人參皂苷Rb1對(duì)MPTP誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷和小鼠行為學(xué)異常的作用研究

耿藝娟，孫夢楨，趙進(jìn)東，宋京風(fēng)，胡煒彥*

1昆明醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院暨云南省天然藥物藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2昆明醫(yī)科大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)工程中心，昆明 650500

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是繼阿爾茲海默病(Alzheimer disease，AD)之后，影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)的第二大常見神經(jīng)退行性疾病。其主要病理學(xué)特征是多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行性死亡[1]，同時(shí)會(huì)出現(xiàn)酪氨酸羥化酶(TH)減少[2]；其主要臨床癥狀包括運(yùn)動(dòng)障礙(包括僵直，運(yùn)動(dòng)功能減退，靜止性震顫等)和非運(yùn)動(dòng)障礙(睡眠不足，記憶減退等)[3]。黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元從背側(cè)紋狀體內(nèi)的軸突末端以及中腦內(nèi)的細(xì)胞體和樹突以鈣活性依賴的方式釋放多巴胺，它們在體內(nèi)的產(chǎn)生和代謝是由不同離子通道的協(xié)調(diào)功能來調(diào)節(jié)的[4]，如鐵、鋅、銅、鈣都參與到了其中[5]。在全球大概每1 000萬60歲老年人中，就有1%的人患有此病，并且隨著全國人民生活水平的上升以及全球人口老齡化，帕金森癥的患病人數(shù)也在逐漸增加[6]。迄今為止，還沒有發(fā)現(xiàn)可以完全治療帕金森癥的方法，目前上市的治療藥物也僅僅只能改善帕金森病的癥狀卻不能完全治愈，這就使得帕金森病的治療研究成為一個(gè)亟待解決的問題[7]。

人參皂苷Rb1是人參、三七的主要活性成分[8]，人參具有安神、益智的作用[9]，三七對(duì)腦損傷具有保護(hù)作用，并且可以改善記憶[10]。人參皂苷Rb1可以改善大腦神經(jīng)細(xì)胞缺氧凋亡、修復(fù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷，具有很好的應(yīng)用開發(fā)前景[11]。有研究表明，人參皂苷Rb1通過上調(diào)MPTP小鼠模型中的谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GLT-1來改善運(yùn)動(dòng)功能障礙，預(yù)防DA神經(jīng)元死亡[12]。而本文主要探討人參皂苷Rb1是否可以通過FP1、CaMKII以及抗凋亡蛋白Bcl-2來改善MPTP誘導(dǎo)的PD模型所造成的損傷，以期為帕金森的預(yù)防和治療提供幫助。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

C57B/L6雄性小鼠、C57B/L6孕18天的雌性小鼠(SPF)，購自昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部。合格證號(hào)：(SCXK(滇)-K2020-0006)。

1.2 藥物與試劑

人參皂苷Rb1(云南植物藥業(yè)有限公司，批號(hào)20171201，純度：98.5%)；MPTP(Sigma公司，貨號(hào)M0896)；神經(jīng)元培養(yǎng)液(neurobasal medium，貨號(hào)12340817)、DMEM培養(yǎng)基(貨號(hào)11039021)、胰蛋白酶(Trypsin，貨號(hào)25200072)、磷酸鹽緩沖液(PBS，貨號(hào)10010023)、青霉素-鏈霉素(P/S，貨號(hào)15070063)、胎牛血清(fatal bovine serum，F(xiàn)BS，Invitrogen公司)；Anti-Bcl-2(Abcam公司，貨號(hào)ab194583)；Anti-CaMKII(Abcam公司，貨號(hào)ab52476)；Anti-FP1(Invitrogen公司，貨號(hào)PA5-22993)；Anti-TH(Abcam公司，貨號(hào)ab137869)；Anti-β-actin(Thermo Fisher Scientific公司，貨號(hào)MA1-91399)。

1.3 原代小鼠多巴胺能神經(jīng)元的培養(yǎng)

懷孕約18天的C57BL/6孕鼠經(jīng)過脫臼處死后取出胎鼠，斷頭處理并在無菌操作下分離出胎鼠的中腦膜側(cè)組織，剪碎，用0.125%的Trypsin在37 ℃水浴中消化15 min，用含10% FBS的DMEM終止消化，75 μm篩網(wǎng)濾過，濾液離心(1 000 r/min，5 min)，棄上清。加神經(jīng)元培養(yǎng)液混懸，離心(1 000 r/min，5 min)，棄上清。加神經(jīng)元培養(yǎng)液混懸，測細(xì)胞濃度，調(diào)整細(xì)胞濃度為5.5 × 105個(gè)/mL，接種于用0.01% PDL包被后的6孔板中。然后培養(yǎng)至第7天，給藥并通過顯微鏡觀察[13]。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組與給藥

分離出的神經(jīng)元分為對(duì)照組(試劑空白組，C)、模型組(MPTP，10 μmol/L)，給藥組人參皂苷Rb1低劑量組(L，10 μmol/L)、人參皂苷Rb1中劑量組(M，20 μmol/L)、人參皂苷Rb1高劑量組(H，40 μmol/L)預(yù)處理30分鐘后給予MPTP(10 μmol/L)24小時(shí)。C57BL/6雄性小鼠分為對(duì)照組(試劑空白組，C)、模型組(MPTP，30 mg/kg)、人參皂苷Rb1低劑量組(L，10 mg/kg)、人參皂苷Rb1中劑量組(M，20 mg/kg)、人參皂苷Rb1高劑量組(H，40 mg/kg)。MPTP通過生理鹽水溶解后對(duì)C57BL/6雄性小鼠腹腔注射持續(xù)7天，MPTP通過DMSO溶解然后對(duì)神經(jīng)元進(jìn)行藥物治療；人參皂苷Rb1通過CMC-Na混懸然后對(duì)C57BL/6雄性小鼠灌胃給藥持續(xù)14天，人參皂苷Rb1通過DMSO溶解然后對(duì)神經(jīng)元進(jìn)行損傷。

1.5 曠場實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)用的曠場是方形的觀察區(qū)，長×寬×高：50 cm × 50 cm × 40 cm，主要用來研究動(dòng)物在曠場的自主活動(dòng)從而評(píng)價(jià)其運(yùn)動(dòng)能力。實(shí)驗(yàn)在安靜的環(huán)境下進(jìn)行，將動(dòng)物放入箱內(nèi)底面中心，同時(shí)進(jìn)行攝像和計(jì)時(shí)。觀察5 min后停止攝像，75%酒精噴灑方箱內(nèi)壁及底面，以免上次動(dòng)物余留的信息(如動(dòng)物的大、小便，氣味)影響下次測試結(jié)果。酒精揮發(fā)后更換動(dòng)物，繼續(xù)實(shí)驗(yàn)。根據(jù)計(jì)算機(jī)軟件統(tǒng)計(jì)小鼠在5 min內(nèi)的運(yùn)動(dòng)距離。通過Prism進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。

1.6 爬桿實(shí)驗(yàn)

小鼠的爬桿裝置包括底座、垂直長桿約80 cm且直徑1 cm，以及圓球。用來評(píng)價(jià)小鼠的運(yùn)動(dòng)抓握能力。實(shí)驗(yàn)在安靜的環(huán)境下進(jìn)行。將小鼠從圓球處放在長桿上讓其從桿子頂端走至桿子底端，同時(shí)進(jìn)行攝像和計(jì)時(shí)。小鼠走到桿子端底時(shí)停止計(jì)時(shí)。75%酒精噴灑長桿，以免上次動(dòng)物余留的信息(如動(dòng)物的大、小便，氣味)影響下次測試結(jié)果。酒精揮發(fā)后更換動(dòng)物，繼續(xù)實(shí)驗(yàn)。根據(jù)計(jì)算機(jī)軟件統(tǒng)計(jì)小鼠從桿子頂端走至桿子底端的時(shí)間。通過Prism進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。

1.7 蛋白表達(dá)量檢測

將C57BL/6小鼠經(jīng)過斷頭處理，分離出紋狀體，加入RIPA Buffer 100 μL，冰上裂解30 min后，13 200 r/min離心，取上清液，然后通過BCA蛋白測定試劑盒對(duì)蛋白進(jìn)行定量，方法參照試劑盒說明書。定量結(jié)束后，將所有蛋白稀釋至同一濃度，然后將稀釋好的蛋白加入1× LDS Sample Buffer，95 ℃變性5 min，保持蛋白的穩(wěn)定性。蛋白樣品通過10% SDS-PAGE凝膠電泳分離并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。在室溫下用5%的牛奶封閉2 h，然后將膜與一抗(TH、CaMKII、FP1、Bcl-2)在4 ℃搖床下孵育過夜。將孵育后的膜在TBST中洗滌3次后，室溫下與熒光二抗孵育1 h。隨后，將膜用TBST再洗滌三遍，通過雙色紅外激光成像系統(tǒng)成像，使用Quantity-One定量蛋白質(zhì)水平，通過Prism進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 人參皂苷Rb1對(duì)MPTP誘導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)元的影響

與對(duì)照組相比，MPTP模型組的神經(jīng)元明顯減少，軸突斷裂，碎片多。與MPTP模型組相比，人參皂苷Rb1低、中、高劑量組都在一定程度上改善了MPTP誘導(dǎo)的神經(jīng)元的損傷(見圖1)。

圖1 人參皂苷Rb1對(duì)MPTP誘導(dǎo)的小鼠多巴胺能神經(jīng)元的影響

2.2 人參皂苷Rb1對(duì)MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠運(yùn)動(dòng)能力的影響

曠場實(shí)驗(yàn)是人們普遍認(rèn)可的用于測量動(dòng)物運(yùn)動(dòng)行為的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)。我們首先用曠場實(shí)驗(yàn)檢測了不同組別小鼠的運(yùn)動(dòng)行為。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，MPTP的小鼠模型組在曠場中的運(yùn)動(dòng)軌跡較少(見圖2A)；在曠場實(shí)驗(yàn)中小鼠的運(yùn)動(dòng)距離顯著降低(見圖2B)。與MPTP模型組相比，人參皂苷Rb1低、中、高劑量組都在一定程度上改善了MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠在曠場中的運(yùn)動(dòng)能力(見圖2A、2B)。

圖2 人參皂苷Rb1對(duì)MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠運(yùn)動(dòng)能力的影響

2.3 人參皂苷Rb1對(duì)MPTP誘導(dǎo)PD小鼠抓握能力的影響

爬桿實(shí)驗(yàn)可以檢測小鼠的抓握能力及運(yùn)動(dòng)能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，MPTP模型組的小鼠在爬桿實(shí)驗(yàn)中從桿子頂端到桿子底端的時(shí)間明顯增加。與MPTP模型組相比，在給予人參皂苷Rb1時(shí)，人參皂苷Rb1低、高劑量組都明顯降低了小鼠從桿子頂端到桿子底端的運(yùn)動(dòng)時(shí)間(見圖3)。

圖3 人參皂苷Rb1對(duì)MPTP誘導(dǎo)PD小鼠抓握能力的影響

2.4 人參皂苷Rb1對(duì)MPTP誘導(dǎo)PD小鼠相關(guān)蛋白的影響

MPTP會(huì)使鈣蛋白酶I和II激活，從而干擾正常細(xì)胞功能，導(dǎo)致細(xì)胞神經(jīng)損傷。MPTP誘導(dǎo)的PD模型小鼠中鐵水平會(huì)增加，鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(ferroportin-1，F(xiàn)P1)是一種新發(fā)現(xiàn)的鐵輸出蛋白，它的表達(dá)降低與鐵水平的增加息息相關(guān)。除此之外，MPTP處理的小鼠Bcl-2表達(dá)量會(huì)降低，Bcl-2在細(xì)胞凋亡和自噬是中起著關(guān)鍵性作用，它的失衡與帕金森病等神經(jīng)退行性疾病有關(guān)。我們的研究結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，MPTP模型組TH表達(dá)量表現(xiàn)出顯著性降低(見圖4A、4B)；CaMKII的表達(dá)量沒有顯著性差異(見圖4A、4C)；FP1的表達(dá)量表現(xiàn)出顯著性降低(見圖4A、4D)；Bcl-2的表達(dá)量顯著性降低(見圖4A、4E)。與MPTP模型組相比，人參皂苷Rb1中、高劑量組在TH的表達(dá)量中表現(xiàn)出顯著性升高(見圖4A、4B)；人參皂苷Rb1給藥組在CaMKII、FP1的表達(dá)量中沒有顯著性差異(見圖4A、4C、4D)；人參皂苷Rb1中劑量組在Bcl-2的表達(dá)量中表現(xiàn)出顯著性升高(見圖4A、4E)。

圖4 人參皂苷Rb1對(duì)MPTP誘導(dǎo)PD小鼠相關(guān)蛋白的影響

3 討論與結(jié)論

PD是世界上第二大神經(jīng)退行性疾病，危害著人們的健康。PD中的神經(jīng)化學(xué)異常是黑質(zhì)中多巴胺能神經(jīng)元的退化，導(dǎo)致紋狀體多巴胺(DA)水平降低，原代培養(yǎng)物是研究多巴胺能神經(jīng)元特性和特征的最相關(guān)模型之一。可以將這些培養(yǎng)物置于模擬PD病理學(xué)的各種應(yīng)激劑和神經(jīng)保護(hù)化合物中，以阻止或減緩神經(jīng)元退化[14]。因此我們通過體外培養(yǎng)多巴胺能神經(jīng)元并通過MPTP損傷，觀察神經(jīng)元的形態(tài)。此外PD所造成的運(yùn)動(dòng)損傷，以及TH酪氨酸陽性激酶的減少是其主要特征[15]。MPTP是一種神經(jīng)毒素，并且是迄今為止研究帕金森病的“最佳”模型[16]。因此在本研究中通過我們曠場實(shí)驗(yàn)與爬桿實(shí)驗(yàn)檢測MPTP誘導(dǎo)的PD模型所產(chǎn)生的運(yùn)動(dòng)障礙，發(fā)現(xiàn)MPTP模型組表現(xiàn)出明顯的運(yùn)動(dòng)功能損傷，此外對(duì)MPTP誘導(dǎo)的小鼠模型的紋狀體蛋白進(jìn)行檢測結(jié)果顯示MPTP模型組TH表達(dá)量表現(xiàn)出顯著性降低。

離子穩(wěn)態(tài)在帕金森病中起著關(guān)鍵性作用。其中鈣、鐵穩(wěn)態(tài)提及較多，且鈣、鐵穩(wěn)態(tài)之間也相互影響，失調(diào)的鐵或鈣水平會(huì)促進(jìn)鐵和鈣之間的有害串?dāng)_，從而導(dǎo)致神經(jīng)元功能障礙和死亡[17]。Ca2+可能是協(xié)調(diào)復(fù)雜細(xì)胞器網(wǎng)絡(luò)來最終實(shí)現(xiàn)代謝相互作用、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞維持和細(xì)胞存活調(diào)節(jié)的關(guān)鍵參與者，是細(xì)胞適應(yīng)環(huán)境的基本元素，其穩(wěn)態(tài)的破壞在MPP+毒性中起著至關(guān)重要的作用。MPTP會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+升高，導(dǎo)致Ca2+依賴性酶的激活，例如蛋白激酶和鈣蛋白酶I和II，從而干擾正常細(xì)胞功能，導(dǎo)致細(xì)胞損傷[18]。在本研究中對(duì)MPTP損傷后CaMKII的表達(dá)量進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)CaMKII的表達(dá)量沒有顯著性差異。鐵沉積是帕金森病(PD)病因?qū)W的關(guān)鍵因素之一。鐵穩(wěn)態(tài)是通過鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和鐵儲(chǔ)存蛋白之間的相互作用來維持的。鐵運(yùn)輸受損或鐵儲(chǔ)存改變可能會(huì)破壞鐵穩(wěn)態(tài)平衡。有研究表明MPTP誘導(dǎo)的PD模型小鼠中鐵水平會(huì)增加。鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(ferroportin-1，F(xiàn)P1)是一種新發(fā)現(xiàn)的鐵輸出蛋白，它在黑質(zhì)中的表達(dá)降低可以解釋鐵水平的增加[19]。在本研究中對(duì)MPTP損傷后FP1的表達(dá)量進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)FP1的表達(dá)量表現(xiàn)出顯著性降低。除此之外，Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，有研究表明MPTP處理的小鼠Bcl-2表達(dá)量會(huì)降低，細(xì)胞凋亡和自噬是維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)和促進(jìn)生存的重要細(xì)胞內(nèi)過程[20]，它們的失衡與神經(jīng)退行性疾病有關(guān)，例如PD，B細(xì)胞淋巴瘤Bcl-2家族成員參與維持自噬和凋亡之間的平衡，恢復(fù)自噬和細(xì)胞凋亡之間的平衡是治療PD的一種有前景的策略[21]。因此最后在本研究中我們還檢測了MPTP損傷后Bcl-2表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)Bcl-2的表達(dá)量顯著性降低。

人參皂苷Rb1已被證實(shí)對(duì)幾種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病具有神經(jīng)保護(hù)作用[22]。有研究通過免疫組化、免疫印跡、PCR、電生理等實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Rb1改善了PD動(dòng)物模型中的運(yùn)動(dòng)障礙，并且可以上調(diào)谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GLT-1的來終止黑質(zhì)紋狀體和皮質(zhì)酮系統(tǒng)中的谷氨酸興奮性毒性。在一篇報(bào)道中，通過MPTP誘導(dǎo)PD模型小鼠，水迷宮、曠場實(shí)驗(yàn)、電生理、免疫印跡、免疫熒光等方面檢測了人參皂苷Rb1通過調(diào)節(jié)α-突觸核蛋白/PSD-95途徑阻止MPTP誘導(dǎo)的海馬記憶變化[12]。而我們的研究主要針對(duì)MPTP誘導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)元損傷及PD小鼠模型來探討人參皂苷Rb1對(duì)行為異常的改善作用及與抗凋亡蛋白Bcl-2之間的聯(lián)系。

我們的結(jié)果顯示人參皂苷Rb1可以恢復(fù)MPTP所造成的運(yùn)動(dòng)損傷，可以顯著改善MPTP所造成的TH酪氨酸陽性激酶的減少，這為帕金森的進(jìn)一步治療以及中藥材活性成分的開發(fā)和使用提供了相關(guān)的方法。我們的研究還表明人參皂苷Rb1在抗凋亡蛋白Bcl-2方面表現(xiàn)出顯著性差異；人參皂苷Rb1雖然沒有對(duì)FP1以及CaMKII的表達(dá)量表現(xiàn)出顯著性差異，但MPTP確實(shí)造成了FP1表達(dá)量的減少，這可以為相關(guān)的研究提供一些想法，除此之外，人參皂苷Rb1在除了抗凋亡蛋白之外的其他機(jī)制還有待研究。