沉積物古DNA探秘滅絕古人類演化

平婉菁，劉逸宸，付巧妹

前沿聚焦

沉積物古DNA探秘滅絕古人類演化

平婉菁，劉逸宸，付巧妹

中國科學(xué)院古脊椎動物與古人類研究所，北京 100044

古DNA領(lǐng)域首次從世界不同洞穴遺址的沉積物里提取古核基因組以揭示相關(guān)物種演化的突破性進(jìn)展，標(biāo)志著沉積物古DNA研究正式進(jìn)入全基因組時代。近期，一種新的沉積物古核DNA富集方法成功從西班牙Estatuas洞穴沉積物里捕獲多個尼安德特人的核DNA，揭示該滅絕古人類群體此前未知的人口更替的歷史。沉積物古核DNA富集突破了古DNA研究依賴化石材料的限制，為深入探究遠(yuǎn)古不同人類群體在更宏大時空框架下遷徙、演化與適應(yīng)的歷史提供了更多可能。由此，本文將著重解讀該研究帶來的對尼安德特人遺傳歷史的新認(rèn)識及其方法創(chuàng)新的重要意義；此外還將結(jié)合人類化石DNA及其他沉積物研究所發(fā)現(xiàn)的滅絕古人類線粒體DNA證據(jù)，厘清尼安德特人的種群多樣性及其種群間分離或替代的歷史。

沉積物古DNA；核基因組；滅絕古人類；尼安德特人；丹尼索瓦人；雜交捕獲；探針組；種群替代

近期，雜志評選出“2021年度十大科學(xué)突破”，主題“解鎖古老泥土DNA的時代到來”(ancient soil DNA comes of age)列舉了古DNA領(lǐng)域多項研究首次從世界不同洞穴遺址的沉積物里提取古核基因組以揭示相關(guān)物種演化的突破性進(jìn)展，這標(biāo)志著沉積物古DNA研究正式進(jìn)入全基因組時代。其中的一項重要研究是Vernot等[1]通過開發(fā)新的沉積物古DNA富集方法，從西班牙Estatuas等洞穴沉積物里捕獲多個尼安德特人的核DNA，揭示了該滅絕古人類群體一段不為人知的人口更替的歷史。這一突破對人類古基因組研究尤其具有里程碑式的意義。它意味著該領(lǐng)域研究得以突破材料的限制，將可能從更多不管是否有人類骨骸或活動痕跡的更新世遺址沉積物里去探尋遠(yuǎn)古人類的遺傳信息，為更全面探索遠(yuǎn)古不同人類群體的遷徙、演化與環(huán)境適應(yīng)的歷史開辟了新的道路。

20世紀(jì)80年代以來，古DNA技術(shù)和研究的革新與發(fā)展，不斷刷新著人類對自身由來及在地球上遷徙演化歷程的理解和認(rèn)識。尤其是，研究通過人類遺骸里的古DNA直接觀察到與現(xiàn)代人在遺傳上不同的群體——現(xiàn)代人的近親——尼安德特人和丹尼索瓦人的存在，及獲悉這些滅絕古人類群體(受限于目前已有的古DNA證據(jù)，本文關(guān)于滅絕古人類的討論將僅限于尼安德特人和丹尼索瓦人)與現(xiàn)代人祖先之間此前未知的互動歷史。2010年，尼安德特人和丹尼索瓦人的基因組草圖相繼發(fā)布，為揭示遠(yuǎn)古人類群體間基因交流及其對歐亞現(xiàn)代人深遠(yuǎn)的遺傳影響提供了直接的證據(jù)[2,3]。隨著更多對更新世時期地點(diǎn)人類化石(包括尼安德特人、丹尼索瓦人、早期現(xiàn)代人及其混血個體)古DNA的提取和研究，學(xué)界對這些遠(yuǎn)古人類群體間基因交流的認(rèn)識日益深入：尼安德特人與早期現(xiàn)代人發(fā)生基因交流的時間、地點(diǎn)、次數(shù)和基因流向[4～6]，丹尼索瓦人可能有的不同亞群數(shù)量和廣泛分布的范圍[3,7～12]，尼安德特人與丹尼索瓦人形成混血后代的直接證據(jù)[13]，滅絕古人類基因在歐亞不同現(xiàn)代人群中的分布比例[2,3,12,14～17]及其對現(xiàn)代人生理機(jī)能、疾病發(fā)生率和環(huán)境適應(yīng)性的潛在影響[7,15,16,18～25]等更多細(xì)節(jié)得以被揭露。

然而，這些研究大多聚焦于滅絕古人類群體與早期現(xiàn)代人的互動及對當(dāng)今現(xiàn)代人的影響。受制于滅絕古人類化石的稀缺，對這些滅絕古人類本身遺傳譜系和演化歷史的探索卻極其有限——他們曾存在于何時，分布有多廣？他們曾分化成哪些不同的種群，種群間是否發(fā)生過更替或融合？他們?nèi)绾芜m應(yīng)于環(huán)境的變化，又是怎樣滅絕的？這些問題都所知甚少。因此，本文將著重解讀沉積物里首獲滅絕古人類核基因組的研究帶來的對尼安德特人遺傳歷史的新認(rèn)識及其方法創(chuàng)新的重要意義；此外還將結(jié)合人類化石DNA及其他沉積物研究所發(fā)現(xiàn)的滅絕古人類線粒體DNA證據(jù)，厘清尼安德特人的種群多樣性及其種群間分離或替代的歷史。

1 從線粒體DNA到核DNA：沉積物古DNA捕獲方法的新突破

目前，研究人員已從來自歐亞大陸14個地點(diǎn)(大多數(shù)在歐洲)的23個滅絕古人類的骨骼或牙齒樣本中提取到全部或部分核基因組[1]，包括18個尼安德特人[2,17,26～30]、4個丹尼索瓦人[3,8,31]和1個有著尼安德特人母親和丹尼索瓦人父親的混血兒[13]。然而，在發(fā)現(xiàn)的大量晚更新世遺址里，出土有滅絕古人類骨骸化石的地點(diǎn)還是相對較少，而且大多數(shù)地點(diǎn)發(fā)現(xiàn)的骨骸化石都集中在一個或幾個地層之中，很多時候并不能覆蓋相關(guān)地點(diǎn)的全部時間跨度。這意味著，對滅絕古人類骨骸化石的古DNA研究有著極大的時空局限性，甚至有時候因為骨骸化石保存情況不佳，還可能無法提取到相關(guān)古DNA[1]。

早在2017年，Slon等[32]為找到更多滅絕古人類演化的線索，通過開發(fā)沉積物古DNA雜交捕獲的方法，從歐洲比利時Trou Al'Wesse洞、克羅地亞Vindija洞、西班牙El Sidrón洞、法國Caune de l'Arago洞和Les Cottés洞，及西伯利亞Denisova洞和Chag-yrskaya洞等7個已知有滅絕古人類存在的洞穴沉積物中獲取多例尼安德特人和丹尼索瓦人的線粒體DNA[32]。該研究首次突破人類遺骸化石的限制，實(shí)現(xiàn)從沉積物里直接提取史前人類的遺傳信息，其制備的相關(guān)文庫也為后來沉積物核DNA的提取和研究奠定基礎(chǔ)。

而后，本課題組運(yùn)用這一方法從青藏高原白石崖溶洞距今10～4.5萬年的數(shù)個地層沉積物里獲取丹尼索瓦人的線粒體DNA。這是首次在Denisova洞之外獲取丹尼索瓦人的DNA信息，明確證實(shí)丹尼索瓦人在晚更新世時期曾長期生存在青藏高原[33]，表明沉積物古DNA對探究滅絕古人類的時空分布和環(huán)境適應(yīng)歷史有極大潛力。不過，線粒體能夠提供的遺傳信息有限，僅可證實(shí)相關(guān)滅絕古人類的存在及追溯其母系遺傳的歷史，并不足以反映更為復(fù)雜的祖源成分。要深入了解滅絕古人類的演化譜系和更完整的遺傳歷史，則要從核DNA上進(jìn)行突破。

沉積物里含有海量的環(huán)境微生物DNA和哺乳動物DNA，要分離并識別出滅絕古人類的線粒體DNA已非常困難，而要識別出滅絕古人類的內(nèi)源核DNA則更具挑戰(zhàn)。沉積物里的絕大多數(shù)哺乳動物DNA都不是人類的DNA，而且因為人類和其他哺乳動物在許多位點(diǎn)都存在同源序列，要識別出人類的DNA非常困難。核DNA信息量大，提取的難度更大。因此，Vernot等[1]在原來雜交捕獲方法的基礎(chǔ)上，經(jīng)過一系列模擬和實(shí)驗探索出新的富集方法。具體來說，他們通過15種靈長類和非靈長類動物的多序列比對識別出哺乳動物核基因組中序列多樣性高的區(qū)域，也就是圍繞一個目標(biāo)SNP(單核苷酸多態(tài)性，指基因組水平上單個核苷酸變異引起的DNA序列多態(tài)性，包括單個堿基的轉(zhuǎn)換、顛換、插入、缺失等形式)前25 bp和后26 bp的序列片段進(jìn)行比對時，經(jīng)計算和模擬識別出人類和9種非靈長類動物基因組相差超過8個堿基對的區(qū)域，這可極大降低非人源哺乳動物DNA錯配率并最有效富集人源DNA。根據(jù)以上設(shè)計思路，他們開發(fā)了針對人類基因組中160萬個SNP位點(diǎn)的探針組，針對每個SNP位點(diǎn)設(shè)計有兩個52 bp的探針，一個探針包含有目標(biāo)位點(diǎn)的衍生等位基因，一個探針包含有祖先等位基因，由此通過雜交捕獲對序列多樣性高區(qū)域里這些位點(diǎn)的目標(biāo)片段進(jìn)行富集[1]。

Vernot等[1]將這些方法應(yīng)用于西伯利亞阿爾泰山脈中的Denisova洞、Chagyrskaya洞和西班牙北部的Estatuas洞等3個洞穴100多例沉積物樣本，通過古DNA捕獲分析，從三個地點(diǎn)都獲得了尼安德特人的核DNA和線粒體DNA[1]，并得到對該滅絕古人類群體在一個遺址更完整活動歷史及多個遺址不同種群間互動關(guān)系的新的、更全面的理解。

2 化石和沉積物古DNA：共探尼安德特古人類的遷徙與演化歷史

在現(xiàn)代人類從非洲向世界各地擴(kuò)散之前，尼安德特人已廣泛生活在歐亞大陸西部，但他們起源和擴(kuò)散的歷史仍是未解之謎。迄今尼安德特人最早的形態(tài)學(xué)和遺傳學(xué)證據(jù)可以追溯到約43萬年前[34]，而最后的尼安德特人大約在4萬年前消失[28,35]。滅絕古人類化石的DNA證據(jù)顯示尼安德特人在與丹尼索瓦人分離以后人口規(guī)模迅速擴(kuò)大并向各區(qū)域擴(kuò)散，而后他們長期以孤立的群體生活，群體內(nèi)部近親繁殖的現(xiàn)象顯著，而基因流動程度很低，由此導(dǎo)致人口規(guī)模下降，這也被認(rèn)為是尼安德特人滅絕的可能原因[26～28,36]。

盡管尼安德特人遺傳多樣性遠(yuǎn)低于現(xiàn)代人類[36]，但是仍能通過DNA識別其不同的種群并探知這些種群間的關(guān)系。Vernot等[1]選取了三個地點(diǎn)展開對沉積物中滅絕古人類核DNA的探索——西伯利亞南部的Denisova洞和Chagyrskaya洞，及西班牙北部的Galeria de las Estatuas洞[1]。

Denisova洞和Chagyrskaya洞均位于阿爾泰山脈，兩地相距約100 km。已有研究從這兩個地點(diǎn)的人類遺骸(約12萬年前的阿爾泰尼安德特人- Denisova 5個體和約8萬年前的Chagyrskaya 8個體)中獲得高覆蓋度的尼安德特人基因組[26,30]。數(shù)據(jù)顯示Chagyrskaya 8相較于同地區(qū)較老的阿爾泰尼安德特人來說，與遠(yuǎn)在克羅地亞更年輕的尼安德特人(約5.2萬年前的Vindija 33.19個體)和歐亞大陸西部其他晚期尼安德特人(高加索北部約7萬年前的Mezmaiskaya 1個體及歐洲比利時、法國、克羅地亞4個約4.7～3.9萬年前的個體)共享有更多的等位基因，即有著更近的遺傳關(guān)系。而就Vindija 33.19個體和Chagyrskaya 8個體比較來說，前者與其他歐洲晚期尼安德特人關(guān)系更近，而后者與丹尼索瓦人和尼安德特人的第一代混血兒(約5萬年前的Denisova 11個體)關(guān)系更近，更進(jìn)一步說是與Denisova 11個體的尼安德特人母親的關(guān)系最為密切[13,17,26,28,30,37]。

Vernot等[1]從這兩個地點(diǎn)沉積物中所捕獲的尼安德特人核DNA的分析結(jié)果與化石DNA的結(jié)果保持一致。具體而言，Denisova洞穴地層沉積物里獲得的2例尼安德特人核DNA經(jīng)分析屬于阿爾泰尼安德特人種群，其中之一(E11.4)來自阿爾泰尼安德特人所發(fā)現(xiàn)的同一地層(約10.5～12萬年前)，另一份(M14.2)則來自主室同時期(約9.7～11.2萬年前)的地層；Chagyrskaya洞穴所有地層沉積物里獲得的尼安德特人核DNA都屬于Chagyrskaya 8個體所代表的種群[1,26,30]。這些結(jié)果表明至少有兩個獨(dú)立的尼安德特人種群分批從歐洲遷至西伯利亞南部阿爾泰山脈，第一批歐洲早期尼安德特人在12萬年以前進(jìn)入Denisova洞生活，而后來的尼安德特人部分進(jìn)入Chagyrskaya洞生活并帶來了他們的技術(shù)文化(這與考古學(xué)家們針對這些地點(diǎn)出土的文化器物分析的結(jié)果[38]相印證)，部分則來到Denisova洞，替換了前一批到來的尼安德特人種群，并與丹尼索瓦人發(fā)生基因交流。

Denisova洞是發(fā)現(xiàn)過大量丹尼索瓦人、尼安德特人和兩者混血兒骨骸化石的地點(diǎn)。為找到更多線索，Zavala等[39]此前使用自動化實(shí)驗方案對Denisova洞728例沉積物樣本展開過大規(guī)模的線粒體DNA捕獲和研究，發(fā)現(xiàn)該地點(diǎn)最早的居民是丹尼索瓦人，可追溯至約30萬年前。尼安德特人則在約17萬年前到來，且兩者在這個遺址可能發(fā)生多次重疊或更替。另一意外的發(fā)現(xiàn)是研究首次從Denisova洞穴沉積物里獲得早期現(xiàn)代人的線粒體DNA，表明他們約4.5萬年前在這里出現(xiàn)[39]。但是，線粒體DNA并不足以探究這三個人類種群之間更為復(fù)雜的互動歷史，這也凸顯出沉積物核DNA的提取和研究將對闡明人類演化歷史發(fā)揮重要作用。

沉積物古核DNA富集方法的應(yīng)用，使Vernot等[1]得以從尚未有任何化石古DNA證據(jù)的Estatuas洞穴沉積物里捕獲多個尼安德特人的線粒體和核DNA，為揭示該地點(diǎn)及更大時空框架下尼安德特人的遺傳圖譜提供了關(guān)鍵證據(jù)。從線粒體譜系來看，來自最深地層、可追溯至約11.3萬年前的尼安德特人(GE pit I Layer 4)與歐洲早期尼安德特人(比利時約12.7萬年前的Scladina個體和德國約12.4萬年前的HST個體)關(guān)系密切；而來自其他地層約10萬年前的尼安德特人(GE pit I Layer 2-3和GE pit II Layer 2)則與高加索北部尼安德特人(Mezmaiskaya 1)有更近的遺傳關(guān)系[1,28,29]。基于核基因組的系統(tǒng)發(fā)育分析(圖1)，Vernot等[1]推算出Estatuas洞穴這兩個不同尼安德特人種群的分化時間。具體而言，該地點(diǎn)更晚期尼安德特人從最近祖先群體分離出來的時間在約10～11.5萬年前，與Vindija、Mezmaiskaya 1和Chagyrskaya 8等種群彼此分離的時間相近。此外，該地點(diǎn)與HST同屬一個種群的更早期尼安德特人，則是在約12.2～13.4萬年前從最近祖先群體分離出來，與HST、Scladina和阿爾泰尼安德特人等種群彼此分離的時間相近。這些結(jié)果清楚表明西班牙北部的尼安德特人在約10萬年前發(fā)生了種群的更替，且在晚更新世早期存在兩次明顯的尼安德特人向外擴(kuò)散的事件，研究推測可能與末次冰期環(huán)境氣候的變化有關(guān)[1]。

圖1 Estatuas洞穴沉積物樣本在尼安德特人系統(tǒng)發(fā)育樹上的分布

尼安德特人系統(tǒng)發(fā)育樹顯示尼安德特人群體相繼在約10.5萬年前和13.5萬年前出現(xiàn)分化，向外發(fā)生輻射。根據(jù)參考文獻(xiàn)[1]修改繪制。

3 結(jié)語與展望

20世紀(jì)初，Willerslev等[40]已開始從沉積物里檢測和分析史前生物的線粒體DNA，繼而更多研究得以用沉積物里的線粒體古DNA重建遠(yuǎn)古生態(tài)環(huán)境并探尋史前生物的多樣性[41～43]。歷經(jīng)數(shù)十年的探索，沉積物古DNA的提取和研究終于迎來新的契機(jī)，最近的3項成果在洞穴沉積物的核基因組提取和研究上取得重大突破：Pedersen等[44]從墨西哥北部Chiquihuite洞穴沉積物里提取并識別出同一地點(diǎn)不同古熊種群的核基因組，Gelabert等[45]從佐治亞州西部Satsurblia洞穴沉積物里直接測序古老人類和多種滅絕哺乳動物的核基因組，以及用新方法從多個洞穴沉積物里富集滅絕尼安德特古人類不同種群的核基因組[1]，它們標(biāo)志著沉積物古DNA研究從線粒體DNA向全基因組時代的跨越。

未來的沉積物古DNA研究將不再僅局限于識別遠(yuǎn)古物種、重建古生態(tài)環(huán)境或了解人類群體的時空分布，而是真正邁入全基因組階段，使研究能夠更精確、深入地探究不同人類群體在時空中的交流和演變歷史，及其他生物的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。通過分離沉積物中來源豐富(遠(yuǎn)古人類、動物、植物、微生物等)的古DNA，將可能解讀更大時空范圍因缺乏古生物遺骸而被忽略的遺傳歷史，并在一個更加宏大的時空框架里探討遠(yuǎn)古生命起源、演化、擴(kuò)散、適應(yīng)等重大科學(xué)問題[2]，通過豐富的遺傳學(xué)數(shù)據(jù)來繪制此前不為人知的遠(yuǎn)古世界圖景。

感謝中國科學(xué)院古脊椎動物與古人類研究所Ethan Andrew Bennett博士對英文摘要提出建議。

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Exploring the evolution of archaic humans through sedimentary ancient DNA

Wanjing Ping, Yichen Liu, Qiaomei Fu

Recent success in the retrieval of nuclear DNA of ancient humans and animals from cave sediments paves the way for genome-wide studies of past populations directly from sediments. In three studies, nuclear genomes of different species were obtained from the sediments of multiple archeological caves and their genetic histories were revealed, including an unknown population replacement of Neanderthals from Estatuas cave in Spain, which was recovered using a new DNA capture approach. By extending sediments as a source of DNA beyond fossils, this breakthrough is of particular significance to the field of ancient human genomics, which brings about more possibilities for exploring the history of past population migration, evolution and adaptation within larger time-scales and geographical areas where no fossil remains exist. Here, we mainly review the significance of the technical advances in retrieving ancient nuclear DNA from sediments and present new insights into the genetic history of Neanderthals revealed by this technique. By combining ancient genomes retrieved from fossils and additional mitochondrial DNA extracted from sediments of archaeological sites, we may begin investigating diverse archaic populations and examine their genetic relationships, movements and replacements in detail.

sedimentary ancient DNA; nuclear genomes; archaic humans; Neanderthals; Denisovans; hybridization capture; probe-set; population replacement

2022-02-14;

2022-03-11;

2022-03-31

國家自然科學(xué)基金杰出青年基金(編號：41925009)，中國科學(xué)院項目(編號：YSBR-019，XDB26000000)和騰訊基金會(科學(xué)探索獎)資助[Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 41925009), the Chinese Academy of Sciences (Nos. YSBR-019, XDB26000000), and the Tencent Foundation (through the XPLORER PRIZE)]

平婉菁，碩士，科研助理/工程師，研究方向：實(shí)驗技術(shù)。E-mail: pingwanjing@ivpp.ac.cn

付巧妹，博士，研究員，研究方向：演化遺傳、群體遺傳。E-mail: fuqiaomei@ivpp.ac.cn

10.16288/j.yczz.22-032

(責(zé)任編委: 張蔚)