應(yīng)用古DNA技術(shù)探究發(fā)酵微生物的適應(yīng)、演化和馴化歷史

鄭澤權(quán)，付巧妹，劉逸宸

綜 述

應(yīng)用古DNA技術(shù)探究發(fā)酵微生物的適應(yīng)、演化和馴化歷史

鄭澤權(quán)1,2,3，付巧妹1,2,3，劉逸宸1

1. 中國科學(xué)院古脊椎動(dòng)物與古人類研究所，中國科學(xué)院脊椎動(dòng)物演化與人類起源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100044 2. 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049 3. 中國科學(xué)院生物演化與環(huán)境卓越創(chuàng)新中心，北京 100044

發(fā)酵生產(chǎn)是人類最原始的對(duì)微生物的應(yīng)用和實(shí)踐，在人類歷史上具有重要意義。然而，由于分子證據(jù)的匱乏，人類發(fā)酵生產(chǎn)的演變歷程及相關(guān)發(fā)酵微生物的演化和馴化歷史尚不清楚。本文以目前最常見的兩類發(fā)酵食品——酒及發(fā)酵乳品為例介紹了發(fā)酵食品考古和相關(guān)發(fā)酵微生物的演化和馴化研究，以及古微生物學(xué)和發(fā)酵古微生物的研究現(xiàn)狀，并討論了將微生物古DNA技術(shù)應(yīng)用于古代發(fā)酵微生物研究的可行性和難點(diǎn)，展示了古DNA捕獲技術(shù)在本領(lǐng)域的應(yīng)用潛力，為發(fā)酵微生物演化研究提供了新的思路和方法。

發(fā)酵；微生物；古DNA；演化

利用微生物在食品原料上的發(fā)酵活動(dòng)，水果、谷物和動(dòng)物乳汁等原材料可以轉(zhuǎn)化為酒和乳酪等發(fā)酵食品。這一過程不但豐富了食品的風(fēng)味，更重要的是，提高了食品的保存時(shí)間和營養(yǎng)價(jià)值[1]。作為一種有益的食品生產(chǎn)和保存方法，發(fā)酵具有悠久的歷史(表1)。早在公元前7000年，中國就有了酒的生產(chǎn)[2]。公元前6000年，西亞地區(qū)就開始發(fā)酵和制作乳酪[3]?，F(xiàn)今，全球已有約六大類超過5000種發(fā)酵食品[4]，發(fā)酵食物和飲料已成為人類飲食中必不可少的重要組成部分。

迄今為止，人們對(duì)古人如何馴化微生物以進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)的歷史仍知之甚少。馴化過程會(huì)在生物的基因組中留下典型的跡象，一個(gè)關(guān)鍵標(biāo)志是生產(chǎn)環(huán)境對(duì)相關(guān)適應(yīng)性基因的選擇(選擇過程中有利于適應(yīng)的基因序列變異或拷貝數(shù)變異被保留下來)[8,9]。通過這些馴化痕跡，研究者能了解古人馴化發(fā)酵微生物并進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)的歷史。由于古DNA能提供處于馴化歷程中的古代發(fā)酵微生物的直接遺傳信息，可作為直接證據(jù)佐證對(duì)過去的推斷，并為分子鐘提供必要的校準(zhǔn)信息[10]，所以發(fā)酵微生物的古DNA研究對(duì)于闡述發(fā)酵歷史有重要意義。盡管有關(guān)微生物的研究已不鮮見，但此前由于研究材料和技術(shù)的限制，尚未見基于古DNA的發(fā)酵微生物演化研究。當(dāng)前，學(xué)界對(duì)微生物古DNA的研究主要集中于與人體共存的微生物上，包括人類致病微生物和與人類共生的微生物[10]。相比其他微生物，這些微生物與人類有最直接的聯(lián)系?；谌祟愡z體、牙結(jié)石和糞化石等樣本，研究者能獲取并分析人體微生物古DNA[11～13]。這些樣本具有致密的結(jié)構(gòu)，能一定程度上將內(nèi)部與外界環(huán)境相隔絕，為古DNA提供了較良好的保存環(huán)境[10]。相比之下，暴露在食品容器表面的發(fā)酵微生物古DNA更加難以保存。盡管如此，從考古遺存中獲取發(fā)酵微生物古DNA是可能的，此前已有研究者試圖從出土陶罐中獲取酵母菌古rDNA[14]。古微生物技術(shù)特別是古DNA捕獲技術(shù)的發(fā)展將幫助研究者獲取并分析發(fā)酵微生物古基因組。

由此，本文基于現(xiàn)有考古學(xué)和基因組學(xué)報(bào)道，介紹了發(fā)酵食品歷史和發(fā)酵微生物的馴化研究，以及古微生物學(xué)和發(fā)酵古微生物研究現(xiàn)狀，并討論了發(fā)酵微生物古DNA研究的必要性和可行性。

1 發(fā)酵食品考古

考古學(xué)研究為發(fā)酵食品的歷史提供了實(shí)物證據(jù)，也成為發(fā)酵微生物演化研究的人文和社會(huì)背景。目前，對(duì)發(fā)酵食品的考古研究主要依賴于對(duì)作為食品容器的陶瓷制品的化學(xué)分析[15]。食物成品本身極難經(jīng)歷相當(dāng)長的考古時(shí)期保存至今，但在古人加工和儲(chǔ)存食物的過程中，食物內(nèi)的有機(jī)物可以被無釉陶瓷器的多孔表面吸收，這些有機(jī)物及其降解產(chǎn)物可能因此保存下來[15～17]。在發(fā)酵食品中，酒精飲品和發(fā)酵乳制品又分別因其特別的文化意義和實(shí)用價(jià)值備受學(xué)者關(guān)注，其他種類的的發(fā)酵食品目前只有很少的研究報(bào)道[18,19]，暫不作討論。

表1 現(xiàn)代發(fā)酵食品

在對(duì)發(fā)酵食品的考古研究中，酒尤受研究者重視。這不僅因?yàn)樗鼡碛杏凭玫臍v史，還因?yàn)榫凭哂械南?、?zhèn)痛和精神改變作用，使酒精飲料有了超出一般食品的藥用價(jià)值和文化意義[20]。在考古上，出土陶片中吸附的殘留物可以用有機(jī)溶劑提取，并通過液相色譜和紅外光譜等方法確定提取物的化學(xué)成分，從酒石酸等標(biāo)記物的存在來確定酒的存在，再由殘留物的化學(xué)組成結(jié)合遺址的植物遺存和氣候條件推斷出具體的發(fā)酵原料[16]。利用此方法，可以給出酒在歷史上真實(shí)存在的實(shí)物證據(jù)。目前最早的酒精飲料的考古證據(jù)來自中國，是約公元前7000年由糧食和水果混合釀成的酒精飲料的遺存[2]；而最早的葡萄酒證據(jù)則是研究者在高加索地區(qū)發(fā)現(xiàn)的約公元前6000年的相關(guān)遺存[21]。酒在社會(huì)生活中的特殊角色也可以由考古發(fā)掘來闡述。在一項(xiàng)對(duì)古埃及陶罐樣品的研究中，一系列天然草藥成分從古酒殘留物中被檢出，表明這里的酒曾被制成藥酒使用[22]。在西班牙地區(qū)的另一項(xiàng)研究中，古酒作為祭祀儀式的一部分，與多種祭器一起出土[23]。這兩項(xiàng)殘留物分析研究的結(jié)論也印證了當(dāng)?shù)毓盼墨I(xiàn)的相關(guān)記載。

乳酪和酸奶是另一類具有重要意義的發(fā)酵食品，不僅能以不易腐爛和可運(yùn)輸?shù)男问奖４鎰?dòng)物乳，還能降低乳糖含量，使乳制品更易于乳糖不耐受人群的消化[24]?？脊派蠈?duì)發(fā)酵乳制品的鑒別通常依賴于通過色譜等方法對(duì)出土容器上脂肪酸殘留的鑒定，再結(jié)合對(duì)容器器型的鑒別?？脊派隙嘁源朔ㄗC明發(fā)酵乳制品的實(shí)際存在，如安納托利亞和克羅地亞地區(qū)的史前乳酪生產(chǎn)[3,24]。

考古研究致力于發(fā)掘發(fā)酵古食品的實(shí)物存在，并印證古文獻(xiàn)的相關(guān)記載，但考古上對(duì)發(fā)酵古食品的鑒別多依賴于對(duì)食物降解后產(chǎn)生的標(biāo)記物的鑒別，而且需要結(jié)合對(duì)遺址其他情況綜合考量，常常難以獲得古食品相關(guān)的直接證據(jù)。而近年來通過分子生物學(xué)方法的研究為此提供了新的思路，比如Yang等[25]通過蛋白質(zhì)組分析鑒別了新疆小河遺址的有機(jī)物殘余，鑒定出多種存在于乳制品和發(fā)酵微生物中的蛋白質(zhì)及多肽，為古代乳酪生產(chǎn)提供了直接證據(jù)。此外，Cavalieri等[14]還通過古酵母DNA來鑒別古酒。DNA方法可以成為發(fā)酵古食品鑒別更直接的有力手段。

但是相關(guān)研究也帶來了許多新的問題。從各地發(fā)掘的諸多古代遺存展示了發(fā)酵食品的古老存在，這些食物起源何處，如何演變和傳播？古人如何利用微生物進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)，這些微生物又如何被馴化為今天的樣子？這些問題將可能通過古DNA等分子進(jìn)化方面的研究來進(jìn)一步探討。

2 現(xiàn)代發(fā)酵微生物的適應(yīng)和馴化

基因組學(xué)研究揭示了人如何馴化微生物以獲得適于生產(chǎn)的品系。在馴化過程中，人們選擇和繁殖野生物種，以獲得適于在人工環(huán)境中繁衍和生產(chǎn)。從自然界多變、復(fù)雜且常常十分嚴(yán)酷的環(huán)境到穩(wěn)定而營養(yǎng)豐富的培育環(huán)境，生物適應(yīng)新環(huán)境的過程在基因組中留下了典型的跡象，在生產(chǎn)環(huán)境中保留下了能使生物更適應(yīng)人工生態(tài)位或人類生產(chǎn)需要的功能基因序列變異或者拷貝數(shù)變異[8,9]。這一標(biāo)志為研究者通過基因組研究判斷馴化行為提供了依據(jù)。本文討論的發(fā)酵微生物并不是一個(gè)嚴(yán)格的分類學(xué)概念，而是用于發(fā)酵生產(chǎn)的微生物的總稱，包括多種細(xì)菌、霉菌和酵母。下面通過生產(chǎn)酒精飲料和發(fā)酵乳制品的兩類微生物——釀酒酵母(，含1個(gè)屬，約16種)和乳酸菌(lactic acid bacteria, LAB，大約有18個(gè)屬，200多種)來討論發(fā)酵微生物的馴化研究。

對(duì)現(xiàn)代釀酒酵母的基因組研究為其馴化和對(duì)工業(yè)生產(chǎn)環(huán)境的適應(yīng)提供了重要見解。工業(yè)釀酒酵母基因組上主要表現(xiàn)出三類選擇因素。一是人類生產(chǎn)需要的選擇。Gallone等[26]發(fā)現(xiàn)多數(shù)工業(yè)釀酒酵母菌株的1和1基因突變喪失功能，使菌株失去了4-乙烯愈創(chuàng)木酚(4-Vinylguaiacol, 4-VG)生產(chǎn)能力，消除了產(chǎn)品中4-VG帶來的異味。二是人工營養(yǎng)環(huán)境的選擇。Marsit等[27]發(fā)現(xiàn)，相較于野生菌株，現(xiàn)代葡萄酒分離株具有的多拷貝的基因編碼的寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白使工業(yè)菌株能更好地利用葡萄汁中的豐富氮源。此外，現(xiàn)代啤酒分離株特有的基因也使工業(yè)菌株能利用麥芽汁所富含的麥芽三糖[26]。三是工業(yè)環(huán)境特有的生存壓力的選擇，例如對(duì)銅離子(存在于殺蟲劑中，殘留在作為釀酒原料的植物上)、亞硫酸鹽和鈷離子(防腐劑)的抵抗[28～30]。除變異并受選擇外，現(xiàn)代釀酒酵母對(duì)工業(yè)生產(chǎn)環(huán)境的適應(yīng)基因有一部分也來自于基因的水平轉(zhuǎn)移。作為真核生物，酵母菌的雜交情況可以通過比較染色體結(jié)構(gòu)和等位基因序列加以辨別[31]。Erny等[32]就依此在北歐一支釀酒酵母品系中發(fā)現(xiàn)了來自野生酵母的低溫適應(yīng)基因。上文所提及的基因也來自與環(huán)境菌株的雜交[27]。工業(yè)酵母對(duì)工業(yè)環(huán)境的適應(yīng)基因也隨其與野生酵母的雜交擴(kuò)散到環(huán)境中[33]。

對(duì)現(xiàn)代乳酸菌的基因組研究也對(duì)其馴化過程帶來了一些有意義的結(jié)論。乳酸乳球菌()是現(xiàn)代乳酸菌基因組研究中的模式物種，對(duì)乳酸乳球菌基因組的系統(tǒng)發(fā)育分析表明現(xiàn)代乳制品分離株是從植物分離株演化而來[34]。在演化過程中，乳酸乳球菌基因組上有多個(gè)糖苷利用基因簇丟失，這些基因簇在乳品生態(tài)位中可有可無，但對(duì)利用植物材料生長十分重要[35]。在現(xiàn)代乳品分離株中還發(fā)現(xiàn)了氨基酸生物合成和運(yùn)輸相關(guān)基因的功能增益突變。盡管相關(guān)機(jī)制還不清楚，但在實(shí)驗(yàn)室馴化模擬過程中，通過乳品培養(yǎng)的植物分離株里也發(fā)現(xiàn)了類似的突變，暗示這些基因的功能增益突變與乳品發(fā)酵環(huán)境適應(yīng)有關(guān)[36]。此外，類似釀酒酵母，乳酸菌也表現(xiàn)出對(duì)如低pH值等生產(chǎn)環(huán)境特有因素的適應(yīng)[37～39]。

盡管對(duì)發(fā)酵微生物的適應(yīng)和馴化研究已取得許多成果，但基于現(xiàn)代基因組的研究仍有其局限性。一方面，基于現(xiàn)代基因組的研究對(duì)微生物的演化歷程只能通過比較基因組學(xué)方法進(jìn)行推斷，難以獲得直接證據(jù)；另一方面，基于現(xiàn)代樣本研究菌株馴化的時(shí)間尺度較短，對(duì)于更早歷史時(shí)期中發(fā)酵微生物的演化細(xì)節(jié)的復(fù)原能力較為有限。而對(duì)發(fā)酵微生物古DNA的研究可能是探究這些問題的有力手段。此外，結(jié)合考古學(xué)及古人類基因組學(xué)證據(jù)，復(fù)原古發(fā)酵微生物的演化歷史還可能有利于更深入地理解人類歷史中與發(fā)酵相關(guān)的生活和飲食習(xí)慣的變遷(如對(duì)牛、羊等產(chǎn)乳、產(chǎn)肉動(dòng)物的馴化)，以及不同人群及相關(guān)文化技術(shù)的交流等。

3 微生物古DNA與發(fā)酵古微生物

利用古DNA重建古代基因組是獲取古生物遺傳信息的有效方法。而古DNA本身是從古代材料中獲得的DNA分子。在材料的埋藏過程中，古DNA分子會(huì)隨時(shí)間的推移而不斷降解，外在環(huán)境以及材料與研究者的交互也會(huì)引入外源污染DNA。因此，樣本中的內(nèi)源DNA比例通常很低，DNA分子高度碎片化(通常平均小于100 bp)，同時(shí)序列上會(huì)存在脫氨基和脫嘌呤損傷[40～42]。古DNA分子的常見損傷是片段末尾單鏈粘性末端的胞嘧啶的脫氨基。胞嘧啶脫氨基生成尿嘧啶，擴(kuò)增過程中被識(shí)別為胸腺嘧啶從而導(dǎo)致堿基轉(zhuǎn)換，這也成為鑒別古DNA的重要特征[43,44]。結(jié)合古DNA和基因組學(xué)等手段，可以獲取古代樣本中微生物的遺傳信息，從而了解樣本中微生物的組成以及這些古代微生物的遺傳特點(diǎn)，了解其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系及演化歷史。

3.1 古微生物研究的機(jī)遇和挑戰(zhàn)

古DNA可以揭示早期微生物的演化歷程。不同于動(dòng)物和植物，微生物的演化難以通過化石記錄進(jìn)行研究，古DNA就成了研究歷史時(shí)期中微生物演化的有效手段。在此前的研究中，多種微生物的古基因組已成功重建，鼠疫耶爾森菌()等幾種與人密切相關(guān)的微生物在人群中傳播和演化的歷史得到進(jìn)一步闡述[45～49]。相比于現(xiàn)代樣本，古DNA對(duì)進(jìn)化研究的貢獻(xiàn)還在于它能夠用直接證據(jù)佐證對(duì)過去的推斷，有時(shí)甚至能提出不同于僅基于現(xiàn)代樣本的演化分析的新證據(jù)。例如，現(xiàn)代歐洲和南美洲結(jié)核分枝桿菌()基因組的同源性和共同祖先時(shí)間推斷支持肺結(jié)核由歐洲殖民者帶到南美洲的觀點(diǎn)，但基于古DNA的研究提供了結(jié)核分枝桿菌更早傳入南美洲的證據(jù)[45]。此外，古代和現(xiàn)代菌株的差異還可能揭示一些和工業(yè)化相關(guān)的演化事件，比如Adler等[50]觀察到的工業(yè)革命前后人類飲食結(jié)構(gòu)變化導(dǎo)致的口腔微生物群落變化。古微生物DNA的研究雖然目前還基本局限于對(duì)與人共生的古微生物的分析，但無疑為微生物演化研究提供了新的方向，也啟示人們以新的思路和方法進(jìn)一步闡述發(fā)酵微生物的演化和馴化問題。

古微生物研究也存在其特有的挑戰(zhàn)。在考古樣品埋藏的長期歷史過程中，來自環(huán)境微生物的DNA與內(nèi)源DNA混合在一起。由于許多內(nèi)源微生物與環(huán)境微生物屬于同一屬，內(nèi)源DNA與外源污染可能難以區(qū)分[51,52]。為克服這一問題，可以嘗試對(duì)DNA損傷模式進(jìn)行鑒別，即通過脫氨基導(dǎo)致的堿基轉(zhuǎn)換來鑒別古DNA的特征[53]。比如廣泛應(yīng)用于古DNA領(lǐng)域的mapDamage軟件可以提供比對(duì)后的堿基錯(cuò)配情況用以鑒定樣本中是否存在古DNA[54]。然而堿基錯(cuò)配需要將DNA比對(duì)至目標(biāo)基因組，用于評(píng)估包含多種已知和未知微生物的古代樣本中的古DNA情況存在局限性。目前已有工具將古樣本中的微生物種群鑒定及對(duì)應(yīng)DNA損傷評(píng)估進(jìn)行結(jié)合[55]，但對(duì)于尚無參考基因組的古DNA尚無有效鑒定方案。

此外，古微生物學(xué)面臨的另一個(gè)挑戰(zhàn)是如何真實(shí)地評(píng)估樣本中的古微生物群落。在環(huán)境發(fā)生改變后，微生物組的平衡會(huì)迅速改變，這可能導(dǎo)致關(guān)于古代微生物群落的錯(cuò)誤結(jié)論[56]。不同微生物的DNA在樣本中保存情況的差異也可能影響研究結(jié)果[56]。目前，對(duì)于上述因素如何影響對(duì)古微生物群落的重建仍鮮有研究?；谘朗瘶颖?，Ziesemer等[57]研究了16S rDNA中V3區(qū)域的系統(tǒng)性擴(kuò)增偏差對(duì)人口腔古微生物組的重建的影響。要進(jìn)一步減輕上述問題導(dǎo)致的數(shù)據(jù)偏差，未來還需要對(duì)各種因素影響進(jìn)行系統(tǒng)性評(píng)估。

3.2 發(fā)酵古微生物研究的現(xiàn)狀和未來

2003年，Cavalieri等[14]從一個(gè)古埃及墓葬出土的陶罐中成功獲取了來自釀酒酵母的古DNA片段。自然條件下，釀酒酵母罕見于植物表面以外的環(huán)境中，且不在人類皮膚表面生存，這也在一定程度上減少了外源污染的影響。Cavalieri等[14]比較了古代和現(xiàn)代釀酒酵母菌株的DNA序列，建立了最大似然樹，但受限于他們只得到了較為完整的核糖體DNA，這部分研究最后只作為古埃及人利用酵母釀酒的分子生物學(xué)證明，而且由于當(dāng)時(shí)對(duì)古DNA特征認(rèn)識(shí)較為有限，也尚未建立系統(tǒng)而嚴(yán)謹(jǐn)?shù)墓臘NA鑒別流程，此研究存在一些局限性。

目前而言，部分保存良好的古發(fā)酵制品，比如古干酪或者古酒等，可能作為發(fā)酵微生物古DNA的潛在來源；另外，由于食物殘留可能被吸收到陶瓷容器上，食品容器也可能成為古DNA的來源[14,17]?？捎糜谶z傳研究的古DNA樣本來源稀少是目前發(fā)酵古微生物研究發(fā)展最重要的限制因素。此前報(bào)道的微生物古基因組大多來源于骨骼和牙結(jié)石等樣本，這些樣本結(jié)構(gòu)相對(duì)致密，內(nèi)部在一定程度上與外界環(huán)境相隔絕，能為DNA提供相對(duì)較好的保存環(huán)境[10]。而環(huán)境古微生物也大多來自DNA保存條件相對(duì)較好的永凍區(qū)冰層，其中包括了Bidle等[58]獲得的迄今最古老的細(xì)菌遺傳證據(jù)。相較而言，發(fā)酵制品常常很快在環(huán)境中降解，在漫長的歷史時(shí)期中無法為古DNA保存提供有利環(huán)境。因此，未來除了對(duì)保存較好的發(fā)酵品進(jìn)行微生物研究外，也可以嘗試在有利于古DNA保存的環(huán)境(如寒冷干燥的地區(qū))中發(fā)掘的、有考古學(xué)證據(jù)支持的古代食品容器中的殘留物上進(jìn)行發(fā)酵微生物的DNA捕獲，從而拓展古微生物研究可用的材料范圍。

古DNA捕獲技術(shù)的發(fā)展可能是環(huán)境古DNA研究發(fā)展的重要技術(shù)突破。該技術(shù)基于DNA序列的堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，利用探針從提取的總DNA文庫中捕獲目標(biāo)DNA片段[59]。早前，Burbano等[60,61]和Avila-Arcos等[62]的研究表明可以通過堿基互補(bǔ)配對(duì)來獲取古代樣本中的DNA，但當(dāng)時(shí)他們的捕獲方法效率還相對(duì)較低。DNA捕獲技術(shù)在經(jīng)過改進(jìn)后應(yīng)用于古人類樣本中，從內(nèi)源DNA含量低于0.03%的古人類樣本中，將目標(biāo)序列比例富集至超過46%[59]。這一技術(shù)進(jìn)步極大提高了樣本的內(nèi)源DNA的比例，使保存情況更差的樣本中的古DNA獲取成為可能。通過這一方法，Viviane等[63]從歐洲和西伯利亞洞穴的土壤樣品成功捕獲了古人類線粒體基因組，并用于構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。相比于動(dòng)物，微生物的細(xì)胞結(jié)構(gòu)以及其膜上特有的糖苷醚脂和霍帕烷等成分都使其DNA更易于在環(huán)境中保存[56,64,65]，另外微生物基因組常常只有幾百萬堿基對(duì)，只有動(dòng)物基因組大小的千分之一，因此能以較低數(shù)量的探針達(dá)到高深度覆蓋全基因組的需求。這些都是獲取發(fā)酵微生物古DNA的有利條件。將古DNA捕獲技術(shù)應(yīng)用于環(huán)境古微生物研究，有望為發(fā)酵古微生物演化和馴化研究帶來新的分子證據(jù)。

因此，使用古DNA捕獲技術(shù)從發(fā)酵食物遺存中獲取相關(guān)發(fā)酵微生物古基因組，以進(jìn)行遺傳分析，有潛力為發(fā)酵古微生物演化研究提供更多新證據(jù)和見解。結(jié)合古DNA實(shí)驗(yàn)技術(shù)和現(xiàn)代發(fā)酵微生物研究手段，本文提出以下發(fā)酵古微生物研究流程的基本框架(圖1)：(1)從考古遺址中獲得合適的材料，發(fā)酵食品或者食品容器遺存可能是合適的材料選擇；(2)從材料中提取全部DNA，并加上特異性接頭；(3)根據(jù)目標(biāo)微生物DNA序列特征設(shè)計(jì)并制備特異性探針，連接到磁珠上；(4)將提取的總DNA與探針混合，因?yàn)榛趬A基互補(bǔ)配對(duì)原則，目的DNA更容易與探針結(jié)合，所以目的DNA可以由此被雜交捕獲，進(jìn)而得到富集；(5)吸附磁珠，更換溶液將被捕獲的目的DNA洗脫下來，得到富集的目的DNA文庫；(6)高通量測序；(7)數(shù)據(jù)質(zhì)量控制，比如對(duì)古DNA的鑒定以及對(duì)遺傳數(shù)據(jù)污染情況的估計(jì)等；(8)后續(xù)遺傳分析，比如系統(tǒng)發(fā)育和基因功能演化等。

圖1 基于古DNA捕獲技術(shù)的發(fā)酵古微生物演化研究流程基本框架

流程方案基于古DNA捕獲技術(shù)設(shè)計(jì)：a)從發(fā)酵食品或其容器遺存中提取DNA；b)依據(jù)目標(biāo)微生物基因組設(shè)計(jì)探針并雜交捕獲，達(dá)到富集目的DNA的效果；c)隨后進(jìn)行高通量測序和遺傳數(shù)據(jù)分析。

目標(biāo)微生物的基因組(比如該種微生物特有的基因序列)可以作為參考序列來設(shè)計(jì)DNA捕獲探針[46]。得到遺傳數(shù)據(jù)之后，可以通過堿基錯(cuò)配等DNA損傷情況來鑒別古DNA[43,44]。捕獲得到的發(fā)酵微生物古基因組可能用以討論和解答相關(guān)的科學(xué)問題。一是發(fā)酵食品及發(fā)酵微生物來源和傳播的問題。在系統(tǒng)發(fā)育分析上，古代樣本可用以校正分子鐘，樣本的時(shí)間通?？梢杂赏凰販y年法確定[10,25]。微生物的系統(tǒng)發(fā)育樹通常由最大似然法或者貝葉斯法建立，并使用貝葉斯樹推測各分支最近的共同祖先的時(shí)間[45～49]，進(jìn)而可能討論發(fā)酵微生物的可能起源以及和其他現(xiàn)代發(fā)酵微生物的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。二是發(fā)酵微生物功能演化的問題。相較于現(xiàn)代樣本，古代樣本可能更直接地展示發(fā)酵微生物更久遠(yuǎn)的演化歷程。與動(dòng)植物不同，微生物常常存在廣泛的水平基因轉(zhuǎn)移[27,31～33]。因此，古代和現(xiàn)代微生物基因組上功能基因的變化可能一定程度地反應(yīng)它們經(jīng)歷的環(huán)境變化和選擇壓力[26～30,37～39]。然而，受限于DNA污染和損傷，目前古代DNA片段主要依賴于和參考基因組的比對(duì)，而鮮有從頭組裝。因此，古代微生物基因組的功能基因的差異分析主要局限于它們和現(xiàn)代微生物相比缺失的基因，且這些缺失片段需要謹(jǐn)慎確認(rèn)并非來自DNA損傷和數(shù)據(jù)缺失。另外，還有一些古微生物研究比較古代和現(xiàn)代微生物基因組在功能基因上出現(xiàn)的突變來推測其功能的變化，如發(fā)生無義突變而形成的假基因等[47～49]。

4 結(jié)語和展望

發(fā)酵食品在世界許多地方都是重要而古老的一類食物，其時(shí)間和空間上的廣泛分布已由考古發(fā)掘所證明，古代遺存也能用來追溯發(fā)酵食品的原始形態(tài)。然而，發(fā)酵食品怎樣起源、演變，以及作為發(fā)酵活動(dòng)關(guān)鍵的微生物又是如何隨著人類活動(dòng)被馴化和傳播的？這些問題驅(qū)使著人們以基因組學(xué)方法來進(jìn)一步回答。

基于現(xiàn)代菌種的基因組學(xué)研究業(yè)已取得許多成果，但在復(fù)原發(fā)酵微生物的馴化歷史細(xì)節(jié)上仍存在一些局限性。古DNA技術(shù)是研究古微生物的重要手段，結(jié)合考古學(xué)和古基因組學(xué)證據(jù)，古微生物DNA信息將有助于為發(fā)酵微生物的演化歷史提供額外證據(jù)。

隨著二代測序技術(shù)的廣泛應(yīng)用，古DNA領(lǐng)域在過去十年迅速發(fā)展，相關(guān)的古DNA實(shí)驗(yàn)技術(shù)也在不斷開發(fā)和優(yōu)化。古DNA捕獲技術(shù)已成功從含量極低的樣本中捕獲目標(biāo)古DNA，包括從沉積物中捕獲古老型人類DNA和從古代骨骸樣本中捕獲病原微生物DNA等[46,49,63]。盡管材料稀缺且DNA保存情況不一，高效的古DNA捕獲技術(shù)使從考古遺存中獲取足夠完整的發(fā)酵微生物古基因組并重建其演化歷史成為可能。在不久的未來，古DNA方法將有助于進(jìn)一步闡明發(fā)酵微生物的演化和馴化歷史，為相關(guān)的科學(xué)問題帶來新的突破。

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Exploration of adaptation, evolution and domestication of fermentation microorganisms by applying ancient DNA technology

Zequan Zheng1,2,3, Qiaomei Fu1,2,3, Yichen Liu1

Fermentation production is the most primitive application of microorganisms by humans, which is of great significance in human history. However, due to the lack of molecular evidence, the history of human fermentation production and the evolution and domestication of fermentation microorganisms remain to be further investigated. Taking wine and fermented dairy, the two most common types of fermented foods as examples, we introduce the archaeology evidence of fermented foods and the evolution and domestication of fermented microorganisms, introduce the research status of paleomicrobiology and fermented paleomicroorganisms, and explore the feasibility and challenges of the research of ancient fermented microorganisms applying microbial ancient DNA technology, as well as the application potential of ancient DNA capture technology in this field.

fermentation; microorganism; ancient DNA; evolution

2022-03-06;

2022-04-10;

2022-04-19

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：41925009)，中國科學(xué)院及財(cái)政部基金項(xiàng)目(編號(hào)：YSBR-019，XDB26000000)資助[Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 41925009), Chinese Academy of Sciences， and the Ministry of Finance of the People's Republic of China (Nos. YSBR-019, XDB26000000)]

鄭澤權(quán)，在讀碩士研究生，專業(yè)方向：古基因組學(xué)。E-mail: zhengzequqn18@mails.ucas.ac.cn

劉逸宸，博士，研究方向：古基因組學(xué)和古微生物學(xué)。E-mail: yichen.liu@ivpp.ac.cn

10.16288/j.yczz.22-057

(責(zé)任編委: 謝建平)