地枇杷的化學(xué)成分及抗氧化活性研究

何芷蕓，石松云，魏雪嬌，劉呈雄，陳劍鋒，鄒 坤，程 凡

三峽大學(xué)生物與制藥學(xué)院 天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，宜昌 443002

地枇杷藥材系?？崎艑僦参锏毓鸉icustikouaBur.的干燥地上部分[4]，其植物名又稱地瓜藤、地石榴等，且因其匍匐木質(zhì)藤本，莖貼地生長又稱之為地板藤，全株有白色乳液。在我國廣泛分布于湖北、云南、貴州、廣西、四川、西藏等地[1]，地枇杷是彝族、壯族、苗族、哈尼族等少數(shù)民族廣泛使用的民族藥，在貴州作為苗族習(xí)用藥材，在云南則為彝族、哈尼族等少數(shù)民族的常用藥，有著悠久的藥用歷史，是獨(dú)具特色的地方中草藥。該藥材最初記錄于明初蘭茂所著的《滇南本草》(1977年)[2]，《全國中草藥匯編》記載其功能主治為清熱、利濕、活血、解毒[3]。在本課題組參與編撰的2018版《湖北省中藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》[4]中，詳細(xì)記載了地枇杷性狀及鑒別方法，同時(shí)也記載了其清熱解毒、清肺止咳、潤燥止瀉的功能。

根據(jù)國內(nèi)外文獻(xiàn)記載，地枇杷化學(xué)成分主要有黃酮、甾體、香豆素、三萜類等成分[5]，對(duì)于該藥材的現(xiàn)代藥理學(xué)研究較少，主要集中在抑菌、對(duì)酪氨酸酶活性的影響，此外，Yang等[6]采用DPPH法對(duì)地枇杷提取物及不同溶劑萃取部位進(jìn)行了抗氧化活性測(cè)定，發(fā)現(xiàn)其乙酸乙酯萃取部位及正丁醇萃取部位均具有良好的DPPH自由基清除能力，本課題在此基礎(chǔ)上，綜合DPPH自由基清除能力、總抗氧化能力測(cè)定，超氧陰離子清除能力這三種抗氧化活性評(píng)價(jià)方法，對(duì)從該藥材中分離得到的化合物進(jìn)行抗氧化活性評(píng)價(jià)，期望為天然抗氧化劑的開發(fā)提供一定參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

BrukerAV400型核磁共振波譜儀(瑞士布魯克公司)；Dionex Ultimate 3000型高效液相色譜儀(美國戴安公司)；Waters UPLC-MS(QDa)超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國Waters公司)；Venusil XBP C18色譜柱(半制備型：250 mm×10 mm，10 μm；分析型：250 mm×4.6 mm，5 μm，天津博納艾杰爾科技有限公司)；Waters 1525 EF高效液相色譜儀(美國Waters公司)；低溫冷凍干燥機(jī)(美國Labconco公司)；TECAN infinite F200PRO酶標(biāo)儀(瑞士帝肯公司)；Smart-S15UVF超純水儀(上海和泰儀器有限公司)；UV-1000型紫外可見分光光度計(jì)(上海翱藝儀器有限公司)；電子天平(上海民橋精密儀器有限公司)；AB-8大孔吸附樹脂(東鴻化工有限公司)；正相色譜硅膠(煙臺(tái)化學(xué)工業(yè)研究所)；反相色譜硅膠(日本YMC公司)；DPPH(上海源葉生物科技有限公司)；T-AOC試劑盒(南京建成生物工程研究所)；抗壞血酸(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；鄰苯三酚(上海麥克林生化科技有限公司)；PBS(上海麥克林生化科技有限公司)；高效液相用乙腈、甲醇均為色譜純(美國Tedia公司)；水為超純水；其他試劑均為分析純(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

1.2 植物材料

植物材料于2020年8月采自湖北省宜昌市長陽土家族自治縣，經(jīng)三峽大學(xué)生物與制藥學(xué)院王玉兵教授鑒定為?？崎艑僦参锏毓鸉icustikouaBur.。植物標(biāo)本現(xiàn)保存于天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(三峽大學(xué))。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 提取分離

將地果地上部分經(jīng)干燥處理后進(jìn)行粉碎(7.46 kg)，95%乙醇回流提取3次(3×70 L)，提取時(shí)間分別為4、3、2 h。將得到的乙醇提取液減壓濃縮并干燥至無醇味，得到地枇杷醇提總浸膏812 g。向總浸膏中加入適量的純水均勻混懸后，依次使用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇溶劑進(jìn)行萃取，萃取三次合并萃取液，將萃取液減壓濃縮，分別得到石油醚萃取部位(127.5 g)，乙酸乙酯萃取部位(31.9 g)，正丁醇萃取部位(102 g)。

取正丁醇部位80 g，用純水溶解，少量不溶于水的樣品干燥研磨后混懸于水中，使用AB-8型大孔樹脂進(jìn)行分離，依次用純水、30%乙醇水(體積百分?jǐn)?shù)，下同)，60%乙醇水，90%乙醇水，100%乙醇洗脫，將洗脫液減壓濃縮并干燥得到30%洗脫部位(17.1 g)，60%洗脫部位(14.6 g)，90%洗脫部位(10.3 g)。使用反向硅膠柱色譜分離30%乙醇水部位，乙腈-水梯度洗脫，經(jīng)分析型高效液相色譜分析，得到27個(gè)組分Fr.1～27(12.5 g)。Fr.11經(jīng)半制備型HPLC純化(乙腈-水30%～50%)得到化合物6(5.5 mg，tR= 33.7 min)、7(4.9 mg，tR= 36.1 min)、8(12.9 mg，tR= 40.0 min)、9(2.3 mg，tR= 46.8 min)；Fr.14經(jīng)半制備型HPLC純化(乙腈-水23∶77)(體積比，下同)得到化合物3(10.4 mg，tR= 23.3 min)。

取乙酸乙酯部位29 g，1∶1正相硅膠拌樣，使用正相硅膠填料Flash柱干法上樣對(duì)乙酸乙酯部位樣品進(jìn)行快速分離洗脫，對(duì)洗脫液進(jìn)行濃縮并使用高效液相色譜分析合并得到Fr.A1～Fr.A3。Fr.A1經(jīng)200～300目正相硅膠柱層析分離得到Fr.A1a～Fr.A1c。Fr.A1a經(jīng)半制備型HPLC分離(乙腈-水55∶45)得到化合物4(2.7 mg，tR= 10.6 min)、5(3.5 mg，tR= 13.1 min)、1(2.5 mg，tR= 22.2 min)；Fr.A1b經(jīng)半制備型HPLC分離(乙腈-水30∶70)得到化合物13(25.7 mg，tR= 12.3 min)、14(7.9 mg，tR= 14.6 min)。Fr.A2經(jīng)200～300目正相硅膠柱層析分離Fr.A2a～Fr.A2d，F(xiàn)r.A2a經(jīng)半制備型HPLC分離(乙腈-水44∶56)得到化合物15(12.4 mg，tR= 17.3 min)、10(2.8 mg，tR= 17.0 min)；Fr.A2b經(jīng)半制備型HPLC分離(乙腈-水44∶56)得到化合物11(8.5 mg，tR= 25.9 min)、12(7.1 mg，tR= 30.9 min)；Fr.A2c經(jīng)半制備型HPLC分離(乙腈-水43∶57)得到化合物16(5.8mg，tR= 17.8 min)、17(3.4 mg，tR= 24.5 min)；Fr.A2d經(jīng)半制備型HPLC分離(乙腈-水41∶59)得到化合物2(2.8 mg，tR= 7.5 min)。

1.3.2 抗氧化活性測(cè)定

1.3.2.1 DPPH清除能力測(cè)定

實(shí)驗(yàn)方法在參考Ji等[7]方法的基礎(chǔ)上稍作修改：稱取一定質(zhì)量DPPH粉末，加無水乙醇配置得到400 μmol/L DPPH工作液待用。取100 μL濃度為60 μmol/L的供試液分別與100 μL的DPPH溶液充分混勻，室溫下避光反應(yīng)30 min，使用酶標(biāo)儀在517 nm波長下測(cè)量其吸光度A1，與此同時(shí)，測(cè)定100 μL濃度為60 μmol/L的供試液和100 μL無水乙醇混合溶液吸光度A2，100 μL無水乙醇和100 μL DPPH工作液吸光度A0，根據(jù)以下公式計(jì)算DPPH自由基清除率，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定三次。

1.3.2.2 總抗氧化能力測(cè)定

按照總抗氧化能力測(cè)定試劑盒說明書分別配置不同測(cè)定管溶液和對(duì)照管溶液：1、測(cè)定管：3.5 mL工作液和0.2 mL待測(cè)液混合，使用旋渦混勻器充分混勻，37 ℃水浴30 min，然后加入0.1 mL顯色劑混勻，室溫下放置10 min，波長520 nm，超純水調(diào)零，測(cè)定吸光度值；2、對(duì)照管：將3.5 mL工作液使用旋渦混勻器充分混勻，37 ℃水浴30 min，然后加入0.2 mL待測(cè)液和0.1 mL顯色劑混勻，室溫下放置10 min，波長520 nm，超純水調(diào)零，測(cè)定吸光度值，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定三次。

單位定義：在37 ℃時(shí)，每分鐘每毫摩爾化合物，使反應(yīng)體系的吸光度值，每增加0.01時(shí)，為一個(gè)總抗氧化能力單位(U)。

式中，總抗氧化能力單位為U/mmol；V反總：反應(yīng)液總體積，mL；V樣：取樣量，mL；C樣：樣品初始濃度，mmol/L；30：反應(yīng)時(shí)間為30 min。

1.3.2.3 超氧陰離子自由基清除能力

將0.1 mL初始濃度為500 μmol/L的待測(cè)溶液與2.8 mL PBS緩沖液(pH = 7.8)加入比色皿中，隨后加入0.1 mL鄰苯三酚(10 mmol/L)，快速混勻，在319 nm下測(cè)定其吸光度值，每隔30 s測(cè)定一次，一共測(cè)定300 s。30 s的吸光度值為A30，300 s的吸光度值為A300，ΔA樣=A300-A30。對(duì)照組以0.1 mL PBS緩沖液代替待測(cè)溶液，ΔA0=A300-A30，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定三次。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理

采用Graphpad Prism數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行one-way ANOVA顯著性分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表示為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，當(dāng)P<0.05時(shí)，表示組間差異顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1淡黃色針狀結(jié)晶；ESI-MS：m/z337 [M+H]+，分子式為C20H16O5。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：13.15(1H，s，5-OH)，7.82(1H，s，H-3)，7.40(2H，d，J=8.6 Hz，H-2′，H-6′)，6.90(2H，d，J=8.7 Hz，H-3′，H-5′)，6.72(1H，d，J=10.1 Hz，H-4′′)，6.33(1H，s，H-8)，5.62(1H，d，J=10.0 Hz，H-3")，1.47(6H，s，2"-CH3×2)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：152.7(C-2)，123.6(C-3)，181.0(C-4)，157.0(C-5)，105.4(C-6)，159.7(C-7)，95.0(C-8)，157.4(C-9)，106.2(C-10)，156.1(C-4′)，123.3(C-1′)，130.1(C-2′，C-6′)，115.7(C-3′，C-5′)，78.2(C-2")，128.4(C-3")，115.6(C-4")，28.4(2"-CH3×2)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[8]報(bào)道一致，故鑒定該化合物為高山金蓮花素。

化合物2褐色粉末；ESI-MS：m/z291 [M+H]+，分子式為C15H14O6。1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：6.71(1H，d，J=2.1 Hz，H-6′)，6.67(1H，d，J=8.1 Hz，H-3′)，6.58(1H，dd，J=8.2，2.1 Hz，H-2′)，5.87(1H，d，J=2.3 Hz，H-8)，5.69(1H，d，J=2.3 Hz，H-6)，4.47(1H，d，J=7.4 Hz，H-2)，3.82(2H，m，H-3)，2.63(1H，dd，J=16.1，5.4 Hz，H-4b)，2.33(1H，dd，J=16.0，8.0 Hz，H-4a)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：81.2(C-2)，66.5(C-3)，28.0(C-4)，156.4(C-5)，95.4(C-6)，156.6(C-7)，94.4(C-8)，155.6(C-9)，99.3(C-10)，130.8(C-1′)，118.7(C-2′)，115.3(C-3′)，145.1(C-4′，C-5′)，114.7(C-6′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[9]，故鑒定該化合物為(+)-兒茶素。

化合物3無色片狀結(jié)晶；ESI-MS：m/z409 [M+H]+，分子式為C20H24O9。1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ：7.86(1H，d，J=9.5 Hz，H-4)，7.40(1H，s，H-5)，6.71(1H，s，H-8)，6.20(1H，d，J=9.5 Hz，H-3)，4.88(1H，overlap，H-2′)，4.59(1H，overlap，H-1′′)，3.50(1H，dd，J=16.0，6.8 Hz，H-3′)，3.42(1H，d，J=2.3 Hz，H-6b′′)，3.35(1H，d，J=2.3 Hz，H-6a′′)，3.26(1H，dd，J=18.3，9.1 Hz，H-3′′)，3.23(1H，m，H-4′′)，3.04(1H，m，H-5′′)，3.00(1H，dd，J=9.2，2.3 Hz，H-2′′)，1.36(6H，s，H-4′，H-5′)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：165.2(C-2)，112.2(C-3)，144.5(C-4)，125.1(C-5)，127.7(C-6)，163.8(C-7)，98.1(C-8)，146.3(C-9)，114.1(C-10)，30.5(C-1′)，91.9(C-2′)，79.2(C-3′)，22.4(C-4′)，23.8(C-5′)，98.9(C-1′′)，77.5(C-2′′)，78.1(C-3′′)，71.4(C-4′′)，75.2(C-5′′)，62.2(C-6′′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]報(bào)道一致，故鑒定該化合物為異紫花前胡苷。

化合物4白色針狀結(jié)晶；ESI-MS：m/z187 [M+H]+，分子式為C11H6O3。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：7.81(1H，d，J=9.5 Hz，H-4)，7.70(1H，d，J=2.3 Hz，H-2′)，7.69(1H，s，H-8)，7.48(1H，d，J=0.9 Hz，H-5)，6.83(1H，dd，J=2.3，1.0 Hz，H-3′)，6.38(1H，d，J=9.5 Hz，H-3)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：161.2(C-2)，114.8(C-3)，144.2(C-4)，120.0(C-5)，125.0(C-6)，156.6(C-7)，100.1(C-8)，152.2(C-9)，115.6(C-10)，147.1(C-2′)，106.5(C-3′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]報(bào)道一致，故鑒定該化合物為補(bǔ)骨脂素。

化合物5白色晶體；ESI-MS：m/z217 [M+H]+，分子式為C12H8O4。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：8.16(1H，dd，J=9.8，0.9 Hz，H-4)，7.59(1H，d，J=2.4 Hz，H-2′)，7.13(1H，s，H-8)，7.02(1H，dd，J=2.4，1.0 Hz，H-3′)，6.27(1H，d，J=9.8 Hz，H-3)，4.26(3H，s，5-OCH3)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：161.4(C-2)，112.7(C-3)，139.4(C-4)，149.7(C-5)，60.2(5-OCH3)112.8(C-6)，158.5(C-7)，94.0(C-8)，152.8(C-9)，106.5(C-10)，144.9(C-2′)，105.2(C-3′)，。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]報(bào)道一致，故鑒定該化合物為佛手柑內(nèi)酯。

化合物6白色粉末；ESI-MS：m/z583 [M+H]+，分子式為C28H38O13。1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：6.55(1H，s，H-8)，6.29(2H，s，H-2′，H-6′)，4.19(1H，d，J=5.8 Hz，H-4)，4.08(1H，d，J=7.7 Hz，H-1′′)，3.76(3H，s，7-OCH3)，3.63(6H，s，3′-OCH3，5′-OCH3)，3.28(3H，s，5-OCH3)，2.99～3.69(6H，m，H-2′′，3′′，4′′，5′′，6′′)，3.12(1H，t，J=8.4 Hz，H-1a)，2.60(1H，dd，J=15.2，4.4 Hz，H-1b)，2.01(1H，m，H-3)，1.50(1H，m，H-2)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：32.30(C-1)，37.7(C-2)，64.3(C-2a)，70.1(C-3a)，44.4(C-3)，40.7(C-4)，148.0(C-5)，59.0(5-OCH3)，137.3(C-6)，146.4(C-7)，55.7(7-OCH3)，107.2(C-8)，128.6(C-9)，124.8(C-10)，137.6(C-1′)，106.0(C-2′，C-6′)，147.6(C-3′，C-5′)，56.1(3′-OCH3，5′-OCH3)，133.6(C-4′)，103.1(C-1′′)，73.5(C-2′′)，76.8(C-3′′，C-5′′)，70.6(C-4′′)，61.3(C-6′′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]報(bào)道一致，故鑒定該化合物為(+)-南燭木樹脂酚-3α-O-β-D-葡萄糖苷。

化合物7白色無定形粉末；ESI-MS：m/z553 [M+H]+，分子式為C27H36O12。1H NMR (400 MHz，DMSO-d6)δ：6.54(1H，s，H-8)，6.33(2H，s，H-2′，H-6′)，4.29(1H，d，J=5.8 Hz，H-4)，4.16(1H，d，J=7.7 Hz，H-1′′)，3.76(3H，s，7-OCH3)，3.63(6H，s，3′-OCH3，5′-OCH3)，3.27(3H，s，5-OCH3)，2.99～3.69(4H，m，H-2′′，3′′，4′′，5′′)，3.03(1H，t，J=8.4 Hz，H-1a)，2.63(1H，dd，J=15.2，4.4Hz，H-1b)，1.96(1H，m，H-3)，1.51(1H，m，H-2)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：32.4(C-1)，38.1(C-2)，61.2(C-2a)，44.4(C-3)，64.0(C-3a)，40.7(C-4)，146.9(C-5)，58.0(5-OCH3)，137.3(C-6)，146.5(C-7)，55.7(7-OCH3)，106.8(C-8)，128.5(C-9)，124.9(C-10)，137.5(C-1′)，106.0(C-2′，C-6′)，147.5(C-3′，C-5′)，56.1(3′-OCH3，5′-OCH3)，133.3(C-4′)，103.4(C-1′′)，73.6(C-2′′)，77.0(C-3′′，C-5′′)，70.1(C-4′′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]報(bào)道一致，故鑒定該化合物為(+)-南燭木樹脂酚-3α-O-β-D-吡喃木糖苷。

化合物8白色粉末；ESI-MS：m/z523 [M+H]+，分子式為C26H34O11。1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：6.80(1H，d，J=1.9 Hz，H-2)，6.68(1H，d，J=8.0 Hz，H-5)，6.60(1H，s，H-2′)，6.48(1H，dd，J=8.0，1.9 Hz，H-6)，6.07(1H，s，H-5′)，4.03(1H，d，J=10.7 Hz，H-7)，3.94(1H，d，J=7.6 Hz，H-1′′)，3.91(1H，dd，J=10.0，2.6 Hz，H-9′a)，3.72(3H，s，3-OCH3)，3.70(3H，s，3′-OCH3)，3.64(1H，d，J=2.0 Hz，H-9a)，3.60(1H，dd，J=10.6，3.4 Hz，H-9′b)，3.41～3.49(2H，m，H-6′′)，3.11～3.18(1H，m，H-9b)，2.95～3.05(4H，m，H-2′′～5′′)，2.71(2H，d，J=7.9 Hz，H-7′)，1.90(1H，m，H-8′)，1.71(1H，m，H-8)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：137.0(C-1)，113.9(C-2)，147.2(C-3)，55.6(3-OCH3)，144.1(C-4)，115.5(C-5)，121.2(C-6)，45.6(C-7)，44.2(C-8)，67.7(C-9)，127.1(C-1′)，111.8(C-2′)，145.5(C-3′)，55.5(3′-OCH3)，144.5(C-4′)，116.3(C-5′)，132.8(C-6′)，32.6(C-7′)，37.53(C-8′)，62.8(C-9′)，104.2(C-1′′)，73.6(C-2′′)，76.7(C-3′′)，70.1(C-4′′)，76.9(C-5′′)，61.1(C-6′′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]報(bào)道一致，故鑒定該化合物為異落葉松脂素-9-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。

化合物9白色粉末；ESI-MS：m/z555 [M+H]+，分子式為C27H38O12。1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：6.33(2H，s，H-2′，H-6′)，6.32(2H，s，H-2，H-6)，4.10(4H，d，J=7.8 Hz，H-9′，H-9)，3.67(6H，s，OCH3×2)，3.66(6H，s，-OCH3×2)，3.95～2.93(overlap，xylosylprotons)，2.60～2.42(4H，overlap，H-9，H-9′)，1.05(2H，br s，H-8，H-8′)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：131.5(C-1)，106.3(C-2，C-6)，147.7(C-3，C-5)，55.9(3-OCH3，5-OCH3)，133.3(C-4)，34.5(C-7，C-7′)，40.5(C-8)，70.2(C-9)，131.0(C-1′)，106.3(C-2′，C-6′)，147.7(C-3′，C-5′)，55.8(3′-OCH3，5′-OCH3)，133.4(C-4′)，42.2(C-8′)，56.1(C-9′)，103.3(xyl-1)，76.8(xyl-2)，76.9(xyl-3)，73.7(xyl-4)，69.1(xyl-5)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]報(bào)道一致，故鑒定該化合物為ssioriside。

化合物10淡黃色結(jié)晶；ESI-MS：m/z437 [M+H]+，分子式為C22H28O9。1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：6.64(4H，s，H-2，H-2′，H-6，H-6′)，4.83(2H，d，J=7.2 Hz，H-7)，3.75 ( 12H，s，3，3′，5，5′-OCH3,)，3.50(4H，m，H-9，H-9′)，2.12(2H，m，H-8′)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：133.3(C-1，1′)，103.7(C-2，C-2′)，147.9(C-3，C-3′，C-5，C-5′)，134.7(C-4，C-4′)，82.1(C-7，C-7′)，53.51(C-8，C-8′)，60.40(C-9，C-9′)，56.0(3-OCH3，3′-OCH3，5-OCH3，5′-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]報(bào)道一致，故鑒定該化合物為華中冬青素。

化合物11淡紅色粉末；ESI-MS：m/z361 [M+H]+，分子式為C20H24O6。1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：6.68(1H，d，J=8 Hz，H-5)，6.63(1H，d，J=1.9 Hz，H-2)，6.60(1H，s，H-2′)，6.48(dd，J=8.1，1.9 Hz，1H，H-6)，6.08(1H，s，H-5′)，3.72(1H，d，J=9.5 Hz，H-7)，3.70(3H，s，3′-OCH3)，3.69(3H，s，3-OCH3)，2.67(2H，m，H-7′)，1.84(1H，m，H-8)，1.62(1H，m，H-8′)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：132.0(C-1)，113.3(C-2)，145.5(C-3)，55.7(3-OCH3)，144.1(C-4)，115.3(C-5)，121.5(C-6)，45.9(C-7，C-8)，59.9(C-9)，127.2(C-1′)，111.9(C-2′)，147.3(C-3′)，55.6(3′-OCH3)，144.6(C-4′)，116.3(C-5′)，137.2(C-6′)，32.3(C-7′)，38.1(C-8′)，63.6(C-9′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]報(bào)道一致，故鑒定該化合物為異落葉松脂素。

化合物12黃色無定型固體；ESI-MS：m/z361 [M+H]+，分子式為C20H24O6。1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：6.90(1H，s，H-2)，6.75(1H，s，H-6)，6.74(1H，s，H-4)，6.69(1H，s，H-2′)，6.68(1H，s，H-6′)，5.40(1H，d，J=6.8 Hz，H-7)，3.76(3H，s，5′-OCH3)，3.74(3H，s，3-OCH3)，3.68～3.60(2H，m，H-9)，3.42(2H，m，H-9′)，3.41(1H，m，H-8)，2.53(2H，t，J=6.8 Hz，H-7′)，1.69(2H，m，H-8′)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：132.0(C-1)，110.4(C-2)，147.6(C-3)，55.7(3-OCH3)，115.3(C-4)，146.3(C-5)，118.5(C-6)，86.9(C-7)，53.3(C-8)，63.1(C-9)，135.0(C-1′)，116.5(C-2′)，129.1(C-3′)，145.6(C-4′)，143.3(C-5′)，55.7(5′-OCH3)，112.5(C-6′)，31.6(C-7′)，34.7(C-8′)，60.2(C-9′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[18]報(bào)道一致，故鑒定該化合物為(7R,8S)-3,5′-二甲氧基-4′,7-環(huán)氧-8,3′-新木脂烷-5,9,9′-三醇。

化合物13白色針晶；ESI-MS：m/z249 [M+H]+，分子式為C13H12O5。1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：7.46(1H，d，J=8.5 Hz，H-2)，7.45(1H，s，H-5)，7.20(1H，s，H-8)，6.84(1H，d，J=8.5 Hz，H-3)，3.80(6H，s，6-OCH3，7-OCH3)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：140.2(C-1)，167.4(1-COOH)，123.5(C-2)，115.1(C-3)，151.1(C-4)，107.0(C-5)，147.3(C-6)，56.0(6-OCH3)，147.2(C-7)，55.6(7-OCH3)，112.8(C-8)，121.8(C-9)，121.8(C-10)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[19]報(bào)道一致，故鑒定該化合物為6,7-二甲氧基-4-羥基-1-萘甲酸。

化合物14白色晶體；ESI-MS：m/z183 [M+H]+，分子式為C9H10O4。1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：7.34(1H，d，J=2 Hz，H-2)，7.29(1H，dd，J=8.2，2.0 Hz，H-6)，6.78(1H，d，J=8.2 Hz，H-5)，4.22(2H，q，J=7.1 Hz，H-8)，1.28(3H，t，J=7.1 Hz，H-9)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：121.8(C-1)，116.2(C-2)，145.2(C-3)，150.7(C-4)，115.3(C-5)，120.6(C-6)，165.8(C-7)，60.1(C-8)，14.3(C-9)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[20]報(bào)道一致，故鑒定該化合物為3,4-二羥基苯甲酸乙酯。

化合物15無色油狀物無色油狀物；ESI-MS：m/z225 [M+H]+，分子式為C13H20O3。1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：5.78(1H，s，H-4)，5.68(1H，dd，J=15.6，5.4Hz，H-8)，5.67(1H，d，J=15.6 Hz，H-7)，4.18(1H，m，H-9)，2.36(1H，d，J=17.0 Hz，H-2a)，2.05(1H，d，J=17.0 Hz，H-2b)，1.80(3H，s，H-13)，1.11(3H，d，J=6.4 Hz，H-10)，0.93(3H，s，H-11)，0.91(3H，s，H-12)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：40.9(C-1)，49.4(C-2)，197.4(C-3)，125.5(C-4)，164.4(C-5)，77.9(C-6)，127.9(C-7)，135.9(C-8)，66.1(C-9)，24.1(C-10)，24.0(C-11)，23.1(C-12)，19.0(C-13)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[21]報(bào)道基本一致，故鑒定該化合物為bluemenol A。

化合物16褐色粉末；ESI-MS：m/z219 [M+H]+，分子式為C12H10O4。1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：9.02(2H，s，2×Ar-OH)，8.91 (2H，s，2×Ar-OH)，6.88(2H，d，J=2.1 Hz，H-2，H-2′)，6.76(2H，dd，J=8.1，2.1 Hz，H-6，H-6′)，6.74(2H，s，H-5，H-5′)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：132.1(C-1，C-1′)，113.5(C-2，C-2′)，144.2(C-3，C-3′)，145.4(C-4，C-4′)，116.0(C-5，C-5′)，116.9(C-6，C-6′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[22]報(bào)道一致，故鑒定該化合物為3,3′,4,4′-四羥基聯(lián)苯。

化合物17白色晶體；ESI-MS：m/z383 [M+H]+，分子式為C18H22O9。1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：7.39(1H，d，J=15.8 Hz，H-7′)，7.01(1H，d，J=2.3Hz，H-2′)，6.95(1H，dd，J=8.2，2.3 Hz，H-6′)，6.75(1H，d，J=8.2 Hz，H-5′)，6.11(1H，d，J=15.9 Hz，H-8′)，5.01(1H，m，H-3)，3.99(2H，q，J=7.1 Hz，H-8)，3.88(1H，m，H-5)，3.58(1H，dd，J=4.9，3.2 Hz，H-4)，2.12(1H，m，H-2a)，2.07(1H，m，H-6a)，1.92(1H，dd，J=13.7，3.6 Hz，H-2b)，1.77(1H，dd，J=12.7，9.3 Hz，H-6b)，1.11(3H，t，J=7.1 Hz，H-9)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：73.1(C-1)，35.3(C-2)，71.1(C-3)，69.6(C-4)，67.2(C-5)，37.2(C-6)，173.1(C-7)，60.3(C-8)，13.8(C-9)，125.3(C-1′)，114.5(C-2′)，145.2(C-3′)，148.8(C-4′)，115.9(C-5′)，121.6(C-6′)，146.6(C-7′)，113.9(C-8′)，165.5(C-9′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[23]報(bào)道一致，故鑒定該化合物為綠原酸乙酯。

2.2 抗氧化活性結(jié)果

2.2.1 DPPH清除率結(jié)果

單體化合物的DPPH清除能力實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，黃酮(1～2)及香豆素類(3～5)化合物有一定的DPPH清除作用，木脂素類(6～12)化合物普遍具有較強(qiáng)的DPPH清除作用，其中化合物10的DPPH清除率為(52.44±1.87)%，與同濃度陽性對(duì)照效果相當(dāng)(56.3±2.54)%。此外，多酚化合物14、16具有較高的DPPH清除率，分別為(60.37±2.83)%、(60.50±2.97)%，均高于同濃度下陽性對(duì)照藥物的DPPH清除率值，結(jié)果見圖1。

圖1 化合物1～17的DPPH清除率

2.2.2 總抗氧化能力測(cè)定結(jié)果

單體化合物的總抗氧化能力結(jié)果顯示，黃酮及香豆素類化合物僅有較弱的總抗氧化能力，木脂素類化合物抗氧化活性較為明顯。其中木脂素類化合物9的總抗氧化能力為(65.44±3.11) U/mmol、酚酸化合物13總抗氧化能力為(79.58±3.31) U/mmol、多酚類化合物16總抗氧化能力為(85.39±6.31) U/mmol，均顯著大于同濃度下陽性藥物Vc的總抗氧化能力(59.74±4.67) U/mmol，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2。

圖2 化合物1～17的總抗氧化能力

2.2.3 超氧陰離子清除能力

結(jié)果顯示木脂素類化合物及多酚類化合物具有一定的超氧陰離子清除能力，其中化合物9的清除率為(35.50±4.1)%，化合物13的清除率為(40.66±2.5)%，化合物16的清除率為(46.31±5.5)%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3。

圖3 化合物1～17的超氧陰離子清除率

3 討論與結(jié)論

人體內(nèi)產(chǎn)生的過量自由基會(huì)攻擊體內(nèi)脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、DNA等生物大分子，破壞細(xì)胞正常結(jié)構(gòu)，干擾人體的正常代謝活動(dòng)，從而引起疾病并加速人體衰老。因此尋找外源性抗氧化劑對(duì)于維持人體正常代謝是非常有必要的，天然抗氧化劑由于其低毒、高效的特點(diǎn)，已經(jīng)逐漸進(jìn)入了研究者的視野[24]。

本研究從土家族民間藥物地枇杷中分離并鑒定得到17個(gè)化合物，包括黃酮、香豆素、木脂素、多酚等化合物結(jié)構(gòu)類型。由于抗氧化實(shí)驗(yàn)的多樣性及復(fù)雜性，通常要求抗氧化活性采用2種以上的抗氧化活性方法進(jìn)行測(cè)定。本實(shí)驗(yàn)通過測(cè)定化合物的DPPH清除率、總抗氧化能力、超氧陰離子清除能力，來對(duì)地枇杷中分離得到的化合物進(jìn)行一個(gè)簡單的活性測(cè)定。發(fā)現(xiàn)木脂素類化合物及多酚、酚酸類化合物具有較強(qiáng)的抗氧化活性，甚至超過同濃度陽性對(duì)照的抗氧化能力。表明地枇杷中木脂素及多酚類化合物可能為其抗氧化活性藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。本研究進(jìn)一步豐富了地枇杷的化學(xué)成分及藥理活性，提示地枇杷可能具有較大的被開發(fā)為天然抗氧化劑的潛能，為土家族民間用藥地枇杷的開發(fā)與利用奠定基礎(chǔ)。