昂貴，市場(chǎng)上存在以其他動(dòng)物膽粉冒充熊膽粉進(jìn)行銷售的情況。此外，本課題組前期市場(chǎng)調(diào)研發(fā)現(xiàn)由于豬膽粉和牛膽粉產(chǎn)量可觀價(jià)格低廉，外觀性狀與熊膽粉較為相似，除作為偽品冒充熊膽粉外，還常摻入熊膽粉中出售，且與偽品相比，摻偽品的檢測(cè)難度更高。此類現(xiàn)象導(dǎo)致市售熊膽粉質(zhì)量參差不齊，嚴(yán)重影響臨床療效和消費(fèi)者權(quán)益，因此，熊膽粉的真?zhèn)舞b別及摻偽比例預(yù)測(cè)對(duì)于熊膽粉的質(zhì)量控制具有重要意義。

熊膽粉常用鑒別方法包括薄層色譜法[2]、高效液相色譜法[3]及特異性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)[4]，但此類方法存在耗時(shí)較長(zhǎng)、操作復(fù)雜、對(duì)樣本有破壞性等問(wèn)題，且在樣本量較大的情況下部分方法耗費(fèi)大量有機(jī)試劑。近紅外光譜具有分析速度快、對(duì)樣本破壞性小、無(wú)需預(yù)處理等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于中藥的真?zhèn)魏蛽絺舞b別[5]。然而由于熊膽粉具有強(qiáng)烈的吸濕性，用于近紅外光譜分析后易損失部分樣品，因此該方法應(yīng)用于膽類藥材具有一定的局限性。與近紅外光譜相比，紅外光譜法同樣具有分析快速、靈敏等特點(diǎn)，且所需樣本量極少，更適用于貴重藥材的質(zhì)量控制。目前采用紅外光譜法鑒別熊膽粉的報(bào)道較少，僅Yan等[6]對(duì)比了熊膽粉與其余3種動(dòng)物膽粉的紅外光譜，但其樣本量較少，對(duì)摻偽行為缺乏關(guān)注且未結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)對(duì)結(jié)果可視化。本研究以熊膽粉與豬膽粉、牛膽粉制備了不同比例的摻偽樣品，采集了正品、7類偽品及2類摻偽品的紅外光譜，采用基線校正、平滑、求導(dǎo)等預(yù)處理方法對(duì)所得光譜進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)合正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)和偏最小二乘回歸(PLSR)方法，探究紅外光譜用于熊膽粉真?zhèn)舞b別及摻偽比例預(yù)測(cè)的可行性，為熊膽粉及其他貴重藥材的質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器

傅里葉變換紅外光譜(PerkinElmer)；YP-2壓片機(jī)(上海山岳科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 樣品與試劑

1.2.1 正品熊膽粉

供試熊膽粉共94批，由成都晶博生物科技有限公司提供，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)龍飛副教授鑒定為中藥熊膽粉正品。樣品研碎過(guò)80目篩后置干燥器中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 偽品及摻偽品

豬膽粉、牛膽粉、羊膽粉、兔膽粉、雞膽粉、鴨膽粉和鵝膽粉各10批由實(shí)驗(yàn)室自制，新鮮膽汁過(guò)濾后50 ℃鼓風(fēng)干燥，研碎過(guò)80目篩即得。將豬膽粉和牛膽粉分別按照不同的比例(W/W)摻入10批正品熊膽粉中，共得180批摻偽熊膽粉(豬膽粉摻偽、牛膽粉摻偽各90批)，其中豬膽粉摻偽比例為7.92%～91.84%，牛膽粉摻偽比例為8.08%～94.24%。

1.2.3 試劑

光譜級(jí)溴化鉀購(gòu)于成都市科隆化學(xué)品有限公司。

1.3 壓片及樣品測(cè)定

取供試品粉末約1.0 mg，加入150 mg溴化鉀粉末，置瑪瑙研缽中研細(xì)并混合均勻，隨后置壓片模具中于壓片機(jī)上壓片2 min，取出置透射測(cè)定架并采集其紅外光譜。

以空白溴化鉀為背景，光譜采集范圍4 000～400 cm-1，分辨率4 cm-1，掃描次數(shù)為32次。

1.4 光譜預(yù)處理

采用OMNIC 9.2軟件對(duì)光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行自動(dòng)基線校正、平滑、標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量變換(SNV)及求導(dǎo)后導(dǎo)出數(shù)據(jù)為CSV格式，采用Origin 2021軟件繪制紅外圖譜，使用SIMCA 14.1軟件建立OPLS-DA模型，使用The Unscrambler X 10.4軟件建立PLSR模型。

1.5 正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)

OPLS-DA是在偏最小二乘判別(PLS-DA)基礎(chǔ)上發(fā)展的一類有監(jiān)督的學(xué)習(xí)方法，與PLS-DA相比，OPLS-DA將X變量中的系統(tǒng)變異分解為同Y變量線性相關(guān)和同Y變量正交的部分，隨著正交變異組分增加將提供更多的解釋性[7]。OPLS-DA模型的優(yōu)劣通過(guò)內(nèi)部驗(yàn)證、置換驗(yàn)證及外部驗(yàn)證進(jìn)行評(píng)價(jià)。一般情況下，內(nèi)部驗(yàn)證中模型對(duì)變量解釋度R2和預(yù)測(cè)度Q2越接近1，且R2和Q2差距不大于0.2～0.3，則模型越可靠。置換驗(yàn)證中所有樣品對(duì)應(yīng)R2和Q2計(jì)算值所組成的擬合直線在Y坐標(biāo)軸的截距應(yīng)分別小于0.3和0.05。外部驗(yàn)證中預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率越高則模型越可靠[8]。

1.6 偏最小二乘回歸(PLSR)

2 結(jié)果與分析

2.1 紅外光譜分析

8種動(dòng)物膽粉的紅外光譜圖經(jīng)自動(dòng)基線校正及平滑預(yù)處理后如圖1所示，熊膽粉的主要吸收峰位于3 430、2 925、2 860、1 650、1 550、1 200、1 050 cm-1等處，其中3 430 cm-1處寬峰為-OH和-NH基團(tuán)的伸縮振動(dòng)；2 925和2 860 cm-1處為烷烴C-H的伸縮振動(dòng)；1 650和1 550 cm-1處分別為-CO伸縮振動(dòng)以及N-H的彎曲振動(dòng)，二者為酰胺基特征吸收峰；1 200和1 050 cm-1處的雙強(qiáng)峰為-SO3H的特征吸收峰[13]。大部分偽品吸收峰波段與熊膽粉較為相似但吸收強(qiáng)度不同，其中磺酸基的吸收峰強(qiáng)度差異最為顯著。此外，僅牛膽粉和羊膽粉紅外光譜圖中1 000～900 cm-1波段表現(xiàn)出膽酸吸收峰[14]。動(dòng)物膽粉中主要化學(xué)成分為膽汁酸且以結(jié)合型膽汁酸為主，紅外光譜反映了此類化合物酰胺基和磺酸基等多種化學(xué)鍵信息，為利用紅外光譜鑒別熊膽粉真?zhèn)渭邦A(yù)測(cè)摻偽比例提供了理論依據(jù)。

圖1 熊膽粉及其偽品紅外圖譜

2.2 熊膽粉正品、偽品及摻偽品的鑒別分析

2.2.1 樣本集劃分

采用SPSS 25將正品、偽品及摻偽品按4∶1比例進(jìn)行隨機(jī)樣本集劃分，其中正品、偽品及摻偽品校正集樣本分別為75、56和144份，驗(yàn)證集樣本分別為19、14和36份。累計(jì)獲得校正集275份，驗(yàn)證集69份。

2.2.2 預(yù)處理方法選擇

在紅外光譜采集過(guò)程中，樣品制備過(guò)程及外界環(huán)境均會(huì)對(duì)光譜數(shù)據(jù)產(chǎn)生一定的影響，因此，在建立紅外模型之前需對(duì)紅外光譜進(jìn)行預(yù)處理。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)樣本的紅外光譜基線漂移嚴(yán)重，在不對(duì)其進(jìn)行基線校正的情況下觀察到明顯的組內(nèi)差異，后續(xù)無(wú)論何種預(yù)處理方法均無(wú)法改善此類情況。因此，所有原始光譜均經(jīng)自動(dòng)基線校正(Baseline)及平滑(SG-Smoothing)之后進(jìn)行后續(xù)預(yù)處理。紅外光譜常用的預(yù)處理方法包括標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量變換(SNV)、一階求導(dǎo)(1st D)和二階求導(dǎo)(2nd D)等。SNV可消除樣本顆粒分布不均勻?qū)庾V的散射影響，而求導(dǎo)可提高光譜分辨率和靈敏度[15]。不同光譜預(yù)處理方法建立的熊膽粉正品、偽品及摻偽品的OPLS-DA模型參數(shù)見(jiàn)表1。結(jié)果表明，經(jīng)SNV + 2nd D預(yù)處理后模型性能最佳，校正集和驗(yàn)證集預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率均高于95%。該模型最佳主成分個(gè)數(shù)為2，累計(jì)解釋了86.26%的總方差。

表1 不同光譜預(yù)處理方法建立的熊膽粉-摻偽品-偽品樣本判別模型性能

2.2.3 熊膽粉正品、偽品及摻偽品判別分析模型的建立與驗(yàn)證

如圖2所示，熊膽粉正品、偽品和摻偽品具有各自的空間分布，由于偽品中包含多種其他動(dòng)物膽粉，因此該分組中部分樣本分布較為離散。校正集中僅有1個(gè)豬膽粉樣本被誤判為摻偽品，驗(yàn)證集中有一個(gè)熊膽粉正品樣本和牛膽粉樣本被誤判為摻偽品。對(duì)模型進(jìn)行置換驗(yàn)證結(jié)果模型中所有樣品對(duì)應(yīng)R2和Q2計(jì)算值所組成的擬合直線在Y坐標(biāo)軸的截距分別為0.162和-0.267，表明該模型沒(méi)有過(guò)擬合。

圖2 正品、偽品和摻偽品得分圖

為驗(yàn)證模型的預(yù)測(cè)能力，使用模型外的5批熊膽粉、10批摻偽熊膽粉(不同比例摻偽豬膽粉及牛膽粉各5批)和25批偽品(豬膽粉和牛膽粉各5批，其余動(dòng)物膽粉各3批)進(jìn)行外部驗(yàn)證。將以上外部驗(yàn)證樣本代入已建立的OPLS-DA模型，模型判別準(zhǔn)確率為100%，表明該模型具有良好的預(yù)測(cè)能力，可用于鑒別熊膽粉真?zhèn)渭皳絺涡袨椤?/p>

2.2.4 偽品來(lái)源判別模型的建立與驗(yàn)證

同“2.2.1”項(xiàng)下樣本集劃分方法，所有偽品膽粉紅外光譜經(jīng)預(yù)處理后建立了OPLS-DA模型用以區(qū)分偽品膽粉來(lái)源，最佳預(yù)處理方法為SNV + 2nd D。該模型最佳主成分個(gè)數(shù)為6，R2= 0.970，Q2= 0.957，校正集和驗(yàn)證集預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率均為100%，基于前2個(gè)主成分的2D得分圖如圖3所示。置換驗(yàn)證中中所有樣品對(duì)應(yīng)R2和Q2計(jì)算值所組成的擬合直線在Y坐標(biāo)軸的截距分別為0.136和-0.384，證明該模型沒(méi)有過(guò)擬合。所有外驗(yàn)證樣本均被正確判別，表明該方法可在區(qū)分熊膽粉真?zhèn)蔚幕A(chǔ)上進(jìn)一步鑒別偽品來(lái)源。

圖3 不同偽品得分圖

2.2.5 不同類別摻偽熊膽粉判別模型的建立及驗(yàn)證

同“2.2.1”項(xiàng)下樣本集劃分方法，將所有摻偽熊膽粉樣本劃分為訓(xùn)練集與驗(yàn)證集。摻偽品類別鑒定的OPLS-DA模型最佳光譜預(yù)處理方法為SNV + 1st D，該模型最佳主成分個(gè)數(shù)為8，R2= 0.923，Q2= 0.868，校正集和預(yù)測(cè)集準(zhǔn)確率分別為100%和97.22%，其2D得分圖如圖4所示。置換驗(yàn)證中中所有樣品對(duì)應(yīng)R2和Q2計(jì)算值所組成的擬合直線在Y坐標(biāo)軸的截距分別為0.205和-0.410，表明該模型沒(méi)有過(guò)擬合。將10批未參與建模的摻偽熊膽粉樣本代入模型進(jìn)行外部驗(yàn)證，結(jié)果準(zhǔn)確率為100%。上述結(jié)果表明，紅外光譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)可鑒別熊膽粉正品、偽品及摻偽品并可進(jìn)一步區(qū)分摻偽品類別。

圖4 不同類型摻偽品的得分圖

2.3 熊膽粉摻偽比例定量分析

2.3.1 樣本集劃分

同“2.2.1”項(xiàng)下樣本集劃分方法，將2種摻偽熊膽粉樣本分別進(jìn)行樣本集劃分，各自得到72個(gè)校正集和18個(gè)驗(yàn)證集樣本。

2.3.2 預(yù)處理方法選擇

表2 不同光譜預(yù)處理對(duì)不同類別摻偽熊膽粉的定量分析模型校正和預(yù)測(cè)結(jié)果的影響

2.3.3 最佳因子數(shù)的選擇

圖5 PLSR模型中不同因子數(shù)的預(yù)測(cè)殘差平方和與驗(yàn)證集R2

2.3.4 摻偽熊膽粉定量校正模型的建立與評(píng)價(jià)

圖6 熊膽粉摻偽比例模型的預(yù)測(cè)值與實(shí)際值

2.3.5 定量校正模型的外部驗(yàn)證

選擇未參與建模的5批豬膽粉和牛膽粉樣品與熊膽粉按不同比例混合，將采集的紅外光譜輸入已建立的PLSR模型進(jìn)行外部驗(yàn)證。預(yù)測(cè)回收率為外部驗(yàn)證樣本的模型預(yù)測(cè)值與實(shí)際值之比，結(jié)果見(jiàn)表3。熊膽粉摻偽豬膽粉的模型預(yù)測(cè)值和真實(shí)值相對(duì)誤差為2.64%～9.61%，平均回收率為104.81%；熊膽粉摻偽牛膽粉的模型預(yù)測(cè)值和真實(shí)值相對(duì)誤差為2.51%～8.87%，平均回收率為100.11%。以2種摻偽樣本的模型預(yù)測(cè)值與真實(shí)值分別進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)，結(jié)果P值均大于0.05，表明模型預(yù)測(cè)值與實(shí)際值無(wú)顯著性差異，通過(guò)紅外光譜結(jié)合PLSR可實(shí)現(xiàn)對(duì)以上兩種摻偽物摻偽比例的快速預(yù)測(cè)。

表3 外部驗(yàn)證樣本預(yù)測(cè)結(jié)果

3 討論與結(jié)論

與目前動(dòng)物膽類藥材常規(guī)分析方法相比，紅外光譜法在保證結(jié)果準(zhǔn)確性的同時(shí)節(jié)省了時(shí)間與成本，以近乎無(wú)損的方式完成了對(duì)貴重藥材的質(zhì)量控制。根據(jù)目前本課題組收集樣本所建立的熊膽粉定性及定量模型，紅外光譜法展現(xiàn)出了優(yōu)異的檢測(cè)能力，但光譜模型建立在大量樣本的基礎(chǔ)上且需不斷補(bǔ)充樣本以提高模型準(zhǔn)確性及穩(wěn)定性，因此后續(xù)將進(jìn)一步增加樣本類別及數(shù)目，更為準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)熊膽粉質(zhì)量。

隨著化學(xué)計(jì)量學(xué)的發(fā)展，紅外光譜在藥材質(zhì)量控制方面具有廣泛的應(yīng)用前景，本研究為貴重藥材質(zhì)量控制提供了一個(gè)簡(jiǎn)單快捷的新方法，也為熊膽粉的質(zhì)量控制提供了參考依據(jù)。