吸附溶出伏安法檢測吸毒人員尿液中嗎啡

陳 瑾，殷勤紅，劉 燕，張建強，李越凡，李龍發(fā)，陳 航，趙文嵩，楊紅梅，楊發(fā)震，倪春明**

(1.云南警官學院 刑事偵查學院，云南 昆明 650221；2.毒品分析及禁毒技術(shù)公安部重點實驗室，云南 昆明 650223；3.云南省公安廳 刑偵總隊技術(shù)處理室，云南 昆明 650228；4.云南省玉溪市公安局 刑事科學技術(shù)研究所，云南 玉溪 653100)

阿片類毒品是目前世界上使用歷史最長、流行范圍最廣、危害最嚴重的毒品[1].據(jù)2020 年中國毒情形勢報告，在180.1 萬名現(xiàn)有吸毒人員中，濫用阿片類毒品人數(shù)為73.4 萬名，占現(xiàn)有吸毒人員總數(shù)40.8%.嗎啡是海洛因、嗎啡和可待因的最終代謝物.嗎啡除了因其成癮性、危害性、濫用性而具有毒品的角色外，它的鎮(zhèn)痛麻醉作用還使其成為一種良好的鎮(zhèn)痛劑用于臨床.尿液中治療嗎啡的量通常為8～80 ng/mL[2].傳統(tǒng)的毒品現(xiàn)場快速檢測[3]方法主要有試紙法（免疫膠體金技術(shù)）、化學法以及便攜式光譜檢測法，這些方法檢測快速，操作方便，但也具有特異性不強、靈敏度不高等缺點.因此還需要送入實驗室采用GC-MS[4]、HPLC-MS 等精密儀器進行分析確認.電化學傳感器[5](ECS) 基于待測物本身的電化學性質(zhì)，能夠?qū)⒋郎y物化學量轉(zhuǎn)變成電學量進行檢測，并在這兩個變量之間建立起一定的聯(lián)系，通過檢測電化學信號達到檢測待測物化學量的目的.電化學儀器操作簡單，價格低廉，不需要復(fù)雜的儀器維護，同時電化學傳感器還具有較高的靈敏度、較快的分析速度、越來越微型化與集成化等優(yōu)點，因而被廣泛應(yīng)用在基礎(chǔ)研究、生物、臨床化學、化學分析等領(lǐng)域[6]，是目前最熱門的研究領(lǐng)域之一.吸附溶出伏安法 (ASDPV)[7]是將目標分析物從溶液相向電極表面吸附傳遞，并不斷富集在電極上，因為電極面積很小，這樣電極表面被測物濃度遠遠大于本體溶液中的濃度，從而增加待測物的檢測靈敏度.利用嗎啡在電極上的氧化電流對其進行電化學檢測的研究已有一些文獻報道，其中使用的工作電極多為化學修飾電化學，修飾材料包括六氰基高鐵酸鈷[8]、羧基化碳納米管[9]、普魯士藍[10]、聚乙撐二氧噻吩[11]、鐵卟啉[12]以及分子印跡材料[10]等，檢測技術(shù)有循環(huán)伏安法 (CV)、計時電流法(i?t)以及差分脈沖伏安法(DPV).但這些檢測方法的靈敏度較本文中的ASDPV 法低，且修飾材料制備較為復(fù)雜.此外，據(jù)查閱文獻，目前還未見用電化學傳感器檢測實際吸毒人員尿液中嗎啡的報道.

本文將多壁碳納米管經(jīng)簡單羧基化處理后作為檢測嗎啡的電極修飾材料，通過滴涂法制備了羧基化多壁碳納米管 (MWNTs-COOH) 修飾玻碳電極 (MWNTs-COOH/GCE)，并將其作為工作電極，采用吸附溶出伏安法對尿液中的嗎啡進行檢測.在檢測過程中發(fā)現(xiàn)，尿酸的氧化電位與嗎啡的氧化電位接近，對嗎啡的檢測有很大干擾.因此，提出了用尿酸酶去除尿液中尿酸的方法，提高了檢測結(jié)果的準確性，實現(xiàn)了對尿液中嗎啡的快速、簡單、高選擇性檢測.

1 實驗部分

1.1 實驗原理嗎啡含有兩個羥基[2]，其中3 位上的酚羥基可被氧化，嗎啡氧化過程分為兩步：第一步3 位上的酚羥基 (M―O?) 失去電子生成M―O*，M―O*很不穩(wěn)定會生成偽嗎啡 (PM―OH)；第二步PM―OH 含有的酚羥基 (PM―O?) 會氧化生成PM―O*.這個過程氧化中會引起電流的變化，根據(jù)被測嗎啡溶液引起的電流改變位置、變化大小及電流改變與濃度的聯(lián)系對嗎啡進行定性或定量分析.

總反應(yīng)式為：2M—OH ?PM—O?+3e?+3H+，其中M—OH 和PM—OH 分別代表嗎啡和偽嗎啡.

1.2 試劑與原材料嗎啡堿（云南省公安廳，w=98.4%±1.1%）；多壁碳納米管（泰坦科技有限公司，管徑3～15 μm，管長15～50 μm）；K3[Fe（CN）6]（風船化學試劑科技有限公司，分析純）；KCl、K2HPO4、NaH2PO4（泰坦科技有限公司，分析純）；尿酸酶（泰坦科技有限公司，500U）；4 份吸毒人員實際尿樣（云南省司法鑒定中心提供）.

1.3 主要儀器所有的電化學數(shù)據(jù)由CHI 760E電化學工作站（上海辰華儀器有限公司）測得，測量時采用三電極系統(tǒng)，使用的參比電極（Ag/AgCl），Pt 絲電極，玻碳電極（GCE）均購自上海辰華.KQ-300DE 數(shù)控超聲清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；PHS-3G 恒溫加熱磁力攪拌pH 計（上海儀電科學儀器股份有限公司）；DHG-9055A 鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）；PR224ZHI 天平（奧豪斯儀器常州有限公司）；明澈TM-D 24UV 純水/超純水系統(tǒng).

1.4 實驗方法

1.4.1 MWNTs-COOH 的制備 將MWNTs 置于250 mL 圓底燒瓶中，加入100 mL 濃硝酸，于油浴鍋中90 ℃下攪拌反應(yīng)4 h.反應(yīng)結(jié)束后用去離子水洗滌至中性，烘箱內(nèi)干燥，備用.

1.4.2 MWNTs-COOH/GCE 的制備

玻碳電極的處理：首先用0.3 μm 的Al2O3加適量去離子水在麂皮上進行打磨拋光，之后使用0.05 μm 的Al2O3顆粒按上述同樣方法進行打磨拋光，然后在去離子水中超聲清洗干凈，直到CV 掃描得到的K3[Fe(CN)6]的氧化還原峰電位差小于100 mV，否則重復(fù)上述打磨拋光過程，直至CV 掃描結(jié)果滿意.將處理好的玻碳電極室溫下干燥.

MWNTs-COOH/GCE 的制備：用移液槍取適量經(jīng)水超聲分散均勻的MWNTs-COOH 分多次滴涂于處理好的GCE 表面，然后放置于紅外燈下烘烤5 min 左右，待水分揮干后羧基化碳納米管就吸附在玻碳電極表面，即制得羧基化多壁碳納米管修飾的玻碳電極(MWNTs-COOH/GCE) .

1.4.3 電化學檢測方法 采用三電極系統(tǒng)，將MWNTs-COOH/GCE 放入含有一定濃度嗎啡的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)中，用計時電流法在一定電位下富集一定時間后，使用DPV 從0.2～0.7 V 進行掃描，記錄其氧化峰電流.

每次檢測結(jié)束后，把工作電極置于去離子水中放置60 s，以去除測量時吸附在電極表面的物質(zhì).

2 結(jié)果與討論

2.1 羧基化碳納米管的修飾效果實驗對比了裸GCE 與MWNTs-COOH/GCE 在同一濃度(3.0×10?5mol/L)嗎啡溶液中的電化學響應(yīng)情況.結(jié)果表明，裸GCE 和MWNTs-COOH/GCE 上的響應(yīng)峰電流分別為4.334×10?7A 和1.342×10?5A.可見，3.0×10?5mol/L 的嗎啡在MWNTs-COOH/GCE 的響應(yīng)電流約為其在裸GCE 的31 倍.說明羧基化多壁碳納米管可作為嗎啡電化學傳感器的修飾材料，提升其檢測靈敏度.

2.2 MWNTs-COOH 修飾量的選擇MWNTs-COOH 用量過少，不能完全覆蓋GCE 電極表面；用量過多，則修飾膜過厚，容易脫落并導致背景電流過強，使嗎啡的氧化峰受到影響.適量的修飾層厚度不僅能有效提升傳感器性能，節(jié)約試劑，還可以保證修飾電極的穩(wěn)定性.為了得到較理想的滴涂量，實驗分別滴涂了2、3、4 μL 和5 μL 1 mg/mL 的MWNTs-COOH 于玻碳電極表面，制備修飾電極.結(jié)果表明，當?shù)瓮苛繛? μL 時，GCE 電極表面不能被完全覆蓋；滴涂了3、4、5 μL MWNTs-COOH 制備的修飾電極對3.0×10?5mol/L 嗎啡的響應(yīng)電流分別為5.58、9.324 μA 和8.71 μA，說明當MWNTs-COOH 的修飾量為4 μL 時，電極對嗎啡的DPV 響應(yīng)效果最好.故實驗選擇MWNTs-COOH 的滴涂量為4 μL.

2.3 富集時間與富集電位的優(yōu)化采用差分脈沖吸附溶出伏安法檢測嗎啡，富集電位與富集時間都對其響應(yīng)峰電流有較大影響.如圖1 所示，富集電位從?1.0 V 升至?0.6 V 時，峰電流有較大的提高；從?0.6 V 升至?0.2 V 時，峰電流沒有明顯差異；當富集電位從?0.2 V 繼續(xù)升高時，DPV 響應(yīng)開始大幅下降，特別是使用正電位富集時，DPV 響應(yīng)快速降低.這可能是因為負電位下玻碳電極表面羧基化碳納米管上有較多—COO?基團暴露于電極表面，便于嗎啡的吸附.為避免過低電位下一些金屬離子析出，實驗選擇?0.2V 作為富集電位.

圖1 不同富集電位下3.0×10?5 mol/L 嗎啡在MWNTs-COOH/GCE 上的峰電流響應(yīng)（富集時間300 s，pH7.0）Fig.1 Peak current of 3.0×10?5 mol/L of MOP at different preconcentration potential on the MWNTs-COOH/GCE

當固定富集電壓為?0.2 V 時，在富集時間從60 s 增加到480 s 的過程中（圖2），3.0×10?5mol/L嗎啡的氧化峰電流不斷上升，但在富集時間超過300 s 后增幅減小.考慮到檢測時間，實驗選擇富集時間為300 s.

圖2 不同富集時間下3.0×10?5 mol/L 嗎啡在MWNTs-COOH/GCE 上的峰電流響應(yīng)（富集電位?0.2 V，pH 7.0）Fig.2 Peak current of 3.0×10?5 mol/L of MOP at different preconcentration time on the MWNTs-COOH/GCE

2.4 緩沖溶液pH 的優(yōu)化嗎啡的氧化過程伴隨著H+的產(chǎn)生，所以緩沖溶液的pH 值對其氧化峰電流有影響.分別在pH 為5.8、6.5、7.0、7.5、8.0 的Na2HPO4-KH2PO4緩沖溶液中對3.0×10?5mol/L 嗎啡進行ASDPV 檢測.DPV 響應(yīng)峰電流隨Na2HPO4-KH2PO4緩沖溶液pH 值的變化如圖3 所示.可見當緩沖溶液pH 值在6.5～7.5 范圍內(nèi)時，響應(yīng)峰電流較高，且在pH7.0 時有最大值.當緩沖溶液酸性較強 (pH<6.5) 或偏堿性 (pH>7.5) 時，嗎啡的峰電流急劇下降.因此，實驗選擇pH7.0 的Na2HPO4-KH2PO4緩沖溶液為電解質(zhì)溶液.

圖3 緩沖溶液pH 對3.0×10?5 mol/L 嗎啡在MWNTs-COOH/GCE 上的峰電流響應(yīng)的影響（富集時間300 s，富集電位?0.2 V）Fig.3 Effect of pH on the MWNTs-COOH/GCE response of 3.0×10?5 mol/L MOP

2.5 標準工作曲線的繪制在最優(yōu)檢測條件下，用差分脈沖吸附溶出伏安法測定了不同濃度嗎啡的響應(yīng)峰電流，并繪制了標準工作曲線.如圖4 所示，嗎啡在MWNTs-COOH/GCE 上的峰電流隨嗎啡濃度的增加而增大.在嗎啡濃度為1.0×10?7～1.0×10?4mol/L 范圍內(nèi)，嗎啡濃度的對數(shù)值 (lgc) 與DPV 峰電流的對數(shù)值 (lgI) 呈線性關(guān)系，線性回歸方程為lg(I/μA)=0.687lg[c/(μmol·L?1)]?0.068 (r2=0.992 0).

圖4 響應(yīng)峰電流及標準工作曲線Fig.4 The pulse voltammetry and the calibration curve

2.6 MWNTs-COOH/GCE 的重現(xiàn)性及穩(wěn)定性實驗進一步研究了該傳感器的重現(xiàn)性及穩(wěn)定性.使用相同方法制備了5 支傳感器并用其在同一檢測條件下對3.0×10?5mol/L 的嗎啡進行檢測，峰電流的相對標準偏差為4.1%；用同一支電極對同一份嗎啡溶液平行測定5 次，峰電流的相對標準偏差為3.8%；將此傳感器連續(xù)使用30 次或室溫下儲存于純水中2 個月后，仍能維持最初響應(yīng)的90%以上.可見，本實驗方法制備的傳感器具有較好的重現(xiàn)性以及穩(wěn)定性.

2.7 實際樣品嗎啡的檢測直接使用MWNTs-COOH/GCE 檢測尿液中嗎啡的含量時，發(fā)現(xiàn)尿液中的尿酸有很大干擾.因此，實驗在嘗試了多種消除尿酸的方法后，選擇了用尿酸酶除去尿液中的尿酸.結(jié)果顯示，在1 mL 的尿液中加入1 mg 的尿酸酶(500 U)，然后在37 ℃水浴中酶解2 h 后，用MWNTs-COOH/GCE 檢測不到尿酸峰的存在，說明尿酸的干擾已經(jīng)消除.

將用尿酸酶消除尿酸后的實際尿樣（4 份陽性樣品）采用MWNTs-COOH/GCE 進行檢測，結(jié)果見表1 所示.可見用MWNTs-COOH/GCE 得到的檢測結(jié)果（4 次平均值）與HPLC 檢測結(jié)果的相對誤差的絕對值在4.24%以內(nèi).并通過t 檢驗法發(fā)現(xiàn)在置信度為95%時，兩種方法并無顯著性差異，說明MWNTs-COOH/GCE 可以用于實際尿樣中嗎啡的檢測.

表1 MWNTs-COOH/GCE 對實際尿樣的檢測結(jié)果Tab.1 The determination results of MOP in the drug addicts’ urine samples

3 結(jié)語

本文通過直接滴涂法制備了一個簡單的檢測傳統(tǒng)毒品嗎啡的電化學傳感器，其修飾材料為自制的羧基化碳納米管，基底電極為玻碳電極，檢測方法為差分脈沖吸附溶出伏安法.在優(yōu)化了相關(guān)檢測條件后，該傳感器在嗎啡濃度為1.0×10?7～1.0×10?4mol/L 的范圍內(nèi)，其DPV 峰電流的對數(shù)值(lgI)與嗎啡的濃度對數(shù)值 (lgc) 呈線性關(guān)系，線性回歸方程為lg(I/μA)=0.687lg[c/(μmol·L?1)]?0.068(r2=0.992 0).在使用尿酸酶除去尿液中的尿酸后，用該傳感器可以準確測定實際尿樣中嗎啡的含量，具有在公安基層中快速檢測尿液中嗎啡含量的應(yīng)用前景.