過敏性紫癜關(guān)鍵基因的生物信息學分析 及中藥治療預(yù)測

羅 斐，袁顥宸，刁娟娟

（1. 山東中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院，濟南 250013；2. 山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，濟南 250011）

過敏性紫癜（Henoch-Sch?nlein purpura，HSP）是一種以IgA沉積為主的系統(tǒng)性小血管炎［1］，在2～8歲兒童中最為多見，其發(fā)病率為3/100000～27/100000，且近年來逐年上升［2-3］，亞洲地區(qū)發(fā)病率高達70/100000［4］。臨床以非血小板減少性紫癜、常伴關(guān)節(jié)腫痛、腹痛、胃腸道出血、血尿和蛋白尿為特征，臨床分型有單純皮膚型、腹型、腎型、關(guān)節(jié)型以及混合型紫癜［5］。HSP屬于西醫(yī)兒科學免疫性疾病，歸屬中醫(yī)學“血癥”范疇。其病因復(fù)雜，病理機制主要為B淋巴細胞和T淋巴細胞多克隆活化，分泌大量IgA沉積在全身小血管壁上，導(dǎo)致IgA相關(guān)免疫復(fù)合物增生性小血管炎。2012年，《國際血管炎分類標準》已將該病更名為IgA相關(guān)血管炎［6］。該病多為自限性疾病，預(yù)后良好，長期并發(fā)癥是持續(xù)腎臟受累［7-8］。胃腸道和腎臟受累是其發(fā)病和死亡的主要原因［9］?，F(xiàn)代醫(yī)學對該病尚無特效療法，臨床以糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑等對癥治療為主，雖可有效緩解患兒病情，但因其紫癜容易反復(fù)出現(xiàn)，病程周期較長，可出現(xiàn)紫癜性腎炎病變，導(dǎo)致治療頗為棘手。眾多研究表明，中醫(yī)藥治療HSP療效顯著，預(yù)后良好，不良反應(yīng)少，還可預(yù)防HSP患兒腎功能損害，降低復(fù)發(fā)率等［10-12］。

微小RNA（microRNA，miRNA）是內(nèi)源性非編碼RNA。miRNA轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達，從而發(fā)揮多種生物學功能［13］。miRNA也常作為疾病診斷的潛在生物標志物［14］。生物信息學作為一門多學科交叉融合的綜合學科［15］，已成為整個生物醫(yī)學領(lǐng)域發(fā)展的重要組成部分及研究前沿［16］。

本研究擬通過生物信息學方法對GEO數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中的原始數(shù)據(jù)芯片進行miRNA差異性分析，挖掘差異性表達顯著的miRNA，并預(yù)測其潛在靶基因與信號通路，通過關(guān)鍵基因預(yù)測具有治療HSP作用的潛在中藥，旨在揭示其可能的作用機制，為臨床提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 GEO基因芯片數(shù)據(jù)分析HSP差異表達基因

以“Allergic Purpura”“Henoch-Sch?nlein purpura”“Purpura”為關(guān)鍵詞，設(shè)置種屬為“homo sapiens”，在GEO數(shù)據(jù)庫［17］中進行檢索，獲得GSE80401基因表達譜，共包含16例樣本基因芯片數(shù)據(jù)，其中病例組10例，對照組6例。基于GEO數(shù)據(jù)庫的GEO2R工具分析病例組與對照組中差異表達的miRNA。以P＜0.05和|log2FC|＞2為標準篩選差異表達的miRNA，定義差異表達探針（負數(shù)代表下調(diào)，正數(shù)代表上調(diào)），然后以熱圖和火山圖的形式進行輸出。

1.2 HSP靶點的挖掘

GeneCard（http://www.genecards.org）［18］是一個能提供簡明的基因組、蛋白質(zhì)組、轉(zhuǎn)錄、遺傳和功能上所有已知和預(yù)測的人類基因的綜合數(shù)據(jù)庫。以“Allergic Purpura”“Henoch-Sch?nlein purpura”為關(guān)鍵詞，通過GeneCard數(shù)據(jù)庫和OMIM數(shù)據(jù)庫（http://www.omim.org）查詢篩選，獲得HSP的相關(guān)治療靶點信息。

1.3 hsa-miR-3945靶基因預(yù)測

通過miRwalk（http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/）、miRDB（http://mirdb.orhttp://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/g）、TargetScan（http://www.Targetscan.org）三個靶基因數(shù)據(jù)庫分別預(yù)測hsa-miR-3945的靶基因，對三者的預(yù)測結(jié)果繪制venn圖，得到交集基因。將上述基因與1.2中獲取的HSP基因交叉映射，得到映射靶基因。

1.4 蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與Hub基因

將映射靶基因放在String數(shù)據(jù)庫（https://stringdb.org/）［19］中構(gòu)建蛋白相互作用（protein-protein interactions，PPI）網(wǎng)絡(luò)模型，選擇物種為“homo sapiens”，設(shè)定最高置信度蛋白質(zhì)參數(shù)評分≥0.9，其余參數(shù)保持默認設(shè)置，最終獲得PPI網(wǎng)絡(luò)圖，以TSV格式輸出，導(dǎo)出蛋白互作關(guān)系并導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件中。利用Cytoscape 3.7.2軟件的cytoHubba插件、MCODE插件對其進行分析，以邊緣滲出組件（edge percolated component，EPC）分析方法、最大團中心性（maximal clique centrality，MCC）分析方法和最大鄰居組件（mazimun neighborhood component，MNC）分析方法為標準篩選出Hub基因。

1.5 hsa-miR-3945映射靶基因的GO及KEGG信號通路富集分析

運用Metascape數(shù)據(jù)庫（http://metascape.org/gp/#/main/step1）［20］分別對映射靶基因進行基因本體（gene ontology，GO）功能富集分析及京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of genes and genomes，KEGG）信號通路富集分析，設(shè)置種屬為“homo sapiens”，設(shè)定閾值P＜0.05，篩選出最可能的前10名GO功能富集結(jié)果及前10條信號通路，以氣泡圖的形式輸出結(jié)果。

1.6 關(guān)鍵靶點對接及中藥預(yù)測

將篩選出的Hub基因?qū)隒oremine Medical數(shù)據(jù)庫（https://www.coremine.com/）［21］中，設(shè)置閾值條件為P＜0.05，由此篩選出與Hub基因相關(guān)的中藥。根據(jù)閾值生物口服利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，類藥性（drug likeness，DL）≥0.18的標準，利用TCMSP數(shù)據(jù)庫（http://lsp.nwu.edu.cn/ tcmsp.php）［22］對上述預(yù)測中藥進行初步篩選，獲取各藥物相應(yīng)的靶點蛋白，并通過Uniprot數(shù)據(jù)庫進行校正、規(guī)范化，再將處理后的數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape軟件中構(gòu)建“中藥-有效成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 差異基因

基于GSE80401的基因片段原始數(shù)據(jù)，符合|log2(FC)|＞2和P＜0.05標準的差異基因有83個，其中包括26個上調(diào)基因和57個下調(diào)基因，表明miRNA在正常個體與HSP患者之間存在差異性表達。差異性分析火山圖為圖1，熱圖為圖2。其中顯著表達的基因為hsa-miR-3945、hsa-miR-4430、hsa-miR-3158-5p、hsa-miR-4655-3p、hsa-miR-3667-5p。依據(jù)|log2(FC)|值排序篩選可知，hsa-miR-3945在樣本中顯著下調(diào)，可作為關(guān)鍵miRNA。

圖1 差異基因火山圖Fig. 1 Volcano map of differential genes

圖2 差異基因熱圖Fig. 2 Heat map of differential genes

2.2 兒童過敏性紫瘢靶點挖掘

以“Allergic Purpura”“Henoch-Sch?nlein purpura”為關(guān)鍵詞，利用GeneCard數(shù)據(jù)庫和OMIM數(shù)據(jù)庫查詢篩選，去重整合共獲得886個兒童HSP的基因靶點。

2.3 hsa-miR-3945靶基因預(yù)測

通過miRwalk、miRDB、TargetScan三個靶基因數(shù)據(jù)庫預(yù)測hsa-miR-3945的靶基因，得到的靶基因分別為5038、237、3148個，三者交集為101個（圖3）。因GSE80401基因表達譜只有16例樣本基因芯片數(shù)據(jù)，采用小樣本量數(shù)據(jù)分析可能產(chǎn)生偏倚，故將交集基因與2.2中獲取的HSP基因映射交叉，得到映射靶基因85個。將映射靶基因上傳至String數(shù)據(jù)庫，設(shè)置蛋白種類為“homo sapiens”，最高置信度蛋白質(zhì)參數(shù)評分≥0.9，隱藏游離蛋白以確保研究數(shù)據(jù)的可靠性，其余設(shè)置均為默認設(shè)置，導(dǎo)出TSV格式的蛋白互作關(guān)系，后導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件PPI網(wǎng)絡(luò)圖（圖4）。運用Cytoscape 3.7.2軟件中的cyto-Hubba插件、MCODE插件篩選出Hub基因為JUN、TP53、RELA、TNF、MAPK1、IL6、FOS、AKT1、MYC。

圖3 hsa-miR-3945Fig. 3 hsa-miR-3945

圖4 PPI網(wǎng)絡(luò)Fig. 4 PPI network diagram

2.4 hsa-miR-3945預(yù)測靶基因的GO及KEGG信號通路富集分析

將2.3中預(yù)測所得的85個映射靶基因上傳至Metascape數(shù)據(jù)平臺中，對其進行GO富集分析和KEGG通路分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。GO結(jié)果顯示，hsa-miR-3945的靶基因主要富集在膜筏、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合物、含膠原的細胞外基質(zhì)、過氧化物酶體等細胞組件中，參與細胞因子受體結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、蛋白酶結(jié)合、腫瘤壞死因子受體超家族結(jié)合等分子功能，涉及細胞對脂多糖的反應(yīng)、對無機物的反應(yīng)、凋亡信號通路、對細胞外刺激的反應(yīng)等生物過程。KEGG信號通路分析結(jié)果表明，hsamiR-3945的靶基因信號通路顯著富集于IL-17信號通路、TNF信號通路、Th17細胞分化通路、NF-κB信號通路等通路中。富集氣泡圖結(jié)果如圖5所示。

圖5 富集氣泡圖Fig. 5 Enrichment bubble diagramBP：生物學過程；CC：細胞成分；MF：分子功能。BP: Biological process; CC: Cell component; MF: Molecular function.

2.5 關(guān)鍵靶點對接及中藥預(yù)測

通過Coremine Medical數(shù)據(jù)庫預(yù)測具有潛在治療HSP的中藥，設(shè)置閾值條件P＜0.05。預(yù)測結(jié)果顯示，hsa-miR-3945的Hub基因與多種中藥密切相關(guān)，如桂枝、茯苓、桃仁、牡丹皮、赤芍。以上五種藥出自桂枝茯苓丸，其中桂枝可散寒止痛，溫通經(jīng)脈；茯苓可安神健脾，利尿除濕；牡丹皮可活血化瘀，清熱涼血；桃仁可潤腸通便，活血化瘀；赤芍可化瘀消腫，清熱止痛。用以上藥物構(gòu)建“中藥-有效成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖（圖6），其中倒三角形代表基因，菱形代表藥物，正六邊形代表藥物成分，A、B代表共有成分。

圖6 “中藥-有效成分-作用靶點”網(wǎng)絡(luò)Fig. 6 “Traditional Chinese medicine-active ingredients-action target” network

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，hsa-miR-3945在多物種中具有高度保守性，可能作為一種新的治療手段用以治療HSP。GO富集結(jié)果顯示，在hsa-miR-3945的差異表達中，其主要調(diào)節(jié)對脂多糖的反應(yīng)、對無機物的反應(yīng)、凋亡信號通路、對細胞外刺激的反應(yīng)等生物過程；KEGG富集結(jié)果顯示，其主要富集在IL-17信號通路、TNF信號通路、Th17細胞分化通路、NF-κB信號通路等。

蔡明陽等［23］的研究表明，miRNA在HSP的發(fā)病過程中發(fā)揮作用，miR-146a-5p、miR203-3p和miR-223-3p的相對表達水平與粒細胞浸潤和纖維蛋白樣壞死強度的相關(guān)性最高，let-7a家族可調(diào)節(jié)NF-κB信號通路［24］的激活，且參與狼瘡腎［25］及IgA腎病［26］的發(fā)病。羅穎等［27］推測，HSP患兒外周血B細胞IL-10的表達與miR-21-5p有關(guān)。本研究所獲得的hsa-miR-3945目前尚缺乏文獻記載，仍需進一步的試驗驗證。

有研究表明，TNF-α等炎性因子參與了HSP的發(fā)病及免疫機制，可作為診斷診治HSP的重要參考依據(jù)［28-30］。TNF的生物學效應(yīng)基于TNF-α轉(zhuǎn)換酶（tumor necrosis factor alpha converting enzyme，TACE）將其切割成可溶性分子［31-32］，并通過與兩種受體TNFR1（CD120A）和TNFR2（CD120B）結(jié)合而發(fā)揮作用［33-34］。TNFR1在TNF信號通路中起主導(dǎo)作用，而TNFR2則在局部穩(wěn)態(tài)過程中增強TNFR1的反應(yīng)性［35-36］。TNF-α由單核巨噬細胞產(chǎn)出，是機體內(nèi)主要的促炎因子，對機體免疫系統(tǒng)的穩(wěn)定性具有重要作用，其高表達會誘導(dǎo)炎性因子的產(chǎn)生，導(dǎo)致微血管損害，從而引起皮膚紫癜等［37］。

Th17細胞主要分泌IL-17、IL-22、IL-21等細胞因子，正常時具有抗感染、抗炎的免疫功能，已被確定為自身免疫的主要誘導(dǎo)劑，功能上調(diào)會引起炎癥性疾?。?8］。IL-17可以激活NF-κB、MP-KA和CEBP級聯(lián)反應(yīng)，影響上調(diào)促炎基因表達，造成腎血管內(nèi)皮細胞損傷，導(dǎo)致腎小球和腎小管損害［39］。

NF-κB被證明參與機體免疫應(yīng)答以及炎癥急性期反應(yīng)活動［40］，可調(diào)控TNF-α、IL-1β等多種炎癥因子、趨化因子、黏附因子、集落刺激因子［41］。在病理狀態(tài)下，其能夠與細胞核結(jié)合，從而誘導(dǎo)各種趨化因子和細胞因子生成增加，以增強機體的炎性反應(yīng)［42-43］。

在現(xiàn)代醫(yī)學中HSP以對癥治療為主。劇烈腹痛伴消化道出血、關(guān)節(jié)腫痛或血管神經(jīng)性水腫時可選擇腎上腺糖皮質(zhì)激素短期應(yīng)用；紫癜性腎炎的出現(xiàn)如果符合腎病綜合征標準或者急進性腎炎標準，可應(yīng)用腎上腺糖皮質(zhì)激素、血液濾過或者其他免疫抑制劑治療。

桂枝茯苓丸是中醫(yī)活血化瘀的第一方，始載于《金匱要略·婦人妊娠病脈證并治第二十》，因該方能下死胎，又稱催生湯、奪命丹。桂枝茯苓丸原方配比是以桂枝、茯苓、牡丹、桃仁、芍藥各等分煉蜜為丸，是以婦人內(nèi)有癥痼、又受孕成胎之血癥，不易猛攻而和緩圖治之法。

臨床觀察桂枝茯苓丸方證相應(yīng)患兒，辨證可見患兒多屬于桂枝體質(zhì)。黃煌教授的《張仲景50味藥證》［44］中將兒童桂枝體質(zhì)歸納總結(jié)為：“平素體質(zhì)偏弱；體型中等略瘦；膚白濕潤細膩而無澤；下眼瞼色暗；多汗，手足易涼；易出現(xiàn)腹壁拘急疼痛；舌質(zhì)淡嫩有紫氣，質(zhì)地柔嫩而潤澤，脈搏偏浮，中取則少力”。本研究臨床觀察發(fā)現(xiàn)，兒童桂枝體質(zhì)能夠采集到的主要辨證要點是形體適中偏瘦，膚白細膩少華，舌體質(zhì)地柔軟，舌色淡暗潤澤，苔薄白脈浮緩。故而臨床診治兒童HSP只要符合這個辨證要點的，就可以選擇桂枝茯苓丸處方或者開具中成藥桂枝茯苓膠囊，因能切中病機，常收效甚捷。

本研究基于生物信息學對GSE80401基因表達譜進行分析及處理，結(jié)果表明，HSP的發(fā)生可能與對無機物的反應(yīng)、凋亡信號通路、細胞外刺激的反應(yīng)、炎性因子等相關(guān)，這些靶點可能是干預(yù)HSP的重要因素。Coremine Medical數(shù)據(jù)庫預(yù)測中藥組方也證明了桂枝茯苓丸具有良好的活血化瘀功效，主要通過調(diào)控炎癥因子表達、調(diào)節(jié)機體免疫來治療兒童HSP。HSPhsa-miR-3945及其Hub基因可能在表達水平上存在負相關(guān)關(guān)系，因目前樣本有限，數(shù)據(jù)單一，需進一步的試驗研究驗證當前結(jié)論。Li等［45］發(fā)現(xiàn)，miRNA的改變可能參與了HSP的發(fā)病機制，可能成為HSP的治療靶點或診斷標志物，但目前尚無更多文獻報道，仍需進一步深入研究。中藥復(fù)方是一個多成分的復(fù)雜體系，本研究僅從微觀角度佐證了桂枝茯苓丸治療兒童HSP的的作用機制，后續(xù)研究可在此研究的基礎(chǔ)上加以臨床和試驗驗證，使其對臨床應(yīng)用更具有指導(dǎo)意義。