中藥材33種禁用農(nóng)殘檢測前處理方法的選擇

黃慧君 劉英發(fā) 程曉敏 李嵐 沈震亞

（江中藥業(yè)股份有限公司 江西南昌 330004）

中國是中草藥的發(fā)源地，使用中藥的歷史可追溯到幾千年前，但是隨著時代和環(huán)境的變遷，中藥的生存環(huán)境、種植模式及加工等其他方面都有很大的不同，中藥材作為中成藥的原料藥，它的質(zhì)量與人類用藥安全和生命安全息息相關(guān)，所以中藥材質(zhì)量檢測尤為重要，其中中藥材農(nóng)藥殘留測定就是不可缺少的一項[1]。中國是中藥材用藥大國，但是在中藥材的品質(zhì)管理方面依然有很多工作需要去落實，為了使中藥材種植業(yè)實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)升級，國家發(fā)布了《中國藥典》（2020 版），明確規(guī)定了要對植物類藥材進(jìn)行33種禁用農(nóng)藥殘留量檢測，方法采用《中國藥典》（2020版）四部通則2341 下的第五法，其中規(guī)定了33種禁用農(nóng)藥需要用到液相色譜- 質(zhì)譜/ 質(zhì)譜聯(lián)用法（LC-MS/MS） 和氣相色譜 - 質(zhì)譜 / 質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS/MS）進(jìn)行檢測，因此需要我們選擇合適的方法進(jìn)行樣品前處理。但中藥材成分復(fù)雜多樣，基質(zhì)效應(yīng)各不相同[2]，為了保證所選前處理方法的可行性及檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，不同的中藥材需要適用不同的前處理方法進(jìn)行檢測。本實驗旨在探究不同中藥材適用的前處理方法及根據(jù)中藥材性質(zhì)選擇相應(yīng)前處理方法的可行性?，F(xiàn)報道如下：

1 儀器與材料

1.1 儀器 氣相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀（日本島津公司），高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀（AB SCIEX 公司），電子天平（SECURA 公司），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（Lab Tech 公司），0.5～5 ml、0.1～1 ml、20～200 μl、2～20 μl 移 液 器 （RAININ 公 司），0.22 μm 濾 膜（NEWSTAR 公司），離心機(jī)（盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司），振蕩器（上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司）。

1.2 試劑 質(zhì)譜純乙腈（Merk 公司）、色譜純乙腈（廣東光華科技股份有限公司）、甲酸（山東西亞化學(xué)股份有限公司）、甲酸銨（Sigma-Aldrich 公司）、色譜純甲苯（西隴科學(xué)股份有限公司）、色譜純異丙醇（天津市大茂化學(xué)試劑廠）、水為超純水、34種混標(biāo)（批號：S057535，來源：SHIMADZU 公司）、內(nèi)標(biāo)（批號：S058547，來源：SHIMADZU 公司）、30種混標(biāo)（批號：S057527，來源：阿爾塔科技公司）。

1.3 樣品 陳皮（批號：2012802，來源：由江中藥業(yè)股份有限公司提供）、腫節(jié)風(fēng)（批號：2103802，來源：由江中藥業(yè)股份有限公司提供）、炒萊菔子（批號：2103001，來源：由江中藥業(yè)股份有限公司提供）。

2 方法

2.1 對照品溶液的制備

2.1.1 混合對照品溶液的制備 精密量取禁用農(nóng)藥混合對照品溶液（已標(biāo)示各相關(guān)農(nóng)藥品種的濃度）0.1 ml，置于10 ml 容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.2 氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法分析用內(nèi)標(biāo)溶液的制備精密吸取磷酸三苯酯內(nèi)標(biāo)溶液0.1 ml（100 μg/ml），置于100 ml 容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，即得0.1 μg/ml 的內(nèi)標(biāo)溶液。

2.1.3 空白基質(zhì)溶液的制備 取空白基質(zhì)樣品，同供試品溶液的制備方法處理制成空白基質(zhì)溶液。

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制 分別精密量取空白基質(zhì)溶液1.0 ml（6 份），置于氮吹儀上，40℃水浴濃縮至約0.6 ml，分別加入混合對照品溶液 10 μl、20 μl、50 μl、100 μl、150 μl、200 μl，加乙腈稀釋至 1 ml，渦旋混勻，即得。

2.2 供試品溶液的制備 按照《中國藥典》（2020版）四部通則2341 農(nóng)藥殘留測定法第五法《藥材及飲片（植物類）中禁用農(nóng)藥多殘留測定法》[3]中的直接提取法及固相萃取法進(jìn)行提取凈化。根據(jù)陳皮、腫節(jié)風(fēng)、炒萊菔子三者化學(xué)成分的不同，結(jié)合固相萃取第一、二、三法固相萃取柱組成成分特點，選擇使用不同提取凈化方法。陳皮主要含有黃酮類、生物堿類、檸檬苦素類、揮發(fā)油類，選擇直接提取法+固相萃取第一法，或直接提取法+固相萃取第二法提取凈化。腫節(jié)風(fēng)主要成分較為復(fù)雜，含有含揮發(fā)油、酯類、酚類、鞣質(zhì)、黃酮、氰甙、香豆素等且顏色較深[4]，選擇直接提取法+固相萃取第一法，或直接提取法+固相萃取第三法提取凈化。炒萊菔子主要含有脂肪油、揮發(fā)油，選擇直接提取法+固相萃取第一法，或直接提取法+固相萃取第二法提取凈化。

2.3 測定法

2.3.1 氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法 分別精密吸取上述的基質(zhì)混合對照溶液和供試品溶液各1 ml，精密加入內(nèi)標(biāo)溶液0.3 ml，混勻，濾過，取續(xù)濾液。分別精密吸取上述兩種溶液各1 μl，注入氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀，按內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算，即得。

2.3.2 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法 分別精密吸取上述的基質(zhì)混合對照溶液和供試品溶液各1 ml，精密加入水0.3 ml，混勻，濾過，取續(xù)濾液。分別精密吸取上述兩種溶液各2 μl，注入液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，按外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算，即得。

3 試驗結(jié)果

3.1 陳皮檢驗結(jié)果 氣質(zhì)聯(lián)用儀及液質(zhì)聯(lián)用儀檢測結(jié)果顯示，采用固相萃取第一法凈化后上機(jī)，線性相關(guān)系數(shù)均在0.990 3～0.999 8 之間，重復(fù)性6 針之間的RSD 均在10%以下，定量限加標(biāo)回收率均在73.23%～111.52%之間。但是采用固相萃取第二法時，氣質(zhì)聯(lián)用儀檢測結(jié)果顯示：甲基對硫磷回收率為43.58%、氟蟲腈回收率為49.34%、水胺硫磷回收率為 54.52%、2,4′- 滴滴涕回收率為 175.40%、4,4′- 滴滴涕回收率為187.97%、蠅毒磷回收率為55.05%。液質(zhì)聯(lián)用儀檢測結(jié)果顯示：采用固相萃取第二法凈化后上機(jī)甲胺磷性相關(guān)系數(shù)為0.913 5、甲拌磷相關(guān)系數(shù)為0.911 2、內(nèi)吸磷相關(guān)系數(shù)為0.958 2、水胺硫磷相關(guān)系數(shù)為0.944 2，線性相關(guān)系數(shù)均＜0.99，而甲胺磷、水胺硫磷、甲拌磷、內(nèi)吸磷加標(biāo)回收率分別為66.36%、55.21%、46.81%，均不在70%～120%之間。綜合以上結(jié)果，陳皮采用直接提取法結(jié)合固相萃取第一法提取較好。見表1。

表1 陳皮檢驗結(jié)果

3.2 腫節(jié)風(fēng)檢驗結(jié)果 氣質(zhì)聯(lián)用儀及液質(zhì)聯(lián)用儀的檢測結(jié)果顯示，采用固相萃取第三法凈化后上機(jī)，線性相關(guān)系數(shù)均在0.994 1～0.999 9 之間，重復(fù)性6針之間的RSD 均在10%以下，定量限加標(biāo)回收率均在70.08%～111.30%之間。但是采用固相萃取第一法時，氣質(zhì)聯(lián)用儀檢測結(jié)果顯示：2,4′-滴滴涕線性相關(guān)系數(shù)為0.963 5、4,4′-滴滴涕線性相關(guān)系數(shù)為0.865 9。液質(zhì)聯(lián)用儀檢測結(jié)果顯示，采用固相萃取第一法凈化后上機(jī)甲胺磷性相關(guān)系數(shù)為0.913 5、甲拌磷相關(guān)系數(shù)為0.905 2、地蟲硫磷相關(guān)系數(shù)為0.851 2、水胺硫磷相關(guān)系數(shù)為0.953 2，線性相關(guān)系數(shù)均＜0.99，而甲胺磷、水胺硫磷、甲基異柳磷、內(nèi)吸磷加標(biāo)回收率分別為56.36%、63.21%、48.21%，均不在70%～120%之間。綜合以上結(jié)果，腫節(jié)風(fēng)采用直接提取法結(jié)合固相萃取第三法提取較好。見表2。

表2 腫節(jié)風(fēng)檢驗結(jié)果

3.3 炒萊菔子檢驗結(jié)果 氣質(zhì)聯(lián)用儀及液質(zhì)聯(lián)用儀的檢測結(jié)果顯示，當(dāng)液質(zhì)聯(lián)用儀采用固相萃取第一法、氣質(zhì)聯(lián)用儀采用固相萃取第二法凈化后上機(jī)，線性相關(guān)系數(shù)均在0.991 1～0.999 9 之間，重復(fù)性6針之間的RSD 均在10%以下，定量限加標(biāo)回收率均滿足64.03%～115.32%。液質(zhì)聯(lián)用儀檢測結(jié)果顯示，采用固相萃取第二法凈化后上機(jī)地蟲硫磷相關(guān)系數(shù)為0.926 8、甲拌磷相關(guān)系數(shù)為0.933 2、內(nèi)吸磷相關(guān)系數(shù)為0.906 8、甲基異柳磷相關(guān)系數(shù)為0.9620，線性相關(guān)系數(shù)均＜0.99，而治螟磷、內(nèi)吸磷、甲基異柳磷、加標(biāo)回收率分別為56.36%、43.21%、68.21%，均不在70%～120%之間。綜合以上結(jié)果，炒萊菔子氣質(zhì)聯(lián)用儀及液質(zhì)聯(lián)用儀分別采用直接提取法結(jié)合固相萃取第二法和直接提取法結(jié)合固相萃取第一法提取。見表3。

表3 炒萊菔子檢驗結(jié)果

3 討論

在提取方式的選擇上，本實驗采取振蕩提取方式，即在中藥材粉末中加入規(guī)定量乙腈，調(diào)節(jié)振蕩頻率至2 500，振蕩15 min，使乙腈與中藥材粉末充分接觸提取。相比于超聲提取和勻漿提取具有方便，高效，簡單的特點[5]?！吨袊幍洹罚?020 版）未對旋蒸溫度明確規(guī)定，以乙腈沸點為指導(dǎo)，限制旋蒸溫度不超過40℃。本實驗選用30℃對提取溶液進(jìn)行旋蒸，在此溫度下，中藥材農(nóng)殘不易被破壞，加樣回收率良好。實驗過程中發(fā)現(xiàn)藥材只經(jīng)過直接提取法而不凈化，中藥材中的色素、揮發(fā)油、黃酮類等復(fù)雜的化學(xué)成分無法去除，會極大地干擾實驗，也會對整個檢驗系統(tǒng)產(chǎn)生影響[6]。固相萃取第一法及固相萃取第三法均能去除直接提取法提取后的藥材溶液顏色，但固相萃取第一法對于以腫節(jié)風(fēng)為代表的全草類藥材，色素去除能力不如固相萃取第三法，氣質(zhì)聯(lián)用儀結(jié)果顯示固相萃取第一法對殺蟲脒具有強(qiáng)抑制作用，回收率均在60%以下。固相萃取第二法及固相萃取第一法均能去除油脂類揮發(fā)油類化合物。但油脂含量高的化合物采用氣質(zhì)聯(lián)用儀檢測，用固相萃取第二法效果顯著，基質(zhì)干擾小。而對于液質(zhì)聯(lián)用儀，用固相萃取第一法效果更明顯。

實驗確定了陳皮、腫節(jié)風(fēng)、炒萊菔子三種具有代表性的中藥材的前處理提取凈化方式。通過評價不同提取凈化方式下的線性相關(guān)系數(shù)、定量限加標(biāo)回收率，確定了陳皮使用直接提取法+固相萃取第一法提取凈化，腫節(jié)風(fēng)使用直接提取法+固相萃取第三法提取凈化，炒萊菔子使用（液質(zhì)）直接提取法+固相萃取第一法，（氣質(zhì)）直接提取法+固相萃取第二法，為不同中藥材前處理提取凈化方式的選擇提供了依據(jù)。