基于網(wǎng)絡(luò)藥理和分子對接探究山柰酚治療抵抗性前列腺癌的機制*

毛正 譚武賓 陳貴恒 鄭玨 陳昊 李鐵求# 楊科

（1 湖南省長沙縣人民醫(yī)院 長沙 410100；2 湖南省人民醫(yī)院 長沙 410002）

在我國前列腺癌的發(fā)病率和死亡率雖然遠低于歐美國家，但近年來其增長速度在老年男性常見惡性腫瘤中位居第一，成為危害老年男性健康的第二常見腫瘤[1～2]。較多前列腺癌患者早期對雄激素剝奪治療有效，但大多數(shù)終將從激素敏感進展為去勢抵抗性前列腺癌（CRPC）[3]。CRPC 是一種致死率較高的前列腺癌，超過84%的患者會有轉(zhuǎn)移[4]。目前，阿比特龍、恩扎盧胺等新型內(nèi)分泌藥物和紫杉醇類的化療藥物成為治療CRPC 的藥物，在一定程度上能夠延長患者生存獲益[5]。但是一旦進入CPRC，其生存中位數(shù)只有20個月[6]。雖然近年來新的化療藥物、化療方案不斷改進，抗前列腺癌藥物仍然普遍存在藥物靶向性差和全身毒性問題，限制了藥物療效的發(fā)揮和長期使用，而前列腺癌表現(xiàn)出的多藥耐藥性也一直是腫瘤復發(fā)、轉(zhuǎn)移乃至治療失敗的主要原因[7]。因此，尋找新的藥物對治療CRPC 具有重要意義。

山柰酚是一種十分常見的苷元黃酮類化合物，不僅存在于日常蔬菜水果中，還廣泛存在于白芍、柴胡、杜仲、甘草等中藥中[8]。山柰酚及其糖基化衍生物具有保護心臟、抗炎、抗糖尿病、抗氧化和抗腫瘤活性[9]。據(jù)報道，山柰酚具有多種抗腫瘤活性，可作用于腫瘤的多個環(huán)節(jié)，包括抑制腫瘤細胞增殖、侵襲，誘導凋亡、抑制血管生成等方面[10]。一項荷蘭隊列研究顯示，攝入總兒茶素、表兒茶素、山柰酚和楊梅素以及飲用紅茶與Ⅲ/Ⅳ期或Ⅳ期前列腺癌風險呈負相關(guān)[11]。此外，山柰酚通過抑制增殖和轉(zhuǎn)移、誘導細胞周期停滯、促進細胞凋亡和抑制血管生成發(fā)揮抗腫瘤作用[11～13]。然而，山柰酚治療CRPC 的分子機制尚未完全明確。網(wǎng)絡(luò)藥理學作為全新的藥理學方法，為復雜疾病的藥物發(fā)現(xiàn)和選擇提供了新的思路[14]。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學和分子對接的方法探討山柰酚治療CRPC 的作用機制，為今后的臨床應(yīng)用和基礎(chǔ)研究提供參考?，F(xiàn)報道如下：

1 工具與方法

1.1 山柰酚治療靶點的收集 通過在藥物數(shù)據(jù)庫PubChem （https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/） 及ChEMBL （https://www.ebi.ac.uk/chembl/） 中 輸 入“kaempferol”獲取山柰酚標準的2D 分子結(jié)構(gòu)圖以及規(guī)范的SMILSES 結(jié)構(gòu)信息，利用Swiss ADEM 數(shù)據(jù)庫（http://www.swissadme.ch/）分析山柰酚的藥代動力學。通過Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫（http://www.swisstargetprediction.ch/）收集山柰酚治療靶點，在 Uniprot 數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）中校正靶點。

1.2 CRPC 相關(guān)基因的收集 在DisGeNET 數(shù)據(jù)庫（https://www.disgenet.org/） 中 輸 入“castration resistant prostate cancer”收集CRPC 相關(guān)的目標基因。利用韋恩圖工具（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）將山柰酚預測靶點映射到CRPC靶標中獲得山柰酚治療CRPC 的關(guān)鍵靶點。

1.3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析及核心靶點篩選 在“STRING”數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/）的“Multiple proteins”窗口中，輸入靶點蛋白名稱，Organism 選擇“Homo sapiens”，其余參數(shù)保持默認設(shè)置不變，結(jié)果保存為TSV 文本輸出，在Cytoscape3.7.2 軟件中進行網(wǎng)絡(luò)拓撲學分析，獲取潛在作用靶標之間的連接度（Degree 值），并根據(jù)Degree 值繪制潛在作用靶標相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，使用MCODE 插件對蛋白群進行蛋白聚類分析，以K-core=2 為條件，并且使用cytoHubba 插件篩選出核心靶點。

1.4 GO 基因本體和KEGG 通路富集分析 使用R studio 中的“clusterProfiler”以及“org.Hs.eg.db”軟件包（R3.6.3 for Windows）使用bitr 函數(shù)將目標靶標轉(zhuǎn)換為ENTREZID ids 進行GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析，其中GO 分析包括生物學過程（BP）、細胞學組分（CC）、生物學功能（MF），設(shè)置P＜0.01 為具有統(tǒng)計學意義的富集結(jié)果，將結(jié)果以柱形圖和氣泡圖展示。

1.5 分子對接分析 分別在PDB 數(shù)據(jù)庫（https://www.rcsb.org/） 和 TCMSP 數(shù)據(jù)庫（https://tcmsp-e.com/） 下載相應(yīng)蛋白和小分子藥物，利用AutoDockTools-1.5.6 軟件對蛋白進行去水、加氫以及計算電荷處理等處理，利用插件“autogrid”及“autodock”進行活性位點對接，對接過程中使用Lamarckian genetic algorithm（LGA）算法。計算結(jié)合能（Binding Energy,BE）（Kj/mol）來評估成分小分子與蛋白之間的結(jié)合活性，一般小于-5.0 kal/mol 的對接結(jié)合能被認為具有良好的結(jié)合相互作用。最后運用PyMOL2.4.0 軟件展示其結(jié)構(gòu)模式。

2 結(jié)果

2.1 山柰酚基本信息 從PubChem 及數(shù)據(jù)庫ChEMBL （https://www.ebi.ac.uk/chembl/） 中 輸 入“kaempferol”獲取山柰酚標準的2D 分子結(jié)構(gòu)圖和規(guī)范的SMILSES 結(jié)構(gòu)信息。見圖1。從Swiss ADEM數(shù)據(jù)庫分析山柰酚的藥代動力學。見表1。

表1 山柰酚的藥代動力學分析表

圖1 山柰酚的標準2D 分子結(jié)構(gòu)圖及SMILSES 結(jié)構(gòu)式

2.2 CRPC 基因 在 DisGeNET 數(shù)據(jù)庫中輸入“castration resistant prostate cancer”或“castration resistant prostate tumor”，共收集到683個具有代表性基因。

2.3 山柰酚治療CRPC 靶點的蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò) 將獲得的103個預測靶點蛋白通過韋恩圖工具映射至CRPC 靶點基因獲得29個靶點蛋白，將這一部分稱之為關(guān)鍵靶點。見圖2。將以上關(guān)鍵蛋白輸入到“STRING”數(shù)據(jù)庫“Multiple proteins”窗口中，Organism 選擇“Homo sapiens”，最低交互分數(shù)“minimum required interaction score”設(shè)置為0.400，PPI 網(wǎng)絡(luò)分析得出，該網(wǎng)絡(luò)共有28 節(jié)點，其中有1個靶點未在該網(wǎng)絡(luò)中，127 條邊，平均節(jié)點度值為9.07，將結(jié)果以TSV 格式輸出保存。將文件導入Cytoscape7.1.0 軟件中，進行拓撲學分析，計算度值，其 中 度 值 大 小 依 次 為 ESR1（Degree=21）、SRC（Degree=18）、EGFR（Degree=17）、AKT1（Degree=17）、PTGS2（Degree=15），根據(jù)度值呈現(xiàn)出 PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，使用軟件中MCODE 插件對蛋白群進行蛋白聚類分析，構(gòu)建功能模塊，得到3個蛋白聚類群。見圖3。聚類1 平均度值為8.6，聚類2 平均度值為3，聚類3平均度值為3。分別對3個聚類的蛋白基因進行KEGG 通路富集分析，設(shè)置P＜0.01 為具有統(tǒng)計學意義的富集結(jié)果。結(jié)果見圖4。發(fā)現(xiàn)聚類1 主要富集的通路有癌癥中的蛋白多糖、雌激素信號通路、膀胱癌、卵巢類固醇生成、黏著斑、Rap1 信號通路、VEGF信號通路等信號通路，聚類2 主要富集的通路有PI3K-AKT 信號通路、癌癥的途徑、ErbB 信號通路、軸突引導、趨化因子信號通路、癌癥中的蛋白多糖通路等，聚類3 主要富集的通路有卵巢類固醇生成，類固醇激素生物合成通路。

圖2 山柰酚與CRPC 關(guān)鍵靶點韋恩圖

圖3 山柰酚治療CRPC 關(guān)鍵靶點蛋白PPI 網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 3個蛋白聚類群通路富集分析

2.4 GO 基因本體和KEGG 通路富集分析 使用R的 clusterProfiler 軟件包（R4.0.2 for Windows）進行GO 富集分析和KEGG 通路富集分析，其中GO 分析包括生物學過程（BP）、細胞學組分（CC）、生物學功能（MF），設(shè)置P＜0.01 為具有統(tǒng)計學意義的富集結(jié)果。共富集到511個條目，其中BP 共470 條，涉及肽基絲氨酸修飾、蛋白質(zhì)自身磷酸化、活性氧反應(yīng)、藥物反應(yīng)、細胞周期調(diào)節(jié)等方面；CC 共3 條，包括蛋白激酶復雜、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶復合物、轉(zhuǎn)移酶復合物；MF 共38 條，涉及酪氨酸激酶活性、轉(zhuǎn)錄因子活性、絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、熱休克蛋白結(jié)合、雌激素受體結(jié)合、氧化還原酶活性等方面。具有代表性的GO 富集分析結(jié)果見圖5。為進一步揭示山柰酚抗CRPC 的潛在藥理機制，進行KEGG通路分析，探索山柰酚發(fā)揮作用的潛在通路。設(shè)置P＜0.01 為具有統(tǒng)計學意義的富集結(jié)果，有42 條具有差異的富集通路。具有代表性的前25 條富集通路見圖6。結(jié)果表明，內(nèi)分泌抵抗通路、EGFR 酪氨酸激酶抑制劑耐藥性、蛋白聚糖在癌癥、PI3K-AKT 信號通路、雌激素信號通路富集明顯。上述分子功能和生物學過程與CRPC 的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，表明山柰酚可以通過多靶點、多途徑的方式治療CRPC。

圖5 山柰酚治療CRPC 關(guān)鍵基因GO 基因本體富集氣泡圖

圖6 山柰酚治療CRPC 關(guān)鍵基因KEGG 通路富集氣泡圖（前25）

2.5 山柰酚與核心靶點的分子對接 選擇山柰酚治療CRPC 靶點的前10個作為核心靶點，分別是ESR1、SRC、EGFR、AKT1、PTGS2、CYP19A1、MMP9、ABCG2、ESR2、IGF1R，運行 AutoDock 軟件進行 10次分子對接。具體對接結(jié)合結(jié)果見表2。由表可知，山柰酚與 AKT1 結(jié)合能最低，其次是MMP9、CYP19A1、PTGS2，對接結(jié)合能越低表明山柰酚與這些靶點結(jié)合親和力越高，提示其有更大可能作用于這些靶點，影響靶點結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，進而調(diào)控相應(yīng)的信號通路。山柰酚與靶點AKT1 對接結(jié)構(gòu)圖見圖7。由圖可知，山柰酚與AKT1 的TYR-272 殘基有苯環(huán)共扼 π 鍵，與 LEU-295、LYS-297、LYS276 等殘基有氫鍵相連，進一步說明分子與蛋白之間結(jié)合緊密。進而表明，山柰酚抗CRPC 主要是通過調(diào)節(jié)這些核心靶點來實現(xiàn)。

表2 山柰酚與CRPC 核心靶點分子對接結(jié)合能（kJ/mol）

圖7 山柰酚與核心靶點AKT1 分子對接結(jié)構(gòu)圖

3 討論

黃酮類化合物在自然界中無處不在，存在于較多水果、蔬菜和農(nóng)作物中，且濃度較高，特別是山柰酚和芹菜素，兩者具有雌激素樣作用，說明在本質(zhì)上，山柰酚可以通過某些途徑調(diào)節(jié)前列腺癌的發(fā)生發(fā)展，這也是以素食為主的亞洲男性前列腺癌發(fā)病率要低于以肉食為主的歐美男性的原因之一[15]。網(wǎng)絡(luò)藥理學是一種依附系統(tǒng)生物學、生物信息學、藥理學、計算機科學等學科理論，研討“化合物-蛋白質(zhì)/基因-疾病”之間的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系的一門學科[16]。為發(fā)現(xiàn)山柰酚治療CRPC 的作用機制，本研究整合網(wǎng)絡(luò)藥理學的方法，PPI 網(wǎng)絡(luò)分析鑒定出治療靶點，GO 和KEGG 分析作用機制，并結(jié)合分子對接進行分析驗證 。 篩 選 出 ESR1、SRC、EGFR、AKT1、PTGS2、CYP19A1、MMP9、ABCG2、ESR2、IGF1R 等 10個靶點作為山柰酚抗CRPC 的核心靶點。

AKT1 是PI3K/AKT 信號通路中核心調(diào)控因子，參與腫瘤的多種生物學過程。在前列腺癌中，基于基因組和轉(zhuǎn)錄組譜發(fā)現(xiàn)，有多達42%的原發(fā)性前列腺癌和100%的轉(zhuǎn)移性前列腺癌樣本檢測出PI3K途徑成分的遺傳變異和基因表達失調(diào)[17]。研究報道，磷酸化AKT 的水平與Gleason評分高低成正比，AKT 的水平可能成為預測根治性前列腺切除患者生化復發(fā)的指標[18]。雌激素相關(guān)受體ESR1、ESR2 在前列腺癌中可能顯著影響前列腺癌的發(fā)展和進展[19]，Wang 等[20]進行亞洲人群前列腺癌全基因組研究提出，ESR2 可作為亞洲人的前列腺癌風險相關(guān)變異基因位點。有研究表明，CYP17A1、LHCGR 和ESR2基因的遺傳變異，與前列腺癌的侵襲性疾病進展有關(guān)[21]。研究發(fā)現(xiàn)，EGFR（表皮生長因子受體）表達增加或激活在前列腺癌患者中占相當大的比例，且與高復發(fā)率、不良預后和去勢抵抗進展密切相關(guān)[22]，EGFR 表達增加（逃逸雄激素調(diào)控）是CRPC 的潛在分子開關(guān)[23]。PTGS2 又稱為環(huán)氧合酶 2（COX-2），研究結(jié)果表明，PTGS2 在前列腺癌細胞中高表達，COX-2/Mattritase 信號通路參與了COX-2 過表達的CRPC 細胞的侵襲、腫瘤生長和轉(zhuǎn)移[24]。Src（一種原癌基因酪氨酸蛋白激酶）參與前列腺腫瘤骨轉(zhuǎn)移進展，具有驅(qū)動增殖、存活、遷移和向雄激素依賴性生長轉(zhuǎn)變的作用。且研究報道，Src 抑制劑比如達沙替尼、波沙替尼的臨床前和臨床研究中已經(jīng)獲得了令人鼓舞的結(jié)果[25]。較多研究表明，基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs） 在CRPC 轉(zhuǎn)移機制中發(fā)揮重要的作用，MMP2 和MMP9 蛋白與轉(zhuǎn)移性CRPC 密切相關(guān)，下調(diào)MMP2 和MMP9 蛋白水平可以減少CRPC 細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[26]。MMP 活性受其相關(guān)基因表達和酶促反應(yīng)的介導和控制，有研究證明AKT 信號通路可影響MMP2 和MMP9 的表達，從而導致CRPC 的進展[27]。胰島素樣生長因子1 受體（IGF1R）在腫瘤的增殖、凋亡、血管生成中發(fā)揮重要作用，Ahearn 等[28]學者通過預后模型和免疫組化檢測IGF1R、IR 和ERG 的蛋白表達發(fā)現(xiàn)，IGF1R 的表達可能在前列腺癌向致命的表型發(fā)展過程中發(fā)揮作用。ATP 結(jié)合盒亞家族 G 成員 2（ABCG2），有研究表明 ABCG2 的變異可能與前列腺根治性切除術(shù)后PSA 復發(fā)的前列腺癌患者生存機制有關(guān)[29]。本研究結(jié)果基本與目前研究報道相一致，更加提示，山柰酚可能通過作用于這些靶點發(fā)揮抗CRPC 作用。

為進一步說明山柰酚對CRPC 的生物學效應(yīng)，我們通過靶蛋白進行GO 富集分析和KEGG 通路富集分析。GO 分析表明，核心靶點的生物學過程主要集中在肽基絲氨酸修飾、蛋白質(zhì)自身磷酸化、活性氧反應(yīng)、藥物反應(yīng)、細胞周期調(diào)節(jié)等方面上。KEGG分析表明，富集通路與內(nèi)分泌抵抗通路、EGFR 酪氨酸激酶抑制劑耐藥性、蛋白聚糖在癌癥、PI3K-AKT信號通路、雌激素信號通路富集明顯和其他癌癥途徑有關(guān)。根據(jù)對文獻的分析，內(nèi)分泌抵抗是前列腺癌發(fā)展為CRPC 的必經(jīng)之路，CRPC 可涉及多種非互斥機制，包括AR 依賴性和非依賴性機制，AR 依賴性機制涉及基因擴增、突變、調(diào)節(jié)因子改變等，AR非依賴性機制涉及凋亡抵抗、人第10 號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因（PTEN）失活等，激酶依賴性信號通路、腫瘤免疫、腫瘤干細胞、非編碼RNAs（non-coding RNAs,ncRNAs）的改變等也參與了CRPC 的發(fā)生發(fā)展[30]。相關(guān)研究數(shù)據(jù)表明，前列腺癌向CRPC 進展過程中，磷脂酰肌3-激酶（PI3K）/絲氨酸 - 蘇氨酸蛋白激酶（AKT） 信號通路（PI3K/AKT 信號通路）扮演者重要角色，PI3K/AKT信號通路可作為CRPC 潛在的生物標志物[31]，該通路相關(guān)的抑制劑現(xiàn)已進行臨床試驗，并且取得可觀的療效[32]。現(xiàn)代中藥藥理學研究發(fā)現(xiàn)，一些天然藥物可作用于PI3K/AKT 信號通路發(fā)揮抗前列腺癌效果。研究發(fā)現(xiàn)，異鼠李素可顯著抑制雄激素非依賴性前列腺癌細胞DU145 和PC3 的生長[33]，被認為是一種選擇性PI3K/AKT/mTOR 途徑抑制劑；將丹皮酚作用于前列腺癌DU-145 細胞株、PC-3 細胞株以及DU-145 荷瘤小鼠，發(fā)現(xiàn)丹皮酚抗增殖作用可能與其外在和內(nèi)在凋亡途徑的激活以及PI3K/AKT 途徑的抑制密切相關(guān)[34]。Li 等[35]通過苦參堿處理前列腺癌DU-145 和 PC-3 細胞，提出苦參堿可能通過PI3K-AKT-FOXO 信號通路抑制前列腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲并誘導其凋亡。

綜上所述，本研究可以推測山柰酚通過調(diào)節(jié)CRPC 細胞中預測靶點、通路和生物學過程而發(fā)揮有效的抗癌作用。預測的靶點也可作為抗CRPC 的潛在分子標志物。通過網(wǎng)絡(luò)藥理學途徑和分子對接技術(shù)產(chǎn)生的藥理和分子機制具有良好預測性，該方法的準確性和實用性為進一步探索山柰酚治療CRPC 的藥理靶點和分子機制奠定了良好的基礎(chǔ)。