缺氧預(yù)處理的腎癌細(xì)胞來源外泌體通過ERK5 通路影響細(xì)胞增殖與凋亡

付茂輝，于 斌，孫榮凱

（1. 天津市第四中心醫(yī)院泌尿外科，天津 300000；2. 中國人民解放軍聯(lián)勤保障部第960 醫(yī)院泌尿外科，山東濟(jì)南 250031）

腎細(xì)胞癌是泌尿外科常見的腫瘤性疾病，具有發(fā)病率高，預(yù)后差等特點(diǎn)[1]。據(jù)流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，腎細(xì)胞癌的發(fā)病率約占腎臟惡性腫瘤的80%～90%。其中男性多于女性，發(fā)達(dá)國家高于發(fā)展中國家[2-3]。目前針對(duì)腎細(xì)胞癌的治療主要集中于手術(shù)切除和藥物化療，但是復(fù)發(fā)率較高，生存率較低[4-5]。對(duì)于腎細(xì)胞癌的治療，如何選取合適的治療方案，是臨床上的難點(diǎn)問題。既往研究表明，腫瘤的生物學(xué)行為與腫瘤微環(huán)境密切相關(guān)，而腫瘤的微環(huán)境主要以缺氧為主[6-7]。有研究發(fā)現(xiàn)缺氧條件可以促進(jìn)膠質(zhì)瘤外泌體的釋放，進(jìn)而促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲[8]。因此，我們對(duì)腎細(xì)胞癌細(xì)胞進(jìn)行缺氧預(yù)處理，觀察其對(duì)腎細(xì)胞癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。外泌體（exosome，EXO）是一類雙層脂質(zhì)結(jié)構(gòu)的囊泡結(jié)構(gòu)，可以由細(xì)胞分泌，攜帶大量的遺傳物質(zhì)，包括miRNA、lincRNA 和各類基因等，通過膜融合和胞吞的方式，將遺傳信息傳遞至受體細(xì)胞中，從而影響受體細(xì)胞的生物學(xué)行為[9-10]。有研究表明腫瘤細(xì)胞和基底細(xì)胞之間可以通過外泌體進(jìn)行遺傳信息的交換[11]。本研究利用CoCl2構(gòu)建腫瘤細(xì)胞的缺氧微環(huán)境，提取外泌體，利用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcriptase-polymerase chain reaction，RT-PCR)和Western blot 檢 測(cè)ERK5 和 凋 亡相關(guān)基因Bcl-2、Bad、Bax 和Caspase-3 的表達(dá)，利用CCK-8 試劑盒、Transwell 試劑盒檢測(cè)細(xì)胞的增殖和侵襲能力，從而探討缺氧微環(huán)境處理腎癌細(xì)胞來源的外泌體影響細(xì)胞增殖和凋亡的相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1. 1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞與材料本研究使用的腎癌細(xì)胞系A(chǔ)CHN 細(xì)胞是由中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所徐云博士惠贈(zèng)。DMEM培養(yǎng)液購自美國Gibco 公司；Trizol 試劑和熒光定量PCR 試 劑 盒 均 購 自 日 本TaKaRa 公 司；CCK-8 試 劑盒、Transwell 檢測(cè)試劑盒和AV-PI 檢測(cè)試劑盒均購自北京碧云天試劑公司。

1. 2 腎細(xì)胞癌細(xì)胞缺氧模型的構(gòu)建利用CoCl2 試劑構(gòu)建腫瘤細(xì)胞的缺氧微環(huán)境。以腎癌細(xì)胞系A(chǔ)CHN 細(xì)胞為研究對(duì)象，按照處理方法分成2 組，即缺氧組和正常組。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，缺氧組細(xì)胞經(jīng)濃度為100 μmol/L 的CoCl2 試劑進(jìn)行處理，構(gòu)建腫瘤細(xì)胞的缺氧模型，放置在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5% 的CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)24 h。正常組細(xì)胞為常規(guī)培養(yǎng)，無特殊處理。

1. 3 外泌體的提取采用超速離心法進(jìn)行收集上述2 組細(xì)胞的外泌體。待上述2 組細(xì)胞處理24 h 后，棄上清液，用PBS 溶液清洗3 次，更換無FBS 的DMEM培養(yǎng)基，孵育48 h，收集細(xì)胞上清液，4 ℃300 r/min，離心10 min，取上清去掉細(xì)胞，4 ℃2 000 r/min，離心20 min，取上清去掉細(xì)胞碎片，重懸后經(jīng)0.22 μm 濾器過濾，轉(zhuǎn)移至超速離心管中，4 ℃10 000 r/min，離心70 min，取沉淀。PBS 沖洗后，4 ℃100 000 r/min，離心70 min，重復(fù)3 次，—80 ℃冰箱中保存。

1. 4 透射電子顯微鏡觀察外泌體的形態(tài)取30 μL外泌體懸液，放置于載樣銅網(wǎng)上，室溫下靜置3 min，加入30 g/L 磷鎢酸溶液30 μL ，室溫下負(fù)染5 min，室溫下孵育直至銅網(wǎng)干燥，然后透射電鏡觀察并拍攝。

1. 5 Western blot 法檢測(cè)外泌體標(biāo)志物CD63 分子和CD81 分子的表達(dá)將外泌體置于EP 管中，收集各組細(xì)胞，冰上預(yù)冷10 s，加入RIPA 裂解液后，提取總蛋白，利用BCA 試劑盒確定蛋白濃度。 按照SDS-PAGE 說明書要求配置10%分離膠和5%濃縮膠，根據(jù)需要，插入分子梳。取30 μg 蛋白質(zhì)上樣，先使用80 V 電壓進(jìn)行電泳，待條帶跑至濃縮膠和分離膠的交接點(diǎn)后，改為120 V 電壓。待條帶跑至分離膠底部，停止電泳。利用PVDF 膜和濾紙進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，設(shè)置轉(zhuǎn)膜電流為200 mA，轉(zhuǎn)膜槽放到冰袋中低溫處理。轉(zhuǎn)膜成功后浸入封閉液中，搖床封閉2 h，加入CD63、CD81 分子蛋白，ERK5 和Bcl-2，Bad，Caspase-3 一抗的一抗稀釋液（Abcam 公司，克隆號(hào)：ab79559；ab271286；ab40809；ab32124；ab32445；ab184787；稀釋比例為1:10 000），4 ℃孵育過夜，TBST 溶液清洗3 次，5 min/次，加入稀釋好的HRP 二抗溶液（Abcam 公司，1∶2 000），孵育二抗，TBST 緩沖液漂洗3 次，5 min/次，加入Supersignal west femto 試劑盒顯影液，分光發(fā)光成像分析儀顯影并拍照。

1. 6 腎細(xì)胞癌細(xì)胞攝取及內(nèi)化外泌體 將收集的外泌體與100 μL 的PBS 溶液重懸后保存。將4 μL 的PKH67 加入0.5 mL 的混懸液中，在室溫下孵育10 min。然后加入1 mL 的10%BSA 溶液，利用PBS 溶液清洗3 次，5 min/次。然后利用超速離心法收集PKH67 標(biāo)記的外泌體以備用。將腎癌細(xì)胞系A(chǔ)CHN細(xì)胞接種于預(yù)先鋪有蓋玻片的24 孔板中，接種細(xì)胞量為3×105個(gè)/孔，待爬片細(xì)胞融合率＞60%時(shí)，利用PBS 溶液清洗3 次，5 min/次。然后加入PKH67 標(biāo)記的外泌體混懸液。放置在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，時(shí)間為24 h。然后取出利用40 g/L 的多聚甲醛溶液固定30 min，10 μg/mL 的DAPI 染液進(jìn)行染色，避光孵育15 min。利用PBS 溶液清洗3 次，5 min/次。利用指甲油封片，加入防淬滅劑。利用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。

1. 7 細(xì)胞分裂周期監(jiān)測(cè)采用Rose Chamber 法對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行檢測(cè)。將不同外泌體處理的ACHN 細(xì)胞接種于預(yù)先鋪有蓋玻片的24 孔板中，接種細(xì)胞量為3×105個(gè)/孔，待爬片細(xì)胞融合率＞40%時(shí)，利用PBS 溶液清洗3 次，5 min/次。接著將蓋玻片加入到活細(xì)胞觀察腔（Rose Chamber），然后加入DMEM 培養(yǎng)基。利用尼康Eclipse-Ti 熒光顯微鏡進(jìn)行實(shí)時(shí)拍攝，對(duì)細(xì)胞分裂的周期進(jìn)行監(jiān)測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，降低實(shí)驗(yàn)誤差。

1. 8 CCK-8 試劑盒檢測(cè)細(xì)胞的增殖外泌體與腎細(xì)胞癌共培養(yǎng)后，接種于96 孔板中，100 μL /孔，在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 h，然后每孔加入100 μL CCK-8試劑，37 ℃培養(yǎng)箱中孵育10 min，酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm 處的吸光度（A 值）。

1. 9 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測(cè)ERK5 和凋 亡 相 關(guān) 基 因Bcl-2、Bad、Bax 和Caspase-3 的 表達(dá)外泌體與腎癌細(xì)胞共培養(yǎng)后，利用胰蛋白酶收集上述各組細(xì)胞，經(jīng)PBS 溶液清洗3 次，常溫離心機(jī)1 500 r/min 離心5 min，取沉淀，加入1 mL Trizol 溶劑，提取細(xì)胞總RNA，保證RNA 純度范圍為1.8～2.1，然后利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的要求，采用20 μL 反應(yīng)體系逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，-80 ℃保存，采用熒光定量PCR 試劑盒的要求，采用FTC-2000 RT-PCR 系統(tǒng)和50 μg 反應(yīng)體系對(duì)樣本DNA 進(jìn)行分析，溶解曲線確定Tm 值為83.7 ℃，統(tǒng)計(jì)并記錄各組樣本的循環(huán)閾值（cycle threshold, Ct）值，采用2-△△Ct法對(duì)ERK5 和凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bad、Caspase-3 的表達(dá)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。引物設(shè)計(jì)由上海生工公司設(shè)計(jì)并檢測(cè)合格（表1）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，降低實(shí)驗(yàn)誤差。

表1 ERK5 和凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bad、Caspase-3 的引物序列

1. 10 Western blot 檢測(cè)外泌體與腎癌細(xì)胞共培養(yǎng)后，收集各組細(xì)胞，加入1 mL RIPA 細(xì)胞裂解液，各組細(xì)胞在冰上裂解30 min，收集入1.5 mL 的離心管中，在預(yù)冷4 ℃的離心機(jī)中離心，預(yù)設(shè)：5 000 r/min，5 min 后提取上清，經(jīng)95 ℃煮沸后，收集蛋白備用。按照說明書制備濃縮膠10 mL，分離膠20 mL。上樣后電泳分離，轉(zhuǎn)膜后在4 ℃冰箱避光孵育過夜（＞12 h）。經(jīng)一抗稀釋液1∶10 000 稀釋后加入樣本離子膜。第二天用PBST 稀釋液洗膜，重復(fù)3 次，加用山羊抗小鼠IgG 二抗經(jīng)二抗稀釋液1∶1 000 稀釋后孵育二抗1.5 h，用PBST 稀釋液洗膜，重復(fù)3 次，而后用DAB 顯影液處理樣本。Image J 軟件可以用來分析蛋白條帶。

1. 11 AV-PI 試劑盒檢測(cè)細(xì)胞的凋亡各組細(xì)胞處理后，利用EDTA 蛋白酶收集各組細(xì)胞，預(yù)冷PBS 溶液清洗3 次，5 min/次，300 r/min 離心后取細(xì)胞沉淀，加入100 μL buffer 進(jìn)行重置，然后根據(jù)AV-PI 試劑盒說明書的要求加入5 μL Annexin V-FITC 和10 μL PI 染液。避光孵育30 min 后，利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，降低實(shí)驗(yàn)誤差。

1. 12 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料結(jié)果用±s表示。如果符合正態(tài)分布，正常組和缺氧組的RT-PCR 檢測(cè)結(jié)果，CCK-8 細(xì)胞增殖結(jié)果和AV-PI 細(xì)胞凋亡結(jié)果等比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，P＜0.05 為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；不同時(shí)間點(diǎn)的t檢驗(yàn)調(diào)整檢驗(yàn)水準(zhǔn)為P＜0.01 具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié) 果

2. 1 缺氧環(huán)境和正常氧環(huán)境培養(yǎng)下腎癌細(xì)胞來源的外泌體的鑒定結(jié)果透射電鏡顯示，外泌體為直徑50～150 nm 的雙層膜囊泡狀結(jié)構(gòu)。Western blot 結(jié)果顯示，外泌體的分子標(biāo)志物CD81 和CD63 表達(dá)陽性（正常組及缺氧組樣本量均為1 個(gè)）（圖1）。

圖1 缺氧環(huán)境和正常氧環(huán)境培養(yǎng)下腎癌細(xì)胞來源的外泌體的鑒定

2. 2 腎癌ACHN 細(xì)胞攝取及內(nèi)化PKH67 標(biāo)記的外泌體以腎癌ACHN 細(xì)胞加入PBS 溶液作為對(duì)照，正常組細(xì)胞和缺氧環(huán)境下提取的外泌體與腎細(xì)胞癌ACHN 細(xì)胞共培養(yǎng)的過程中，可見ACHN 細(xì)胞可以攝取并內(nèi)化PKH67 標(biāo)記的外泌體。另外，缺氧組細(xì)胞內(nèi)化的外泌體數(shù)量要明顯高于正常組。（正常組、對(duì)照組、缺氧組樣本量均為1 個(gè)）（圖2）。

圖2 腎癌ACHN 細(xì)胞攝取及內(nèi)化PKH67 標(biāo)記的外泌體

2. 3 細(xì)胞分裂周期監(jiān)測(cè)結(jié)果活細(xì)胞觀察腔（Rose Chamber）技術(shù)可以清楚記錄活細(xì)胞的有絲分裂過程：在0 min 時(shí)，細(xì)胞處于細(xì)胞分裂早期；35 min 時(shí)，細(xì)胞處于細(xì)胞分裂中期；65 min 時(shí)，細(xì)胞處于細(xì)胞分裂末期(圖3)。統(tǒng)計(jì)細(xì)胞有絲分裂的時(shí)間后發(fā)現(xiàn)，缺氧組外泌體與ACHN 細(xì)胞共培養(yǎng)后，有絲分裂的時(shí)間被明顯縮短（t=7.804，P＜0.05，圖4），說明缺氧組外泌體可以通過縮短有絲分裂的時(shí)間促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖（正常組及缺氧組樣本量均為1 個(gè)）。

圖3 正常組與缺氧組不同時(shí)期的細(xì)胞有絲分裂過程

圖4 正常組與缺氧組有絲分裂的時(shí)間*：（P＜0.05）

2. 4 腎癌ACHN 細(xì)胞與缺氧環(huán)境來源外泌體共培養(yǎng)處理下的增殖結(jié)果利用CCK-8 試劑盒檢測(cè)外泌體和腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)后對(duì)細(xì)胞增殖水平的作用（正常組及缺氧組樣本量均為3 個(gè)），結(jié)果顯示，處理4 h 后，缺氧組腫瘤細(xì)胞的增殖能力要明顯高于正常組（表2）。

表2 腎癌ACHN 細(xì)胞與缺氧環(huán)境來源外泌體共培養(yǎng)處理下的增殖情況

2. 5 RT-PCR 檢測(cè)ERK5 和凋亡相關(guān)基因Bcl-2，Bad，Bax 和Caspase-3 的mRNA 相對(duì)表達(dá)水平缺氧 組 的ERK5、Caspase-3 和Bad 的mRNA 相 對(duì) 表 達(dá)水平低于正常組（t=3.829，4.003；P＜0.001），而抗凋亡因子Bcl-2 缺氧組要明顯高于正常組（t=3.834，P=0.000）（正常組及缺氧組樣本量均為3 個(gè)）（圖5）。

圖5 正常組與缺氧組ERK5 和凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bad、Bax 和Caspase-3 的mRNA 相對(duì)表達(dá)水平

2. 6 Western-blot 檢測(cè)ERK5 和凋亡相關(guān)基因Bcl-2，Bad，Bax 和Caspase-3 的蛋白表達(dá)水平 結(jié)果顯示，缺氧組的ERK5，Caspase-3 和Bad 的蛋白表達(dá)水平要明顯低于正常組（t=3.892，3.008，2.997；P均＜0.001），而抗凋亡因子Bcl-2 的蛋白表達(dá)量的比較中，缺氧組要明顯高于正常組（t=4.839，P＜0.001）（正常組及缺氧組樣本量均為1 個(gè)，圖6）。

圖6 Western Blot 檢測(cè)正常組與缺氧組ERK5 和凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bad、Bax 和Caspase-3 的蛋白表達(dá)水平

2. 7 AV-PI 試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡率缺氧組細(xì)胞凋亡率明顯低于正常組（正常組及缺氧組樣本量均為1個(gè)），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖7）。

圖7 AV-PI 試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

3 討 論

腫瘤微環(huán)境與腫瘤細(xì)胞的生物功能密切相關(guān)，類似于“種子與土壤”的關(guān)系，腫瘤微環(huán)境的變化可以影響腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡和侵襲等。隨著對(duì)腫瘤的進(jìn)一步研究，腫瘤所處的微環(huán)境也逐漸引起學(xué)者的關(guān)注。腫瘤微環(huán)境對(duì)腫瘤細(xì)胞的影響可以分成細(xì)胞成分和非細(xì)胞成分[12-13]。GE 等[14]的研究表明，腫瘤微環(huán)境的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)可以影響腎細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖和凋亡。除了免疫細(xì)胞外，腫瘤微環(huán)境的一些相關(guān)分子也會(huì)影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為，比如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β 等[15]。但是，對(duì)于非細(xì)胞的缺氧環(huán)境對(duì)腫瘤細(xì)胞行為影響的相關(guān)研究較少。本研究通過CoCl2試劑構(gòu)建腫瘤細(xì)胞的缺氧微環(huán)境，觀察缺氧環(huán)境中腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體對(duì)腫瘤細(xì)胞的影響，我們的研究發(fā)現(xiàn)，缺氧環(huán)境下，腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體較多，而且可以通過胞吞的作用被腫瘤細(xì)胞內(nèi)吞，從而進(jìn)一步影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為，比如增殖和凋亡等。

外泌體是目前研究的熱點(diǎn)問題，細(xì)胞與細(xì)胞之間、細(xì)胞與環(huán)境之間的交流可以通過外泌體攜帶相關(guān)的信號(hào)分子來實(shí)現(xiàn)。有研究表明，外泌體可以在細(xì)胞和微環(huán)境之間構(gòu)建一條“橋梁”，可以將微環(huán)境中的相關(guān)信息通過外泌體傳遞到細(xì)胞內(nèi)，也可以將細(xì)胞內(nèi)的遺傳信號(hào)通過外泌體傳遞到細(xì)胞周圍微環(huán)境中，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞與周圍微環(huán)境的信號(hào)交流[16]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)腎細(xì)胞癌周圍微環(huán)境處于缺氧環(huán)境中，可以促進(jìn)外泌體的分泌，而且外泌體可以進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，抑制細(xì)胞的凋亡。本研究利用活細(xì)胞觀察腔（Rose Chamber）技術(shù)可以清楚記錄活細(xì)胞的有絲分裂過程，統(tǒng)計(jì)細(xì)胞有絲分裂的時(shí)間后發(fā)現(xiàn)，缺氧組外泌體與ACHN 細(xì)胞共培養(yǎng)后，有絲分裂的時(shí)間被明顯縮短，本研究結(jié)果說明，缺氧組外泌體可以通過縮短有絲分裂的時(shí)間，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。

B 淋巴細(xì)胞瘤-2 基因簡(jiǎn)稱Bcl-2（B-cell lymphoma-2）和B 淋巴細(xì)胞瘤-2 基因相關(guān)啟動(dòng)子（Bad）是與凋亡密切相關(guān)的基因，其中，Bad 是促凋亡因子，而Bcl-2 是抑制凋亡因子，Caspase-3 蛋白有“死亡蛋白”的說法，Caspase-3 的激活可以促進(jìn)細(xì)胞的凋亡[17-18]。本研究通過RT-PCR 和Western blot 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，缺氧環(huán)境中的外泌體可以從mRNA 和蛋白兩個(gè)層面上抑制凋亡相關(guān)因子Bad 和Caspase-3 的表達(dá)，促進(jìn)抗凋亡因子Bcl-2 的表達(dá)，結(jié)果說明，缺氧組外泌體可以抑制細(xì)胞的凋亡。本研究還利用AV-PI 試劑盒檢測(cè)細(xì)胞的凋亡率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，缺氧組外泌體可以抑制細(xì)胞的總凋亡率。另外，我們發(fā)現(xiàn)，MAPK/ERK5 的表達(dá)量在缺氧組外泌體刺激下，其mRNA 相對(duì)表達(dá)量和蛋白表達(dá)量均明顯下降。所以，我們推測(cè)，外泌體對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)控是通過ERK5 信號(hào)通路而實(shí)現(xiàn)。既往研究表明，ERK5 信號(hào)通路可以介導(dǎo)細(xì)胞的增殖和凋亡通路，與本研究結(jié)果相同。

綜上所述，缺氧環(huán)境下，腎細(xì)胞癌細(xì)胞來源外泌體可以通過ERK5 信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞的增殖，抑制細(xì)胞的凋亡。