谷子SiSULTR2.1基因的生物信息學分析及其對 硒、硫的響應

石 堯，尹美強，溫銀元，李露露，孫 敏，高志強

（1. 山西農業(yè)大學農學院，太谷 030801；2. 黃土高原特色作物優(yōu)質高效生產省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心， 太谷 030801）

谷子［Setaria italica（L.）Beauv］是起源于我國北方的傳統(tǒng)優(yōu)勢農作物，具有耐干旱、耐貧瘠、抗逆、適應性高等特點。小米是谷子脫殼后的產物，其營養(yǎng)成分與其他禾谷類糧食作物相比相當或更優(yōu)［1］。硒于1817年被瑞典化學家Berzeliu發(fā)現，位于元素周期表第四周期VI主族，化學性質與同一主族的硫和碲相似［2］。其是人和動物體內所必需的微量元素，對人體有抗癌、抗氧化防衰老、增強免疫力排毒解毒等作用［3］。人體只有在飲食中攝取有機硒這一條補硒途徑，食源性補硒是改善我國居民健康狀況的必然手段。此外，硒在植物體中也具有非常重要的生理生化作用及功能。

硫轉運蛋白是主動轉運硫酸鹽時需要的載體蛋白，是植物吸收運輸硫的必需蛋白［4］。硒和硫同屬氧族元素，SeO42-和SO42-競爭細胞膜上的硫轉運蛋白［5-6］進入植物體內。在模式植物擬南芥中共克隆得到12個硫轉運蛋白基因，根據基因序列相似性，其可以分為4個亞族［7］：SULTR1、SULTR2、SULTR3、SULTR4。SULTR2亞族成員為低親和性硫轉運蛋白，負責將硫酸鹽或硒酸鹽從根皮層轉運到木質部薄壁細胞，進而運往地上部，是長距離運輸的主要轉運蛋白［8］。所有亞族成員共同完成植物體內硫酸鹽的吸收轉運工作。

硫轉運蛋白對SeO42-和SO42-選擇性吸收的能力與外界植物種類、轉運蛋白類型及硫酸鹽水平等因素有關［9］。White等［10］研究發(fā)現，高濃度SO42-會在一定程度上抑制植物對SeO42-的吸收。硫酸鹽會抑制擬南芥根系對硒酸鹽的吸收，二者相互競爭硫轉運途徑，因而高濃度硒酸鹽會使植物積累大量的硒元素，從而引發(fā)毒性效應。Shibagaki等［11］研究發(fā)現，在硒酸鹽脅迫下，缺乏硫轉運蛋白的擬南芥突變體對硒酸鹽有耐受性，表明硒酸鹽能通過硫酸鹽轉運蛋白進入植物體內。Awazuhara等［12］研究發(fā)現，AtSULTR2.1參與控制硫酸鹽的轉移，并可能調節(jié)擬南芥種子的硫狀態(tài)。

植物體內硒的含量與植物對硒的吸收和轉運能力密切相關。本研究以擬南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻（Oryza sativa）硫轉運蛋白第二亞族基因序列為模板，在谷子基因組數據庫篩選出與硫酸鹽轉運蛋白基因高度相似的同源序列，通過改良RNAiso Plus法［13］提取到谷子幼苗的RNA，并反轉錄得到谷子硫酸鹽轉運蛋白基因SiSULTR2.1的cDNA序列。利用生物信息學方法對基因的序列、系統(tǒng)發(fā)育、結構以及理化性質進行分析，利用實時熒光定量RCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）技術研究基因在Na2SeO4、Na2SO4處理后不同時間的表達變化，以求為谷子SiSULTR2.1基因硒、硫轉運機制的研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料及處理

以在山西農業(yè)大學申奉試驗地播種的晉谷21號谷子作為試驗材料。取苗期（播種后25 d）完整無病蟲害根、莖、葉部材料和灌漿期（播種后90 d）根、莖、葉、穗部材料，用液氮速凍后置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆茫糜赟iSULTR2.1在不同組織中的表達分析。

以晉谷21號為材料，選用10.0 cm×10.0 cm×8.5 cm栽培盆，品氏泥炭土培養(yǎng)，每盆播種12粒完整飽滿的種子，出苗后間苗到每盆9株幼苗。發(fā)芽前均以自來水澆灌，發(fā)芽后在2次Hoagland’s（霍格蘭氏）營養(yǎng)液澆灌之間澆灌2次同體積的自來水。將其培養(yǎng)于寧波東南儀器有限公司的RDN-260E-3D型低溫人工氣候箱中，培養(yǎng)溫度為25℃，濕度為60%/40% RH，光照強度為22000 Lx，光照時間為16 h/8 h。在三葉一心期將其分成三組，一組葉面噴施清水作為對照（130 mL/m2），一組葉面噴施12.5 μmol/L Na2SeO4，一組葉面噴施12.5 μmol/L Na2SO4，后兩組噴施體積與對照組清水體積相同。分別在處理0、12、24、48、96 h后，取完整健康幼苗，液氮速凍后置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆茫糜赟iSULTR2.1在Na2SeO4、Na2SO4處理后表達分析。

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA提取及cDNA合成

采用改良RNAiso Plus法提取到谷子幼苗的RNA，并通過BioDrop超微量紫外分光光度計檢測提取到的RNA的濃度和純度，總RNA置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。將提取得到的谷子幼苗總RNA參照TaKaRa公司反轉錄試劑盒PrimeScript?RT Reagent Kit With gDNA Eraser反轉錄說明書，利用BIO-GENER基因擴增儀反轉錄合成cDNA。

1.2.2 SiSULTR2.1生物信息學分析

利用蛋白結構域數據庫SMART（https://smart.embl-heidelberg.de/smart/show_motifs.pl）進行蛋白結構域分析。利用ExPASy-Protparam tool數據庫（http://web.expasy.org/protparam/）進行氨基酸數目、相對分子質量、理論等電點等理化性質分析；利用ExPASy-ProtScale數據庫（https://web.expasy.org/protscale/）進行蛋白質親疏水性預測；利用蛋白質信號肽在線預測工具SignalP-5.0（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0）進行信號肽預測；利用TMHMM-2.0數據庫（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php? TMHMM-2.0）預測蛋白跨膜結構；利用DNAMAN軟件對谷子硫酸鹽轉運蛋白基因的氨基酸序列進行多序列比對分析；利用MEGA7.0軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹；利用數據庫PredictProtein（https://predictprotein.org/）預測蛋白質的二級結構；利用SWISS-MODEL數據庫（https://swissmodel.expasy.org/）預測蛋白質的三級結構；利用Cell-PLoc 2.0數據庫（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/）、WoLF PSORT（https://wolfpsort.hgc.jp/）進行亞細胞定位預測。

1.2.3SiSULTR2.1表達模式分析

將1.2.1處反轉錄合成的cDNA稀釋5倍，-20℃保存，用于后續(xù)qRT-PCR分析。使用軟件Primer Premier 5.0設計引物（表1），引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。qRT-PCR反應體系：SYBR Premix Ex Taq 5.0 μL；上、下游引物（10.0 μmol/L）各0.4 μL；ROX Reference DyeⅡ 0.2 μL；cDNA 1.0 μL；加水至總體積10.0 μL；重復3次。qRT-PCR反應程序：95℃預變性3 min；95℃變性10 s，52℃退火30 s，42個循環(huán)；從65℃以每隔5 s上升0.5℃的速度上升至95℃。以Actin為內參基因，采用2－△△Ct法分析結果。

表1 引物序列Tab. 1 Sequence of primers

1.3 數據分析

所有試驗均設3次生物學重復。使用SPSS25軟件進行數據處理及多重比較，采用Microsoft Excel 2010軟件制表作圖。

2 結果與分析

2.1 SiSULTR2.1的基因鑒定

查閱文獻并在美國國立生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）搜索下載獲得擬南芥AtSULTR2.1、水稻OsSULTR2.1基因序列。以獲得的擬南芥、水稻硫轉運蛋白基因序列為參考，在Phytozome（https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）和NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）數據庫中進行Blast檢索和比對，獲得谷子硫轉運蛋白基因序列，并將其命名為SiSULTR2.1。

2.2 SiSULTR2.1蛋白的理化性質分析

2.2.1 SiSULTR2.1蛋白的保守結構域分析

理化性質分析結果顯示：SiSULTR2.1的蛋白質相對分子質量為70374.55 Da，氨基酸數目為656個；理論等電點為8.81，富含堿性氨基酸；帶負電荷的殘基總數（Asp+Glu）有47個，帶正電荷的殘基總數（Arg+Lys）有56個；SiSULTR2.1蛋白的分子式為C3195H5112N828O893S30，脂肪指數為110.61，不穩(wěn)定蛋白指數為36.88，此類蛋白為穩(wěn)定性蛋白；SiSULTR2.1蛋白中丙氨酸含量最高，占總氨基酸數的10.8%。

蛋白結構域分析數據庫SMART顯示，SiSULTR2.1蛋白具有硫轉運蛋白所特有的Sulfate-transp結構域（位置：89～471）和STAS結構域（位置：522～641）（圖1）。

圖1 SiSULTR2.1蛋白的保守結構域Fig. 1 Conservative domains of SiSULTR2.1 protein

2.2.2 SiSULTR2.1蛋白的親疏水性、信號肽及跨膜結構域預測

利用ExPASy-ProtScale數據庫對蛋白的親疏水性進行預測。如圖2所示，SiSULTR2.1蛋白親水性區(qū)域和疏水性區(qū)域是交叉排列的。Score＞0為疏水區(qū)，Score＜0為親水區(qū)，我們可以看到Score＞0區(qū)域比Score＜0區(qū)域密集。由此可表明，SiSULTR2.1編碼的蛋白是疏水性蛋白。蛋白信號肽預測結果顯示（圖3），SiSULTR2.1無信號肽位點，屬于非分泌蛋白?？缒そY構域預測顯示，SiSULTR2.1有9個跨膜結構域（圖4），表明SiSULTR2.1蛋白屬于跨膜蛋白。

圖2 SiSULTR2.1蛋白的親疏水性預測Fig. 2 Prediction of the hydrophobicity of SiSULTR2.1 protein

圖3 SiSULTR2.1蛋白的信號肽預測Fig. 3 Prediction of SiSULTR2.1 protein signal peptide

圖4 SiSULTR2.1蛋白跨膜結構域預測Fig. 4 Prediction of the transmembrane domain of SiSULTR2.1 protein

2.3 SiSULTR2.1蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析

利用DNAMAN軟件將谷子硫轉運蛋白第二亞族基因與水稻、玉米（Zea mays）、大豆（Glycine max）、擬南芥硫轉運蛋白第二亞族基因進行多序列比對，發(fā)現其序列比對一致性達到71.79%。將谷子硫轉運蛋白氨基酸序列與水稻、玉米、擬南芥硫轉運蛋白氨基酸序列分別進行雙序列比對，分析發(fā)現其與水稻、玉米同源序列相似性較高，分別為85.45%、88.91%，與擬南芥同源序列相似性不高，為55.99%。

根據4個物種的10個硫轉運蛋白基因氨基酸序列，利用MEGA7.0軟件構建進化樹。由圖5可知，谷子與玉米、水稻聚為一大類，其與玉米親緣關系最近。谷子、玉米、水稻均為禾本科作物，親緣關系較近；谷子和玉米均為C4作物，而水稻為C3作物，因而谷子玉米親緣關系最近。

圖5 SiSULTR2.1蛋白與其他植物SULTR2蛋白的系統(tǒng)進化樹分析Fig. 5 Phylogenetic analysis of protein between SiSULTR2.1 and SULTR2 of other plantsZm：玉米；Os：水稻；Gm：大豆；At：擬南芥。Zm: Zea mays; Os: Oryza sativa; Gm: Glycine max; At: Arabidopsis thaliana.

2.4 SiSULTR2.1蛋白的結構分析

2.4.1 SiSULTR2.1蛋白的二級結構預測

數據庫PredictProtein預測顯示，谷子硫酸鹽轉運蛋白二級結構主要由α-螺旋、β-折疊和無規(guī)則卷曲構成。SiSULTR2.1蛋白二級結構α-螺旋、β-折疊和無規(guī)則卷曲占比分別為25.30%、8.54%、66.16%。SiSULTR2.1蛋白含有豐富的α-螺旋和無規(guī)則卷曲結構，其中α-螺旋可以形成多個跨膜結構域。

2.4.2 SiSULTR2.1蛋白的三級結構預測

利用SWISS-MODEL數據庫在線構建SiSULTR2.1的三維結構模型。結果顯示，SiSULTR2.1可以較明顯地區(qū)分出STAS結構域和Sulfate-transp結構域（圖6a）。其中STAS結構域（圖6b）位于羧基末端（C端），含有核苷三磷酸（nucleotide triphosphate，NTP）結合位點［9］，通過磷酸化和去磷酸化過程［19］調控SeO42-的轉運活力；Sulfate-transp結構域（圖6c）位于氨基末端（N端），與α-螺旋相互纏繞形成了一個通道結構，有利于硒酸鹽的跨膜轉運。

圖6 SiSULTR2.1蛋白的三級結構及STAT結構域、Sulfate-transp結構域預測Fig. 6 Prediction of tertiary structure of SiSULTR2.1 protein, STAS domain and Sulfate-transp domain （a）SiSULTR2.1蛋白的三級結構預測；（b）STAS結構域；（c）Sulfate-transp結構域。(a) Prediction of tertiary structure of SiSULTR2.1 protein; (b) STAS domain; (c) Sulfate-transp domain.

2.4.3 SiSULTR2.1蛋白的亞細胞定位預測

利用Cell-PLoc和WoLF PSORT數據庫對SiSULTR2.1進行亞細胞定位預測，結果略有不同。Cell-PLoc預測結果顯示，該蛋白定位于線粒體、葉綠體的可能性不大，定位于細胞膜上的可能性較大。WoLF PSORT預測結果顯示，該蛋白定位于液泡膜上。上述結果表明，SiSULTR2.1可能以一種膜結合蛋白形式參與SeO42-在細胞的跨膜轉運。

2.5 SiSULTR2.1的表達模式分析

2.5.1SiSULTR2.1的組織表達特異性分析

谷子苗期根、莖、葉（圖7a）和灌漿期根、莖、葉、穗（圖7b）的qRT-PCR結果顯示，SiSULTR2.1在谷子不同部位均有表達，且在不同時期表達量有差異，表現出時空特異性。SiSULTR2.1在苗期莖中的表達量最高，在灌漿期莖、葉片中的表達量均較高。SiSULTR2.1在不同時期根中的表達量均最低，在灌漿期穗中的表達量也較低。

圖7 SiSULTR2.1在谷子不同時期不同組織中的表達Fig. 7 Expression of SiSULTR2.1 in different tissues of millet in different periods（a）SiSULTR2.1在谷子苗期不同組織中的表達；（b）SiSULTR2.1在谷子灌漿期不同組織中的表達。差異顯著性分析采用LSD法。*P＜0.01；***P＜0.001；****P＜0.0001。(a) Expression of SiSULTR2.1 in various tissues of millet at seedling stage; (b) Expression of SiSULTR2.1 in various tissues of millet at filling stag. LSD method was used to analyze the difference significance. *P＜0.01; ***P＜0.001; ****P＜0.0001.

2.5.2SiSULTR2.1在Na2SeO4、Na2SO4處理后的表達分析

由圖8可知，SiSULTR 2.1對Na2SeO4、Na2SO4處理均有表達響應，但其對Na2SeO4和Na2SO4處理表達響應的模式不一致。Na2SeO4處理12 h時，谷子幼苗SiSULTR 2.1的相對表達量與對照組相近，但處理24、48、96 h時幼苗中的相對表達量均顯著高于對照組，且96 h時表達量達到峰值，是對照組的6.75倍。Na2SO4處理12 h時，谷子幼苗SiSULTR 2.1的相對表達量達到峰值，是對照組的17.75倍，處理24、48 h時幼苗中的相對表達量均顯著高于對照組，但與12 h相比表達量呈下降趨勢，且96 h表達量低于對照組。

圖8 SiSULTR2.1在Na2SeO4、Na2SO4處理下的表達分析Fig. 8 Expression analysis of SiSULTR2.1 under various Na2SeO4 and Na2SO4 treatment conditions（a）SiSULTR2.1在Na2SeO4處理下的表達；（b）SiSULTR2.1在Na2SO4處理下的表達。差異顯著性分析采用LSD法。***P＜0.001；****P＜0.0001。(a) Expression of SiSULTR2.1 in Na2SeO4 treatment conditions; (b) Expression of SiSULTR2.1 in Na2SO4 treatment conditions. LSD method was used to analyze the difference significance. ***P＜0.001; ****P＜0.0001.

3 討論

SiSULTR2.1編碼的谷子硫轉運蛋白含有硫轉運蛋白所特有的STAS結構域和Sulfate-transp結構域［14］，與前人在茶樹（Camellia sinensis）［9］、馬鈴薯（SolanumtuberosumL.）［15］、短柄草［Brachypodiumdistachyon（L.）Beauv.］［16］上的研究結果一致。該基因編碼的蛋白質含有多個跨膜結構域，是一種跨膜轉運蛋白。根據序列同源性，可將SiSULTR2.1歸屬于硫轉運蛋白基因家族第二亞族基因，主要負責硒、硫的遷移轉運［17］。SiSULTR2.1是疏水性蛋白，無信號肽序列，屬非分泌蛋白，這些特征與玉米、水稻、薄殼山核桃［Carya illinoinensis（Wangenh.）K. Koch］［18］的硫轉運蛋白具有高度的相似性。

組織特異性表達結果揭示，SiSULTR2.1在谷子根、莖、葉、穗中均有表達，且表達模式與張晶晶等［9］在茶樹上的研究結果相近，具有明顯的組織特異性。SiSULTR2.1在谷子莖、葉片中的表達量較高，但在根、穗中表達量很低。SiSULTR2.1在根中表達量很低，張晶晶［19］的研究中也有類似發(fā)現。SiSULTR2.1在穗中較低的表達量與前人研究結果有差異，可能與品種的特異性有關。

本研究發(fā)現，SiSULTR2.1對硒、硫處理有不同的響應模式。Na2SeO4處理結果顯示，處理后12 h內SiSULTR2.1表達變化量不大，24 h后表達量顯著增加，且在處理后96 h達到最高。SiSULTR2.1在Na2SeO4處理下隨著處理時間的延長，相對表達量總體呈上升趨勢，倪鐘濤等［18］和胡玉榮等［20］也有類似發(fā)現。Na2SO4處理結果顯示，處理后12 hSi-SULTR2.1的表達就能被顯著誘導，處理后24、48 h 其表達量有所下降，處理后96 h表達量恢復到原來的水平。這可能是因為硫是谷子生長發(fā)育所必須的大量元素，谷子幼苗噴施Na2SO4后，硫轉運蛋白基因受SO42-誘導短時間內大量表達用以轉運硫元素。由此可見，SiSULTR2.1能在短時間內迅速響應Na2SO4的誘導，而響應Na2SeO4誘導需要較長時間。Kataoka等［21］研究發(fā)現，SULTR2;1與SULTR3;5均表達于根系維管組織中，主要負責硫酸鹽向地上部運輸，但是二者是否同樣負責硒酸鹽從根部向地上部的運輸還未可知。

谷子硫轉運蛋白基因家族成員眾多，它們均可能在吸收轉運Na2SeO4或Na2SO4的某環(huán)節(jié)中有特定的作用［22］。本研究初步探討了谷子SiSULTR2.1對硒、硫的響應，但該基因在硒、硫的吸收、轉運方面具體的功能仍需進一步研究探討。