利用譜系追蹤方法探究Lgr5在胰腺組織及其類器官中的表達

閆炳儒，艾顯輝，劉淼，田麗紅，梁洋，滕春波

研究報告

利用譜系追蹤方法探究Lgr5在胰腺組織及其類器官中的表達

閆炳儒1，艾顯輝1，劉淼1，田麗紅2，梁洋1，滕春波1

1. 東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150040 2. 東北林業(yè)大學(xué)野生動物保護與自然保護地學(xué)院，哈爾濱 150040

富含亮氨酸重復(fù)序列G蛋白偶聯(lián)受體5 (leucine-rich repeat containing G protein-coupled receptor 5, Lgr5)在體內(nèi)分布廣泛，可以作為多種上皮組織(包括小腸、結(jié)腸、胃和毛囊)中干細(xì)胞的標(biāo)記物。為了探究小鼠()胰腺發(fā)育過程中導(dǎo)管上皮細(xì)胞及體外培養(yǎng)的胰腺導(dǎo)管類器官中Lgr5的表達情況，本研究利用Lgr5-CreERT2+/–和Rosa26-mTmG雜交后的轉(zhuǎn)基因小鼠，經(jīng)Tamoxifen (他莫昔芬)誘導(dǎo)后，觀察不同發(fā)育階段胰腺組織切片的熒光表達情況，并通過三維培養(yǎng)建立成體小鼠胰腺導(dǎo)管類器官，觀察誘導(dǎo)后類器官細(xì)胞中的熒光變化。結(jié)果顯示：Tamoxifen誘導(dǎo)的正常成體轉(zhuǎn)基因小鼠胰腺導(dǎo)管內(nèi)未檢測到表達Lgr5的細(xì)胞；通過對孕鼠及哺乳母鼠注射Tamoxifen，在胚胎發(fā)育15.5 d和新生小鼠胰腺中也未發(fā)現(xiàn)Lgr5陽性細(xì)胞；但是將4-hydroxy- Tamoxifen (4-羥基–他莫昔芬)添加到培養(yǎng)基中，在Lgr5-CreERT2+/–;Rosa26-mTmG轉(zhuǎn)基因小鼠胰腺導(dǎo)管來源的類器官中檢測到部分細(xì)胞表達Lgr5。本研究結(jié)果證實，在成體及胚胎胰腺組織中沒有檢測到Lgr5表達，但在體外培養(yǎng)的胰腺導(dǎo)管類器官細(xì)胞中檢測到Lgr5表達。本研究為探索胰腺發(fā)育過程中干/祖細(xì)胞特異性表達基因奠定了基礎(chǔ)。

胰腺；導(dǎo)管；Lgr5；類器官；譜系追蹤

富含亮氨酸重復(fù)序列G蛋白偶聯(lián)受體5 (leucine rich repeat containing G protein-coupled receptor 5, Lgr5)，又名GPR49、HG38、FEX、GPR67和MGC117008，屬于糖蛋白激素受體類，是Wnt激動劑R-spondins的受體，在體內(nèi)廣泛分布，已經(jīng)證明其可以作為小腸、胃、肝臟等多個組織中成體干/祖細(xì)胞的標(biāo)記物。利用Lgr5-CreERT2小鼠()，Barker等[1]成功標(biāo)記了小腸中的干細(xì)胞。R-spondins信號在離體類器官形成過程中具有重要作用。已有研究發(fā)現(xiàn)，R-spondins通過激活Lgr5，促進肺、胃、肝、腸、乳腺等多種組織干/祖細(xì)胞形成類器官(organoid)[2,3]。

胰腺是人體重要的消化器官，與小腸、肝臟相同，均起源于內(nèi)胚層形成的原始腸管[4,5]。胰腺由內(nèi)、外分泌細(xì)胞組成，外分泌細(xì)胞產(chǎn)生的分泌酶進入消化道，內(nèi)分泌細(xì)胞產(chǎn)生的激素進入血液[6]。目前，成體胰腺組織中是否有多能干/祖細(xì)胞及其亞細(xì)胞定位一直存在爭議。Gu等[7]研究認(rèn)為，成體胰腺中的β細(xì)胞主要通過自我復(fù)制產(chǎn)生，而不是來源于干細(xì)胞。也有研究發(fā)現(xiàn)，成人胰腺導(dǎo)管中存在干/祖細(xì)胞，能夠介導(dǎo)胰腺再生[8]。近年來利用類器官培養(yǎng)技術(shù)，Huch等[9]獲得胰腺導(dǎo)管類器官，但是在成體胰腺導(dǎo)管中沒有檢測到Lgr5陽性細(xì)胞，然而在胰腺結(jié)扎導(dǎo)管造成的胰腺損傷組織中的導(dǎo)管細(xì)胞有Lgr5表達。但是，小鼠早期發(fā)育過程中的胰腺祖細(xì)胞是否存在Lgr5表達目前仍不清楚。

為了探討小鼠胰腺發(fā)育過程中導(dǎo)管上皮細(xì)胞及體外培養(yǎng)的胰腺導(dǎo)管類器官中Lgr5的表達情況，本研究利用譜系追蹤方法，探究了Lgr5-CreERT2+/–；Rosa26-mTmG轉(zhuǎn)基因小鼠在胰腺發(fā)育過程中上皮細(xì)胞Lgr5的表達情況，進一步分離轉(zhuǎn)基因小鼠胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)獲得小鼠胰腺導(dǎo)管類器官(mouse pancreatic duct organoid, mPDO)，利用4-hydroxy-Tamoxifen誘導(dǎo)類器官中Cre酶對floxed (flanked)序列的切除，通過觀察熒光變化鑒定是否存在Lgr5的表達。本研究為發(fā)掘胰腺發(fā)育過程中干/祖細(xì)胞特異性表達基因，及胰腺類器官的開發(fā)應(yīng)用等奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

Lgr5-CreERT2+/–轉(zhuǎn)基因小鼠購自賽業(yè)(蘇州)生物科技有限公司，Rosa26-mTmG轉(zhuǎn)基因小鼠為本實驗室自有，飼養(yǎng)在東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院SPF級實驗動物室。動物實驗經(jīng)東北林業(yè)大學(xué)實驗動物管理與倫理委員會審查，符合倫理原則。Lgr5-CreERT2+/–是具有Lgr5-Cre等位基因的小鼠，表達CreERT2蛋白。Lgr5-CreERT2+/–與Rosa26-mTmG轉(zhuǎn)基因小鼠交配產(chǎn)生后代，經(jīng)Tamoxifen誘導(dǎo)后Cre介導(dǎo)的重組將導(dǎo)致后代Lgr5表達細(xì)胞中floxed序列的缺失，該小鼠可用于譜系追蹤，也可用于標(biāo)記表達Lgr5的干/祖細(xì)胞。Rosa26-mTmG小鼠在Cre重組之前，在細(xì)胞/組織中廣泛表達細(xì)胞膜定位的tdTomato (mT)紅色熒光蛋白，發(fā)生Cre重組后，細(xì)胞膜定位的EGFP (mG)熒光表達取代了紅色熒光。本研究使用基因型為Lgr5-CreERT2+/–和Rosa26-mTmG的成年小鼠，經(jīng)過合籠繁殖出實驗所需要的小鼠，最終所需的轉(zhuǎn)基因小鼠基因型為Lgr5-CreERT2+/–; Rosa26-mTmG。

1.2 Lgr5-CreERT2+/–; Rosa26-mTmG轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建

選擇健康狀況良好且處于發(fā)情期的Lgr5- CreERT2+/–雄鼠和Rosa26-mTmG雌鼠，雄∶雌為1∶2或1∶3比例合籠，小鼠過了斷奶期分開獨自籠養(yǎng)，直到小鼠性成熟。具體構(gòu)建模式見圖1。

1.3 小鼠總DNA提取及PCR鑒定

剪取小鼠尾尖(大約0.4～0.6 cm)迅速轉(zhuǎn)移至研缽加入液氮研磨，直至樣品變?yōu)榘咨勰?。將研磨好的組織粉末移至經(jīng)過預(yù)冷的1.5 mL EP管中，并加入180 μL Buffer GTL，20 μL Proteinase K，渦旋震蕩使樣品徹底混勻，56℃消化。根據(jù)DNA提取試劑盒(CW2298M，北京CWBIO公司)說明提取鼠尾DNA。

設(shè)計基因引物，基因引物由賽業(yè)(蘇州)生物科技有限公司提供(各引物信息見表1)進行樣品DNA的PCR檢測。構(gòu)建15 μL PCR擴增體系，包括7.5 μL PCR Master Mixture (2×，P222-AA，南京Vazyme公司)、1 μL上游引物和1 μL下游引物、1 μL DNA模板和4.5 μL ddH2O。采用如下程序進行PCR擴增反應(yīng)：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，67℃退火35 s，72℃延伸45 s，35個循環(huán)；最后再72℃延伸5 min。

1.4 Tamoxifen誘導(dǎo)

將Tamoxifen (CAS#10540-29-1，美國Sigma公司)以20 mg/mL的濃度配于玉米油中，37℃避光加熱1 h后分裝避光保存至4℃冰箱，以腹腔注射的方式，參照THE JACKSON LABORATORY建議劑量[10,11]，每只小鼠按100 μL/d的劑量注射Tamoxifen，連續(xù)注射5 d。注射停止一周后收集小鼠組織樣本進行切片。

在小鼠胚胎期8.5 d (Embryo 8.5 day，E8.5 d)，發(fā)育的內(nèi)胚層中假定的胰腺和肝臟開始發(fā)生分離。為了觀察胰腺胚胎發(fā)育時期Lgr5的表達情況，取7～8周齡發(fā)情的Lgr5-CreERT2+/–與Rosa26-mTmG小鼠合籠，次日早上檢測陰道栓，見栓鼠記E0.5 d，于胰腺祖細(xì)胞活躍期E9.5 d對孕鼠腹腔注射100 μL Tamoxifen注射液，每24 h注射一次，連續(xù)注射6 d，第7 d收集E15.5 d胎鼠胰腺組織及小腸組織冰凍切片進行觀察。取7～8周齡健康的Lgr5-CreERT2+/–與Rosa26-mTmG小鼠合籠，新生小鼠出生當(dāng)日記第0 d，出生后24 h給哺乳母鼠注射Tamoxifen，每只哺乳母鼠腹腔注射100 μL Tamoxifen注射液，每24 h注射一次，連續(xù)注射7 d，第8 d收集新生小鼠胰腺組織及小腸組織冰凍切片進行觀察。

1.5 小鼠組織的冰凍切片

利用過量注射戊巴比妥鈉(P11011，美國Merck公司)麻醉處死Lgr5-CreERT2+/–; Rosa26-mTmG小鼠，75%的消毒酒精浸潤。從小鼠腹部剪開，取出小腸及胰腺組織。將取出的組織放入1×PBS清洗去掉血漬，然后在解剖顯微鏡下剔除多余的脂肪組織等。將上述處理干凈的胰腺組織放于4%PFA溶液中固定20 min，用30%質(zhì)量比的蔗糖脫水過夜。用冰凍切片包埋劑(OCT)將胰腺組織進行包埋。將包埋好的樣品冰凍切片做好標(biāo)記，–80℃凍存。

圖1 Lgr5-CreERT2+/–; Rosa26-mTmG小鼠繁育模式圖

表1 PCR引物

F：forward primer；R：reverse primer。

1.6 免疫染色

Lgr5-CreERT2+/–；Rosa26-mTmG成鼠、E15.5胎鼠及新生鼠的小腸、胰腺、胰腺導(dǎo)管組織和類器官冰凍切片于37℃雜交箱放置20～30 min進行烘片，1×PBS洗3遍，每次10 min，洗掉殘留的OCT。4%PFA于37℃固定20 min，除去PFA。用0.3%TritonX 100在37℃孵育20 min。10%HSA (馬血清)于37℃封閉50 min。I抗4℃孵育過夜，I抗包括Lgr5 (1∶100，bs-20746R，北京Bioss公司)和Insulin (1∶100，AF1159，上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。II抗Alexa Fluor 488標(biāo)記的驢抗兔IgG H&L (1∶100，bs-0295D- AF488，北京Bioss公司) 37℃孵育1 h，后面全程避光。經(jīng)DAPI (1∶1000，33259，德國Biofroxx公司)染核5 min。防淬滅劑封片，4℃暗盒短暫保存。

1.7 小鼠胰腺導(dǎo)管類器官的培養(yǎng)

處死成體Lgr5-CreERT2+/–；Rosa26-mTmG轉(zhuǎn)基因小鼠后，剝離胰腺的主導(dǎo)管，用于類器官的制備。將胰腺主導(dǎo)管置于15 mL離心管，2 mg/mL膠原酶IV于37℃消化15 min，分離導(dǎo)管周圍殘留的組織，劇烈搖晃離心管。將消化好的胰腺主導(dǎo)管重新置于含有無菌PBS的10 cm皿中。利用解剖鏡剝離殘留在導(dǎo)管周圍的組織，PBS沖洗以保證去除多余組織。置于不同的無菌1.5 mL離心管中，用解剖剪刀將胰腺導(dǎo)管盡可能的剪碎，加入2 mg/mL膠原酶IV共1 mL，37℃消化20 min，用1 mL槍頭反復(fù)吹打。將消化好的導(dǎo)管細(xì)胞于水平離心機300離心5 min。無菌PBS洗3遍，水平離心機300離心5 min。Matrigel基質(zhì)膠(美國Corning公司)于前一天4℃放置過夜，使其充分溶解成液態(tài)，再用預(yù)冷的槍頭吸取Matrigel，重懸消化好的導(dǎo)管細(xì)胞，滴于培養(yǎng)板中心，形成一個半球形的凝膠進行三維(three- dimensional, 3D)培養(yǎng)。將培養(yǎng)板于37℃放置10 min，使Matrigel凝固，加入小鼠類器官擴增培養(yǎng)基(mouse expansion medium, mEM)，在37℃含有5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，隔天需更換新鮮mEM培養(yǎng)基。mEM主要成分包括D/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基、1%青霉素-鏈霉素、1%Glutamax (美國Hyclone公司)、2%B27 Supplementminus VA (美國Thermo公司)、100 ng/mL R-Spondin-1 (RSPO1，美國R&D公司)、50 ng/mL EGF、25 ng/mL Noggin、100 ng/mL FGF10 (美國Peprotech公司)、1 mmol/L N-acetylcysteine和10 mmol/L Nicotinamide (美國Sigma公司)。

誘導(dǎo)類器官表達Lgr5實驗中使用含有500 nmol/L 4-hydroxy-Tamoxifen (CAS#68047-06-3，美國Sigma公司)的mEM培養(yǎng)mPDO 7～10 d左右，利用熒光顯微鏡觀察類器官熒光變化。

1.8 類器官細(xì)胞冰凍切片的制備步驟

去除類器官培養(yǎng)過程中mEM培養(yǎng)液，加入常溫PBS清洗。加入4%PFA，室溫固定15 min。去除PFA后用勺子將含有類器官的Matrigel凝膠放入含有30%蔗糖(PBS配制)的50 mL離心管中，4℃過夜，直至凝膠沉到管底。從蔗糖溶液中取出凝膠，放入含有OCT化合物的模具中，OCT完全凝固后放于–80℃冰箱保存。利用恒溫冷凍切片機切割制備好的類器官模具，制備約10 μm的細(xì)胞切片，可放于–80℃冰箱保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 Lgr5-CreERT2+/–; Rosa26-mTmG轉(zhuǎn)基因小鼠的獲得與鑒定

本研究將Lgr5-CreERT2+/–小鼠與Rosa26-mTmG小鼠雜交，獲得基因型為Lgr5-CreERT2+/–; Rosa26- mTmG目的轉(zhuǎn)基因小鼠(圖1)。通過該方法獲得譜系追蹤小鼠后，利用NCBI數(shù)據(jù)庫查詢基因序列并設(shè)計引物，引物由賽業(yè)生物公司提供(表1)。提取小鼠鼠尾DNA作為模板，進行PCR擴增，用2%瓊脂糖凝膠鑒定小鼠基因型。PCR擴增結(jié)果顯示，目的條帶為174 bp，與吻合，該結(jié)果顯示已經(jīng)獲得Lgr5-CreERT2+/–;Rosa26- mTmG轉(zhuǎn)基因小鼠，可用于后續(xù)實驗(圖2)。

2.2 譜系追蹤顯示成鼠胰腺組織沒有Lgr5表達

已有研究表明Lgr5可以用來標(biāo)記小腸、胃和毛囊組織中的干細(xì)胞[12,13]。因此本研究利用Lgr5- CreERT2+/–; Rosa26-mTmG轉(zhuǎn)基因小鼠觀察成體胰腺組織中上皮細(xì)胞Lgr5的表達情況。將7～8周齡轉(zhuǎn)基因鼠通過注射Tamoxifen激活體內(nèi)Cre酶的活性，連續(xù)注射5 d，注射結(jié)束7 d后收集小腸及胰腺導(dǎo)管組織(圖3A)，其中小腸組織作為陽性對照。結(jié)果顯示，小腸切片中觀察到大量EGFP表達細(xì)胞(圖3B)，證明小鼠體內(nèi)Lgr5啟動的Cre酶具有有效的酶活性。將轉(zhuǎn)基因小鼠的胰腺組織進行連續(xù)切片，導(dǎo)管中未檢測到明顯的EGFP表達(圖3B)。以上結(jié)果暗示：在正常的成體小鼠中胰腺導(dǎo)管上皮中沒有Lgr5表達。

圖2 Lgr5-CreERT2+/–; Rosa26-mTmG轉(zhuǎn)基因小鼠PCR鑒定結(jié)果

M：DL2000 DNA marker；1：GAPDH，200 bp；2：CreERT2基因鑒定PCR產(chǎn)物，542 bp；3：Lgr5突變體基因鑒定PCR產(chǎn)物，174 bp；4：Lgr5野生型基因鑒定PCR產(chǎn)物，298 bp；5：mTmG純合突變體基因鑒定PCR產(chǎn)物，250 bp；0：negative control。

圖3 Lgr5-CreERT2+/–; Rosa26-mTmG成鼠胰腺組織Lgr5表達分析

A：Tamoxifen給藥模式圖；B：熒光顯微鏡觀察Lgr5-CreERT2+/–; Rosa26-mTmG小鼠小腸及胰腺導(dǎo)管切片。小腸切片顯示有EGFP表達細(xì)胞，證明Tamoxifen誘導(dǎo)成功。EGFP標(biāo)記Lgr5-CreERT2，顯示為綠色；tdTomato標(biāo)記細(xì)胞膜，顯示為紅色；DAPI染細(xì)胞核，顯示為藍色；比例尺：100 μm。

2.3 譜系追蹤顯示新生鼠及E15.5 d胎鼠胰腺組織沒有Lgr5表達

成體小鼠的胰腺導(dǎo)管內(nèi)未檢測到Lgr5的表達，為進一步探究在增殖和分化活躍的胚胎期或出生后是否有Lgr5標(biāo)記的祖細(xì)胞，本研究通過Tamoxifen誘導(dǎo)制備E15.5 d胎鼠及新生小鼠胰腺及胰腺導(dǎo)管切片(圖4A，圖5A)，觀察胰腺發(fā)育過程中Lgr5的表達情況，小腸上皮切片作為陽性對照。結(jié)果顯示，制備的胎鼠及新生鼠的小腸中廣泛表達Lgr5，而胰腺及胰腺導(dǎo)管中沒有檢測到EGFP的表達(圖4B，圖5B)，暗示在小鼠胰腺胚胎和新生時期的胰腺組織中Lgr5也不表達。

2.4 Lgr5-CreERT2+/–; Rosa26-mTmG轉(zhuǎn)基因小鼠胰腺導(dǎo)管類器官的培養(yǎng)

通過分離Lgr5-CreERT2+/–; Rosa26-mTmG小鼠原代胰腺導(dǎo)管細(xì)胞，經(jīng)剪碎及胰酶消化，利用Matrigel進行3D培養(yǎng)，制備mPDO，其中mEM(小鼠類器官擴增培養(yǎng)基)參考Barker等[12]建立的小鼠類器官培養(yǎng)成份，通過加入小鼠EGF及RSPO1等類器官生長的必需因子，可以觀察到mPDO增殖形成閉合結(jié)構(gòu)，隨后閉合結(jié)構(gòu)不斷擴增，最終形成較大的囊狀類器官。擴大的囊狀類器官經(jīng)過吹打消化形成單細(xì)胞之后，按1∶3～1∶5比例傳代培養(yǎng)，結(jié)果顯示依舊可以保持正常增殖傳代能力(圖6)。

圖4 Lgr5-CreERT2+/–; Rosa26-mTmG E15.5 d胎鼠胰腺組織Lgr5表達分析

A：Tamoxifen給藥模式圖；B：熒光顯微鏡觀察Lgr5-CreERT2+/–; Rosa26-mTmG E15.5 d胎鼠小腸及胰腺切片圖。EGFP標(biāo)記Lgr5-CreERT2，顯示為綠色；tdTomato標(biāo)記細(xì)胞膜，顯示為紅色；DAPI染細(xì)胞核，顯示為藍色；比例尺：100 μm。

圖5 Lgr5-CreERT2+/–; Rosa26-mTmG新生小鼠胰腺組織Lgr5表達分析

A：Tamoxifen給藥模式圖；B：熒光顯微鏡觀察Lgr5-CreERT2+/–;Rosa26-mTmG新生小鼠小腸，胰腺導(dǎo)管和胰腺切片圖。EGFP標(biāo)記Lgr5-CreERT2，顯示為綠色；tdTomato標(biāo)記細(xì)胞膜，顯示為紅色；Insulin標(biāo)記胰腺β細(xì)胞，顯示為白色；DAPI染細(xì)胞核，顯示為藍色；比例尺：100 μm。

圖6 mPDO生長及傳代培養(yǎng)

比例尺：100 μm。

2.5 譜系追蹤顯示小鼠胰腺導(dǎo)管類器官有Lgr5表達

本研究在成體小鼠、新生鼠及E15.5 d胎鼠的胰腺導(dǎo)管內(nèi)均未檢測到Lgr5的表達。由于Lgr5廣泛用作類器官的特異性標(biāo)記，因此本研究通過觀察譜系特異性的熒光變化，鑒定Lgr5的表達情況。首先制備了Lgr5-CreERT2+/–; Rosa26-mTmG小鼠胰腺導(dǎo)管類器官，在培養(yǎng)基中加入4-hydroxy-Tamoxifen進行培養(yǎng)，在第7 d，與未添加4-hydroxy-Tamoxifen組相比(圖7A)，4-hydroxy-Tamoxifen培養(yǎng)組觀察到明顯的EGFP表達(圖7B)，說明胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞在體外3D培養(yǎng)后生成表達Lgr5的細(xì)胞。

3 討論

糖尿病是功能性β細(xì)胞量嚴(yán)重減少的結(jié)果[14]，目前細(xì)胞療法有望成為糖尿病的潛在治療方法。但尋找成體胰腺干/祖細(xì)胞一直飽受爭議，也存在很多技術(shù)限制，因此利用類器官培養(yǎng)技術(shù)獲得具有干細(xì)胞潛能的胰腺類器官已經(jīng)成為疾病模型建立、研究損傷再生及胰島移植新的細(xì)胞資源[15～17]。

本研究利用3D培養(yǎng)技術(shù)建立了小鼠胰腺導(dǎo)管類器官(mPDO)培養(yǎng)系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)mPDO表達干細(xì)胞標(biāo)志基因。利用譜系追蹤方法探討胰腺發(fā)育過程中導(dǎo)管上皮細(xì)胞Lgr5體內(nèi)表達情況，發(fā)現(xiàn)在正常成體小鼠的胰腺導(dǎo)管沒有Lgr5的表達；在增殖和分化活躍的胚胎期和新生小鼠胰腺中也未發(fā)現(xiàn)表達Lgr5的細(xì)胞；但在Lgr5-CreERT2+/–; Rosa26-mTmG小鼠的原代胰腺導(dǎo)管類器官中檢測到Lgr5的表達。

細(xì)胞譜系追蹤(cell lineage tracing)是一種對動物特定細(xì)胞進行追蹤的技術(shù)[18,19]，基于Cre-系統(tǒng)，可以在組織或細(xì)胞中的任何時間進行特異性Tamoxifen誘導(dǎo)以對細(xì)胞進行特殊標(biāo)記，通過檢測標(biāo)記物來研究被標(biāo)記細(xì)胞的遷移、改變或存在與否等問題[20～23]。本研究所選用的Rosa26-mTmG轉(zhuǎn)基因小鼠是一種基于Cre-系統(tǒng)的條件基因靶向標(biāo)記的雙熒光蛋白報告小鼠模型，在Cre酶介導(dǎo)切除之前，細(xì)胞膜特異性表達tdTomato紅色熒光蛋白，當(dāng)Cre介導(dǎo)切除后，細(xì)胞膜轉(zhuǎn)變?yōu)樘禺愋员磉_EGFP綠色熒光蛋白[18,23～25]。本研究通過雜交獲得Lgr5- CreERT2+/–; Rosa26-mTmG轉(zhuǎn)基因小鼠，經(jīng)PCR檢測發(fā)現(xiàn)目的條帶與預(yù)期大小吻合(圖2)；小腸切片作為陽性對照，觀察到EGFP的表達，說明小鼠體內(nèi)Tamoxifen能有效誘導(dǎo)Cre酶切割位點，從而反映存在內(nèi)源性Lgr5表達。

Lgr5屬于糖蛋白激素受體類，是Wnt激動劑R-spondins受體，既可以作為小腸、胃、肝臟等多個組織中成體干/祖細(xì)胞的標(biāo)記物，也可以作為機體(腫瘤)干細(xì)胞的標(biāo)記物，參與Wnt等信號通路維持細(xì)胞自我更新，調(diào)控分化、增殖、遷移、極性以及凋亡等[12,18,22]。目前在自我更新率低的內(nèi)胚層來源器官中未觀察到Lgr5的表達，如肝臟或胰腺。但是在肝臟和胰腺損傷后的再生組織中，檢測到Lgr5標(biāo)記的祖細(xì)胞群[26,27]。本研究結(jié)果顯示，在成體小鼠胰腺中未觀察到Lgr5表達，與Huch等[26]研究結(jié)果一致。我們推測在增殖和分化活躍的胚胎期或新生小鼠中，胰腺組織可能會含有Lgr5標(biāo)記的祖細(xì)胞，然而本研究結(jié)果顯示，在胚胎E15.5 d和新生小鼠的胰腺組織也不表達Lgr5。但是最新的研究報道，在妊娠晚期及分娩后母鼠的胰腺中有Lgr5的表達，該研究推測妊娠相關(guān)的信號以及妊娠損傷可能會誘導(dǎo)導(dǎo)管附近的胰腺干/祖細(xì)胞增殖、分化，進而導(dǎo)致Lgr5表達[28]。但在正常小鼠胰腺導(dǎo)管中，無論是成體還是胎鼠或新生鼠，均沒有發(fā)現(xiàn)Lgr5陽性細(xì)胞存在，暗示不適合作為標(biāo)記胰腺祖細(xì)胞的特異基因。

圖7 Lgr5-CreERT2+/–; Rosa26-mTmG小鼠胰腺導(dǎo)管類器官Lgr5表達分析

A：熒光顯微鏡觀察Lgr5-CreERT2+/–; Rosa26-mTmG成鼠制備的mPDO；B：體外使用4-hydroxy-Tamoxifen誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d后的mPDO。EGFP標(biāo)記Lgr5-CreERT2，顯示為綠色；tdTomato標(biāo)記細(xì)胞膜，顯示為紅色；BF：明場(bright field)；比例尺：100 μm。

本研究進一步利用Lgr5-CreERT2+/–; Rosa26-mTmG小鼠原代胰腺導(dǎo)管細(xì)胞進行類器官培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)有表達Lgr5陽性細(xì)胞出現(xiàn)，且這些Lgr5標(biāo)記的細(xì)胞可以長期在體外擴增，與Barker等[12]研究結(jié)果一致。這些結(jié)果暗示，在類器官培養(yǎng)過程中，Wnt信號通路可能被激活進而促使干細(xì)胞標(biāo)志物L(fēng)gr5表達上調(diào)。

綜上所述，本研究證明Lgr5不適合作為胰腺干/祖細(xì)胞的特異基因，但可以作為胰腺導(dǎo)管類器官的潛在標(biāo)記物。本研究結(jié)果為干/祖細(xì)胞的特異基因的發(fā)掘，及利用胰腺類器官治療糖尿病等胰腺疾病提供了新的思路。

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Study on Lgr5 expression in pancreas tissues and organoids by lineage tracing

Bingru Yan1, Xianhui Ai1, Miao Liu1, Lihong Tian2, Yang Liang1, Chun-Bo Teng1

Leucine rich repeat containing G protein-coupled receptor 5(Lgr5) is widely expressed in multiple tissues and can be used as a stem cell marker in a variety of epithelial organs (including the small intestine, colon, stomach and hair follicles). In this study, we used Lgr5-CreERT2+/–and Rosa26-mTmG hybridized transgenic mice to investigate the expression of Lgr5 in both ductal epithelial cells during pancreas development andcultured pancreatic duct organoids. After induction with Tamoxifen, the Lgr5 expression was analyzed by detecting the enhanced green fluorescence protein in the pancreatic tissue sections in adult animals and embryos at different developmental stages. The results showed that Lgr5 expression was detected neither in adult pancreatic duct epithelia nor in the embryonic pancreatic tissues at day 15.5 or in newborn mice. However, when 4-hydroxy-Tamoxifen was supplemented to the culture medium, EGFP could be detected in the primary pancreatic duct organoids from Lgr5-CreERT2+/–; Rosa26-mTmG mice. These results suggested that Lgr5 was not expressed in adult and embryonic pancreatic tissues; but could be expressed in the cultured pancreas ductal organoids. The research lays the foundation for exploring specific gene expression patterns in stem/progenitor cells during pancreatic development.

pancreas; duct; Lgr5; organoid; lineage tracing

2022-01-26;

2022-03-26;

2022-04-18

國家自然科學(xué)基金面上項目(編號：32072801)資助[Supported by the National Natural Science Foundation of China (No.32072801)]

閆炳儒，在讀碩士研究生，專業(yè)方向：生物學(xué)。E-mail: heylr5553@163.com

滕春波，博士，教授，研究方向：細(xì)胞生物學(xué)。E-mail: chunboteng@nefu.edu.cn

10.16288/j.yczz.22-022

(責(zé)任編委: 趙冰)