31種中草藥及其復方對維氏氣單胞菌體外抑菌研究

張桓橋，商寶娣，張效平，周賢君，趙 鳳，李小義，孔 杰，楊 星，陶 莎

(1.貴州省水產研究所，貴陽 550025；2.貴州省特種水產工程技術中心，貴陽 550025；3.貴州大學動物科學學院，貴陽 550025；4.貴陽市水產技術推廣站，貴陽 550025)

維氏氣單胞菌()可感染包括大口黑鱸()、尼羅羅非魚()、斑點叉尾鮰()、日本沼蝦()在內的多種經(jīng)濟水產動物，所引發(fā)的病害在全球范圍頻繁暴發(fā)，對水產養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展造成阻礙，有效防治維氏氣單胞菌的感染愈發(fā)重要?？股厥撬a養(yǎng)殖動物細菌性疾病主要防控手段，生產中抗生素的使用產生了一定的積極作用。然而，由于抗生素不能被機體完全吸收，大部分會以原形或代謝物形式進入環(huán)境，導致抗生素在環(huán)境中廣泛賦存，且部分抗生素不易降解，可在水環(huán)境中持久存在并對非目標物種產生負面影響?？股氐某掷m(xù)使用與高的殘留所構成的選擇壓力促使抗生素耐藥細菌(antibiotic resistant bacteria,ARB)和抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes,ARGs)的發(fā)生和傳播，不僅增加病害防控的成本，也對人類健康造成嚴重威脅?？股氐牟灰?guī)范使用已造成負面且深遠的影響，越來越多的病例報告表明，維氏氣單胞菌的耐藥性仍在不斷增強中。以抗生素作為水產動物細菌病害防控的主要手段已然不再完全適宜，開發(fā)綠色安全的抗生素替代品迫在眉睫。

中草藥在預防和治療動植物各種疾病方面有著重要價值，能以多機制、多靶點對病毒、細菌、真菌以及其他病原生物產生抑制甚至殺滅作用，同時可有效增強宿主動物的免疫力和抗病力，兼具治療性與保健性的作用。中草藥對耐藥菌有獨到的作用，能以消除耐藥質粒、下調耐藥基因的表達、增加細胞膜通透性、阻礙細菌生物膜形成、抑制細菌主動外排泵和β-內酰胺酶等途徑逆轉細菌耐藥性。中草藥來源廣泛、價格低廉，具有低殘留、無副作用、不污染環(huán)境等優(yōu)點，被視為抗生素的理想替代品，顯現(xiàn)出廣闊的應用前景，但如何選擇有效抗菌中藥成為近年來研究的難點。

貴州省水產研究所水生動物營養(yǎng)與疾病防治實驗室在魚類流行病學調查中發(fā)現(xiàn)，維氏氣單胞菌是貴州畢節(jié)多個養(yǎng)殖場流水養(yǎng)殖的昆明裂腹魚()潰瘍病的致病菌。為篩選對該菌有抑菌作用的中草藥及復方，本研究探究了31種中草藥對昆明裂腹魚源維氏氣單胞菌的抑菌作用，以棋盤交叉法測定抑菌活性較好的6種中草藥的聯(lián)用效果，并在此基礎上根據(jù)正交設計配伍中藥復方，以期對中草藥的運用與減少生產中抗菌藥物的使用提供參考，為維氏氣單胞菌的預防和控制提供科學指導。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

LB營養(yǎng)瓊脂、LB營養(yǎng)肉湯、MH液體培養(yǎng)基購自杭州微生物試劑有限公司；96孔板、牛津杯及其他試驗耗材購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 中草藥液的制備

五倍子、黃連、地榆、訶子、蘇木、黃芩、艾葉、大黃、連翹、鹿銜草、山楂、烏梅、白頭翁、黃藥子、石榴皮、夏枯草、敗醬草、檳榔、陳皮、虎杖、黃柏、蒲公英、紫花地丁、穿心蓮、杜仲、紅花、射干、干姜、黃芪、小茴香、茯苓31種中草藥，均購自本地中藥房。以煎煮法制備中草藥藥液，方法如下：20 g中草藥粉碎后于400 mL無菌蒸餾水中浸泡1 h，用大火煮沸后轉至文火熬制2 h，多層紗布過濾；殘渣加400 mL水同法煎煮后過濾；合并兩次濾液，煎煮濃縮至20 mL，即藥液質量濃度為1 000 mg/mL。待測中草藥液經(jīng)121 ℃、20 min滅菌，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 供試菌株

昆明裂腹魚源維氏氣單胞菌試驗菌株由貴州省水產研究所水生動物營養(yǎng)與疾病防治實驗室提供，編號為BL61C，2020年9月分離鑒定。無菌條件下，維氏氣單胞菌BL61C劃線接種于LB營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)過夜后，挑取單個菌落，接種于LB營養(yǎng)肉湯的試管中，置于生物搖床中28 ℃、175 r/min培養(yǎng)18 h，用MH液體培養(yǎng)基以麥氏比濁法將菌液濃度調整為1.0x10CFU/mL備用。

1.4 抑菌圈測定

采用牛津杯法測定抑菌圈大小。在一次性滅菌培養(yǎng)基中倒入一層滅菌MH培養(yǎng)基(約10 mL)，凝固后均勻放置4個滅菌牛津杯，再倒入MH培養(yǎng)基10～15 mL。每個平板上加200 μL備用菌液，用無菌棉棒涂抹均勻，去除牛津杯后將80 μL待測藥液加入孔中，28 ℃正置培養(yǎng)24 h。觀察結果并用游標卡尺測量抑菌圈的直徑。

1.5 最小抑菌濃度(MIC)與最小殺菌濃度(MBC)的測定

采用96孔板微量肉湯稀釋法測定待測中草藥對目的菌的MIC(圖1)。無菌條件下，取干凈96孔酶標板(A～H列×12行)，各孔加入滅菌MH肉湯100 μL，第1行的A～D列中加入待測中草藥100 μL。充分混勻后，逐次倍比稀釋至第11行，最后一列稀釋完后吸取100 μL去掉，每孔液體終體積100 μL。1～11行藥液濃度分別為500、250、125、62.5、31.25、15.63、7.81、3.91、1.95、0.98、0.49 mg/mL。A～C列的1～11行加入預備菌懸液10 μL，為試驗組；第12孔不加入菌液，為陰性對照。D列的1～11行不加入菌液，作為空白對照查看是否生長細菌；第12行加入10 μL菌液，為陽性對照驗證細菌是否正常生長；一板一藥，E～H列不做任何處理。28 ℃正置培養(yǎng)24 h后取出觀察結果，試驗組與空白對照透明度相似的濃度即為待測中草藥的MIC。

圖1 96孔板微量肉湯稀釋法圖示

取高于MIC的濃度涂布于LB營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，28 ℃倒置培養(yǎng)18 h。觀察結果，少于5個單菌落的濃度即為待測中草藥的MBC。

1.6 部分抑菌指數(shù)(FIC)測定

在1.4、1.5研究基礎，共篩選出6種抑菌作用明顯的中草藥，兩兩組合成15組二聯(lián)藥方(LY1～LY15)。采用棋盤交叉法測定聯(lián)用藥方的FIC。用滅菌MH營養(yǎng)肉湯將待測中草藥液A與B分別稀釋至2 MIC、MIC、1/2 MIC、1/4 MIC、1/8 MIC、1/16 MIC濃度，配置完成的兩種單方中草藥據(jù)表1充分混合。各孔分別加入對應濃度待測中草藥液A與B各50 μL、10 μL菌液、0.1%紅四氮唑(TTC)溶液4 μL，其中，TTC用于檢驗細菌是否生長?；旌贤瓿珊?，28 ℃正置培養(yǎng)24 h。觀察細菌生長狀況，以FIC作為聯(lián)合抑菌效果判定依據(jù)。FIC值計算如下:

表1 棋盤交叉法

1.7 復方中草藥對致病菌的體外抑菌圈測定

采用正交試驗設計復方中草藥配置(表2)。以6種中草藥作為6種因素設計正交試驗L(5^6)，分別為F1、F2、F3…F25，按比例進行配制，每組的終體積為1 000 μL，體外抑菌試驗參照前文1.4、1.5進行。

表2 復方中草藥配制表

2 結果

2.1 單一中草藥抑菌效果

31種中草藥提取液對昆明裂腹魚源維氏氣單胞菌抑菌效果各不相同(表3)。其中，五倍子、訶子2種中草藥抑菌圈直徑分別為21.80 mm、23.20 mm，抑菌效果為極敏；地榆、蘇木、黃芩、黃連、艾葉、烏梅、石榴皮、夏枯草8種中草藥抑菌圈直徑介于15.00～20.00 mm之間，抑菌效果為高敏；鹿銜草、山楂、黃藥子、白頭翁4種中草藥抑菌圈直徑為10.00～15.00 mm，抑菌效果為中敏；其余17種中草藥抑菌效果不佳或無抑菌圈。MBC試驗結果顯示，五倍子對昆明裂腹魚源維氏氣單胞菌抑殺作用最強，MIC和MBC分別為1.95、3.91 mg/mL；地榆、訶子、蘇木、黃芩、黃連5種中草藥抑殺作用明顯，MIC介于3.91～7.81 mg/mL，MBC介于7.81～15.63 mg/mL；艾葉、大黃、連翹、鹿銜草、山楂、烏梅6種中草藥抑殺作用較好，MIC均為15.63 mg/mL，MBC介于15.63～31.25 mg/mL；試驗中，在藥物濃度<500 mg/mL時，除茯苓以外，其余30種中草藥均具一定抑菌作用。

表3 31種中草藥對維氏氣單胞菌的體外抑菌效果

2.2 聯(lián)合藥敏試驗及FIC結果

以五倍子、地榆、訶子、蘇木、黃芩、黃連6種具良好抑菌作用的中草藥兩兩聯(lián)用進行FIC試驗，共15個組合(LY1～LY15)，見表4。結果表明，五倍子+地榆、訶子+黃芩聯(lián)用效果最好，F(xiàn)IC分別為0.31、0.50，表現(xiàn)為協(xié)同作用；五倍子+黃連、五倍子+訶子、黃連+訶子、黃連+黃芩、訶子+蘇木等5種組合聯(lián)用效果其次，F(xiàn)IC介于0.56～1.00之間，表現(xiàn)為相加作用；五倍子+蘇木、五倍子+黃芩、黃連+地榆等8種組合FIC介于1.06～2.00之間，表現(xiàn)為無關作用。聯(lián)用藥方(LY1～LY15)均未發(fā)生拮抗作用，僅黃芩+地榆、黃芩+蘇木聯(lián)用時FIC最大(2.00)，表明6種中草藥之間不存在藥性沖突，可進行后續(xù)復方中草藥方配伍。

表4 藥物聯(lián)合的體外抑菌結果

2.3 復方中草藥對致病菌的體外抑菌結果

將五倍子、地榆、訶子、蘇木、黃芩、黃連等6種單一中草藥按不同比例組合成25組復方(表2)，測定其對維氏氣單胞菌BL61C的體外抑菌作用(表5)。抑菌圈直徑測定結果表明，25組復方中草藥均具較好抑菌表現(xiàn)，抑菌圈直徑均大于15.00 mm，其中F7、F8、F11等11組復方抑菌圈直徑均大于20.00 mm，抑菌效果為極敏；其余14組復方抑菌圈直徑介于15.00～19.20 mm，抑菌效果為高敏。MIC與MBC試驗結果表明，25組復方均具較強抑菌效果，MIC介于0.98～3.91 mg/mL，MBC介于1.95～7.81 mg/mL。綜合復方中草藥的抑菌作用來看，F(xiàn)16(五倍子：地榆：訶子：蘇木：黃芩：黃連=4∶4∶2∶5∶3∶1)的綜合抑菌效果最佳，抑菌圈直徑達23.20 mm，MIC與MBC分別為0.98 mg/mL、1.95 mg/mL，可作為維氏氣單胞菌BL61C殺菌藥物的首選配伍組合。

表5 復方中草藥的體外抑菌結果

3 討論

本研究中，抑菌圈試驗結果表明，有14種中草藥可對維氏氣單胞菌起抑菌作用，其中五倍子、訶子等中草藥體外抑菌效果最佳，抑菌圈直徑均大于20 mm，抑菌等級為極敏；MIC和MBC試驗結果表明，在藥物濃度<500 mg/mL時，五倍子、地榆、訶子、蘇木、黃芩、黃連的抑菌能力較強，MIC均小于7.81 mg/mL，MBC均小于15.63 mg/mL。Aggarwal等研究認為，抗菌藥物的抑菌直徑與最小抑菌濃度呈負相關，即抑菌圈越大則MIC濃度越小。試驗中多數(shù)中草藥的抑菌綜合表現(xiàn)符合這一結論，但部分中草藥抑菌直徑與MIC不成規(guī)律，如大黃的MIC為15.63 mg/mL，而抑菌圈直徑僅為9.00 mm；白頭翁的MIC為31.25 mg/mL，抑菌圈直徑僅為10.45 mm；連翹的MIC為15.63 mg/mL，但無抑菌圈，這可能與藥物在不同介質中的擴散能力與菌-藥有效接觸面積有關。本研究結果表明，抑菌圈測試對中草藥的抑菌能力的解釋可能稍顯不足，故在篩選中草藥時需綜合考量抑菌圈直徑、MIC與MBC等參數(shù)。綜合抑菌試驗結果，五倍子、地榆、訶子、蘇木、黃芩、黃連等中草藥，可作為昆明裂腹魚源維氏氣單胞菌防治的理想中草藥。

傳統(tǒng)中藥重視增效、減毒(相殺相畏配伍)，避免減效(相惡配伍/十八反)、增毒(相反配伍/十九畏)。查閱《神農本草經(jīng)》，本研究選用的6種中草藥之間不存在配伍禁忌，可進行相互之間的配伍組合。以具良好抑菌作用的五倍子、地榆、訶子、蘇木、黃芩、黃連進行FIC試驗，聯(lián)用藥方(LY1～LY15)均未發(fā)生拮抗作用，6種待測中草藥之間不存在藥性沖突。張彬等研究認為，黃芩與黃連聯(lián)用會發(fā)生拮抗作用，與本研究黃連與黃芩聯(lián)用后的相加表現(xiàn)不同，出現(xiàn)差異的原因可能與菌株來源及種類、藥物產地與炮制方法有關。

本研究結果顯示，復方中草藥的整體抑菌效果較單方更好。復方中草藥抑菌圈直徑均大于15.00 mm，抑菌等級為高敏或極敏；部分組方抑菌圈較五倍子、訶子單一作用時小，這可能與多種中草藥聯(lián)用時發(fā)生物理、化學反應或作用位點競爭導致的抑菌活性成分損失或擴散速率下降有關，也可能與單方中草藥的單位體積有效成分多于在組方中的含量，混合后抑菌成分含量減少存在聯(lián)系。復方中草藥MIC/MBC試驗結果提示，合理的配伍可提高中草藥對維氏氣單胞菌的體外抑菌作用，這對降低藥物成本、減少藥物使用及殘留具有重要作用。綜合整體抑菌結果，復方F16(五倍子∶地榆∶訶子∶蘇木∶黃芩∶黃連=4∶4∶2∶5∶3∶1)可作為維氏氣單胞菌BL61C抑菌藥物的首選配伍組合，但抑菌作用機制及組分協(xié)作方式亟待進一步研究。本研究以簡便的煎煮法制備31種中草藥水提取液并配制復方，初步研究它們對維氏氣單胞菌BL61C的抑菌性質，然而，生產中中草藥常以浸泡后播撒、飼料添加劑或成品獸藥等多種形式使用，制備與使用方式的不同是否會對其抑菌能力產生顯著影響尚不清楚，故中草藥開發(fā)為臨床獸藥還需結合中草藥的物質特性及適宜制備工藝多加論證。