Metafer 5玻片自動掃描系統(tǒng)在循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測中輔助診斷的應(yīng)用

蔣婷婷，王 丹，李和沛，李燕雛*

（四川大學(xué)華西醫(yī)院 a. 頭頸腫瘤科；b. 腫瘤放療科，成都 610041）

2021年，美國癌癥學(xué)會（American Cancer Society Association，ASCO）發(fā)布了最新版癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，全球約有1930萬例新發(fā)癌癥病例，其中1000萬例癌癥患者死亡［1］。癌癥的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者死亡的主要原因。既往數(shù)據(jù)顯示［2］，癌癥的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移在發(fā)病早期就已出現(xiàn)，但常規(guī)影像學(xué)和血液指標(biāo)檢查難以發(fā)現(xiàn)早期癌癥，且不能實(shí)時(shí)動態(tài)監(jiān)測病情的發(fā)展，可能導(dǎo)致患者錯(cuò)過最佳的治療時(shí)機(jī)。新一代腫瘤標(biāo)志物循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cells，CTCs）檢測不僅能輔助腫瘤早期診斷、實(shí)時(shí)監(jiān)測病情的發(fā)展、評估療效，還能進(jìn)一步通過CTCs開展耐藥機(jī)制研究［2］，為病人制定精準(zhǔn)化的治療方案。

目前，CTCs富集和檢測的方法包括CellsearchTM、CellcollectorTM等，他們各具優(yōu)勢，并已被應(yīng)用于科研及臨床，但在臨床使用推廣中還存在諸多問題，如特異性差、靈敏度低和結(jié)果重現(xiàn)性差等［3-4］。美國賽特公司研發(fā)的差相富集-熒光原位雜交（subtraction enrichment-immunostainning fluorescencein situhybridization，SE-iFISH）技術(shù)是一種CTCs反向富集系統(tǒng)，能有效分離富集的CTCs，具有較高的敏感性和特異性［5-6］。經(jīng)過分離富集的CTCs因采用熒光免疫抗體和熒光探針染色，需進(jìn)一步在熒光顯微鏡下分析熒光信號的表達(dá)情況，以對其進(jìn)行判別。在目前的人工鏡檢狀態(tài)下，人工視力疲勞、技師閱片經(jīng)驗(yàn)差別、人眼生理視覺范圍限制、人工耗時(shí)長等均成為人工鏡檢判讀CTCs的限制性缺陷，導(dǎo)致閱片效率和準(zhǔn)確度均降低。目前，高通量玻片自動掃描系統(tǒng)（Metafer 5）是一種具有多種用途的玻片數(shù)字化掃描及分析系統(tǒng)，在生命科學(xué)領(lǐng)域顯微圖像分析上實(shí)現(xiàn)了智能化自動分析，能開展自動掃描系統(tǒng)智能、快速、全自動閱片，精準(zhǔn)定位并存儲所有細(xì)胞圖像的數(shù)字坐標(biāo)，明顯縮短了閱片時(shí)間，提高了閱片效率和準(zhǔn)確率。本研究采用腫瘤患者外周血液樣本驗(yàn)證及評價(jià)Metafer 5自動掃描平臺檢測CTCs的準(zhǔn)確性和靈敏度，建立完善的試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作流程，為臨床使用提供參考。

1 材料與方法

1.1 研究對象

研究對象為四川大學(xué)華西醫(yī)院2015年12月至2016年6月收治的34例腫瘤患者。其中，女性18例，男性16例，年齡28～65歲，中位年齡為46.5歲，平均年齡為（48.51±0.61）歲；肝癌6例，胰腺癌2例，神經(jīng)膠質(zhì)瘤4例，胃癌5例，腎癌2例，鼻咽癌15例。本研究已獲四川大學(xué)華西醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，倫理編號為2015年審（141）號，且所有受試者均自愿簽訂了知情同意書。

1.2 試劑與儀器

SE-iFISH檢測試劑盒購于賽特生物有限公司（Cytelligen，美國），包括外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞富集試劑盒和腫瘤細(xì)胞瘤標(biāo)-iFISH檢測試劑盒。

Metafer 5玻片自動掃描系統(tǒng)由Zeiss Imager Z2正置熒光顯微鏡（Zeiss，德國）、電動載物臺、CCD相機(jī)、計(jì)算機(jī)和Metafer 5 CTCs掃描軟件模塊、CTCs圖像采集軟件模塊、CTCs細(xì)胞計(jì)數(shù)信號模塊、CTCs圖像處理模塊和CTCs數(shù)據(jù)儲存模塊（MetaSystems，德國）組成。人工鏡檢使用尼康正置熒光生物顯微鏡Ni-U（Nikon，日本）。

1.3 CTCs檢測操作流程

經(jīng)患者肘靜脈采血6 mL于BD抗凝黃頭采血管中（Becton，Dickinson and Company），置于4℃避光保存，樣本離體24 h內(nèi)檢測。應(yīng)用密度梯度離心法去除血液中的紅細(xì)胞，用CD45磁珠抗體去除血液中的白細(xì)胞，應(yīng)用免疫熒光技術(shù)對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行染色，再利用熒光原位雜交技術(shù)標(biāo)記8號染色體著絲粒位點(diǎn)（centromere enumeration probe，CEP8）。Anti-EpCAM-FITC標(biāo)記腫瘤特異性抗原EpCAM（鏡下顯示綠色），Anti-CD45-TexRed標(biāo)記白細(xì)胞膜蛋白特異性抗原CD45（鏡下顯示紅色），4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamino-2-phenyl indole，DAPI）Mounting media標(biāo)記細(xì)胞核區(qū)域的DNA（鏡下顯示藍(lán)色），CEP8 DNA Probe-Rhodamie標(biāo)記CEP8的DNA片段（鏡下顯示橙色）。經(jīng)過熒光染色后的細(xì)胞懸液加入緩沖液清洗后再加入細(xì)胞固定液，涂于專用的格式化載玻片框內(nèi)，然后用蓋玻片封片。上述操作完成后，在熒光顯微鏡下分別采用人工鏡檢和Metafer 5玻片自動掃描系統(tǒng)兩種方法閱片。

人工鏡檢閱片中，每張載玻片分別由2名經(jīng)驗(yàn)豐富的技師閱片。在長壽命金屬鹵化物熒光X-Cite 200DC System（X-Cite，美國）光源下，先將正置熒光顯微鏡Axio Imager.Z2（ZEISS，德國）的物鏡調(diào)至10×（或者20×），按照“從上往下、從左至右”的讀片規(guī)則依次讀片，在Filter set for DAPI（激發(fā)波長范圍為352～402 nm，發(fā)射波長范圍為417～477 nm）、Filter set for FITC/Sp GreenTM（激發(fā)波長范圍為435～475 nm，發(fā)射波長范圍為530～543 nm）、Filter set for Sp GoldTM/Sp OrangeTM（激發(fā)波長范圍為500～590 nm，發(fā)射波長范圍為526～546 nm）和Filter set for TexasRed? and Sp Red（激發(fā)波長范圍為542～528 nm，發(fā)射波長范圍為606～644 nm）四種不同熒光濾片下觀察熒光表達(dá)情況。首先利用Filter set for TexasRed? and Sp Red在藍(lán)光激發(fā)下找出CD45陰性細(xì)胞，并利用Filter set for Sp GoldTM/Sp OrangeTM在綠光激發(fā)下觀察及確定8號染色體的數(shù)目（橙色熒光），再進(jìn)一步自動調(diào)換至Filter set for DAPI濾片，在紫光激發(fā)下觀察DAPI標(biāo)記細(xì)胞核區(qū)域的DNA（藍(lán)色熒光），最后自動調(diào)換濾片至Filter set for FITC/Sp GreenTM，在藍(lán)光激發(fā)下觀察熒光染料Anti-EpCAM-FITC標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞蛋白抗體EpCAM（綠色熒光）。

Metafer 5玻片自動掃描系統(tǒng)閱片中可設(shè)置8張載玻片的掃描參數(shù)。具體步驟主要如下：1）命名分類器類型；2）篩選出最佳10×PA物鏡后，掃描平臺對整張載玻片分區(qū)并自動對焦，根據(jù)掃描DAPI細(xì)胞核染色區(qū)域，計(jì)算機(jī)自動推算出核周紅色、綠色平均熒光強(qiáng)度和細(xì)胞周圍的背景強(qiáng)度；3）根據(jù)優(yōu)化后的各個(gè)熒光通道的曝光時(shí)間和曝光方式，Metafer 5自動化掃描平臺設(shè)置相應(yīng)的掃描程序參數(shù)，CCD相機(jī)進(jìn)一步對載玻片的各個(gè)分區(qū)進(jìn)行多層圖像拍攝，計(jì)算機(jī)根據(jù)多層圖像拍攝后算出的熒光數(shù)據(jù)自動對掃描圖像進(jìn)行篩選分類計(jì)數(shù)，同時(shí)對篩選出的高質(zhì)量圖像進(jìn)行數(shù)據(jù)儲存，生成圖像庫文件夾（*.MSD）和全分辨率視場文件夾（*.MSX）；4）利用計(jì)算機(jī)自動篩選圖片庫分類和直方圖等統(tǒng)計(jì)功能選擇特定滿足要求的CTCs圖像。

1.4 CTCs的判讀參考標(biāo)準(zhǔn)

CTCs的判讀標(biāo)準(zhǔn)為腫瘤標(biāo)志物EpCAM陽性或陰性，白細(xì)胞抗原CD45陰性，細(xì)胞核DAPI陽性，CEP8陽性。即當(dāng)EpCAM+/CD45-/DAPI+同時(shí)8號染色體的個(gè)數(shù)≥2個(gè)，或EpCAM-/CD45-/DAPI+同時(shí)8號染色體的個(gè)數(shù)＞2個(gè)時(shí)，判定該細(xì)胞為CTCs［7-9］。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用IBM SPSS 26.0版本對收集的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，正態(tài)分布計(jì)量資料用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，非正態(tài)分布計(jì)量資料用中位數(shù)（最小值，最大值）表示，等級資料采用斯皮爾曼相關(guān)系數(shù)分析，定量資料之間的比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料之間的相關(guān)分析采用卡方檢驗(yàn)。0.1＜P＜0.05 表示顯著性差異，P＞0.05表示無顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 格式化載玻片的區(qū)域化自動對焦熒光優(yōu)化結(jié)果

整張載玻片上存在多個(gè)凹凸不平的平面，將載玻片平均分為81等份后進(jìn)行區(qū)域化對焦。用SEiFISH技術(shù)對分離富集的CTCs圖像進(jìn)行處理時(shí)，難以清晰判斷細(xì)胞質(zhì)區(qū)域的染色，非熒光背景嚴(yán)重干擾格式化載玻片的區(qū)域化自動對焦，因此需為自動對焦選擇適配的對焦染料。通過對DAPI、Rhodamie、FITC、TexRed四種熒光染色劑篩選（表1），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DAPI的熒光強(qiáng)度高，且受非特異性染色影響小，是最適用于Metafer 5區(qū)域化自動對焦的熒光染料。

表1 四種熒光染料自動對焦結(jié)果統(tǒng)計(jì)表Tab. 1 Statistical table of autofocusing results of four kinds of fluorescent dyes

2.2 Metafer 5玻片自動掃描系統(tǒng)的物鏡鏡頭優(yōu)化結(jié)果

為了比較10×PA（Objective “Plan-Apochromat” 10×/0.45 M27，平場復(fù)消色差物鏡）和10×PN（Objective “EC Plan-Neofluar”10×/0.30 M27，增強(qiáng)反差型平場熒光物鏡）兩種物鏡鏡頭的效果，用上述兩種鏡頭分別掃描CTCs樣本。對10例富集染色后的格式化載玻片進(jìn)行閱片，其統(tǒng)計(jì)結(jié)果如下（表2）：10例樣本載玻片中，10×PA物鏡人工鏡檢和Metafer 5玻片自動掃描系統(tǒng)判讀CTCs的計(jì)數(shù)分別為（10.10±4.56）、（10.20±4.71）個(gè)，相對于人工鏡檢，Metafer 5玻片自動掃描系統(tǒng)掃描的CTCs數(shù)量無差異（P＞0.05）。10×PN物鏡人工鏡檢和Metafer 5玻片自動掃描系統(tǒng)判讀CTCs的計(jì)數(shù)分別為（8.70±4.27）和（6.90±3.41）個(gè)，相對于人工鏡檢，Metafer 5玻片自動掃描系統(tǒng)掃描CTCs的個(gè)數(shù)多1.8個(gè)（P＞0.05）。用10×PA物鏡經(jīng)自動掃描系統(tǒng)判讀CTCs，7例（7/10，70.0%）載玻片的CTCs計(jì)數(shù)與人工鏡檢判讀結(jié)果一致，2例（2/10，20.0%）用10×PA物鏡經(jīng)自動掃描系統(tǒng)CTCs數(shù)量比人工鏡檢多，1例（1/10，10.0%）用10×PA物鏡經(jīng)自動掃描系統(tǒng)CTCs數(shù)量比人工鏡檢少。

表2 10×PA和10×PN兩種物鏡鏡頭的掃描結(jié)果統(tǒng)計(jì)表Tab. 2 Statistical analysis of scanning results of 10×PA and 10×PN objective lenses

在這10例血樣載玻片中，10×PA物鏡人工鏡檢和Metafer 5玻片自動掃描系統(tǒng)判讀CTCs的平均時(shí)間分別為（114.70±22.08）、（41.30±4.62）min，相對于人工法，自動掃描系統(tǒng)閱片減少了73.40 min（P＜0.05）；10×PN物鏡人工鏡檢和Metafer 5玻片自動掃描系統(tǒng)閱讀的平均時(shí)間分別為（116.50±47.38）和（49.80±6.58）min，相對于人工鏡檢，自動掃描系統(tǒng)閱片減少了66.70 min（P＜0.05）。10×PA物鏡比10×PN物鏡掃描的時(shí)間更短，更節(jié)省時(shí)間，降低了時(shí)間成本（表2）。

10×PA的物鏡鏡頭判讀CTCs所耗的時(shí)間更短、計(jì)數(shù)更精準(zhǔn)，掃描處理后的圖像更清晰，CTCs圖像質(zhì)量更佳。

2.3 Metafer 5玻片自動掃描系統(tǒng)的掃描效率優(yōu)化結(jié)果

基于表3中Sample 11至Sample 20的樣本數(shù)據(jù)，通過10×PA物鏡在人工鏡檢和Metafer 5玻片自動掃描系統(tǒng)判讀10張樣本CTCs的平均時(shí)間分別為（121.00±12.77）和（149.00±19.27）min，通過20×PA物鏡在人工鏡檢和Metafer 5玻片自動掃描系統(tǒng)判讀10張樣本CTCs的平均時(shí)間分別為（36.70±9.36）和（88.80±7.15）min。相對于人工鏡檢，10×PA物鏡和20×PA物鏡自動掃描系統(tǒng)閱片分別減少了84.30 min（P＜0.05）、60.20 min（P＜0.05），10×PA物鏡比20×PA物鏡掃描時(shí)間更短，掃描效率更高。在10例樣片中，10×PA物鏡和20×PA物鏡在Metafer 5玻片自動掃描系統(tǒng)判讀CTCs的平均計(jì)數(shù)分別為（10.70±5.27）、（10.00±5.70）個(gè)，10×PA物鏡比20×PA鏡掃描CTCs個(gè)數(shù)多0.7個(gè)（P＞0.05）。10×PA的物鏡掃描CTCs的個(gè)數(shù)較多，所耗費(fèi)的時(shí)間更短（表3）。

表3 10×PA和20×PA兩種物鏡鏡頭的掃描結(jié)果統(tǒng)計(jì)表Tab. 3 Statistical analysis of scanning results of 10×PA and 20×PA objective lenses

2.4 Metafer 5玻片自動掃描系統(tǒng)的熒光曝光時(shí)間優(yōu)化結(jié)果

采用10×PA物鏡在Metafer 5玻片自動掃描系統(tǒng)上分別調(diào)試DAPI、FITC、TexRed、Rhodamie四種熒光通道的曝光時(shí)間和曝光方式（圖1）。DAPI（亮藍(lán)色）曝光時(shí)間試運(yùn)行設(shè)置為0.001、0.003、0.004 s，經(jīng)測試，DAPI篩選CTCs的最佳曝光時(shí)間為0.003 s；FITC（亮綠色）曝光時(shí)間試運(yùn)行設(shè)置為0.700、0.800、0.900 s，經(jīng)測試，F(xiàn)ITC最佳曝光時(shí)間為0.800 s；TexRed（紅色）曝光時(shí)間試運(yùn)行設(shè)置為0.030、0.040、0.050 s，經(jīng)測試，TexRed篩選CTCs的最佳曝光時(shí)間為0.040 s；Rhodamie（橙色）曝光時(shí)間試運(yùn)行設(shè)置為0.066、0.068、0.070 s，經(jīng)測試，Rhodamie篩選CTCs的最佳曝光時(shí)間為0.068 s。

圖1 8號染色體為三倍體，EpCAM陽性的CTCs在不同曝光時(shí)間的圖示（100×）Fig. 1 Illustration of four fluorescence of CTCs at different exposure times (100×)圖a1、a2和a3為FITC曝光時(shí)間分別為0.700、0.800、0.900 s；圖b1、b2和b3為TexRed曝光時(shí)間分別為0.030、0.040、0.050 s；圖c1、c2和c3為Rhodamie曝光時(shí)間分別為0.066、0.068、0.070 s；圖d1、d2和d3為DAPI曝光時(shí)間分別為0.001、0.003、0.004 s；圖e1、e2和e3為四種熒光的合成圖。DAPI+：亮藍(lán)色/DNA；Rhodamie+：橙色/CEP8；TexRed+：紅色/CD45；FITC+：亮綠色/EpCAM。Figures a1, a2 and a3 shown FITC exposure time of 0.700, 0.800 and 0.900 s, respectively; Figures b1, b2 and b3 shown TexRed exposure time of 0.030, 0.040 and 0.050 s, respectively; Figures c1, c2 and c3 shown Rhodamie exposure time of 0.066, 0.068 and 0.070 s, respectively; Figures d1, d2 and d3 shown DAPI exposure time of 0.001, 0.003 and 0.004 s, respectively; Figures e1, e2 and e3 were the merge figures. DAPI+: Blue/DNA; Rhodamie+: Orange/CEP8; TexRed+: Red/CD45; FITC+: Green/EpCAM.

2.5 Metafer 5玻片自動掃描系統(tǒng)和人工鏡檢的 檢出率比較結(jié)果

本研究的34例樣本來源于肝癌、胰腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、胃癌、腎癌、鼻咽癌等臨床常見腫瘤患者的新鮮血液，應(yīng)用Metafer 5玻片自動掃描系統(tǒng)總共檢測出CTCs的有34例，CTCs的陽性檢出率為100.00%（34/34）；采用人工鏡檢總共檢測出CTCs的有31例，CTCs的陽性檢出率為91.17%（31/34）。與人工鏡檢相比較，Metafer 5玻片自動掃描系統(tǒng)比人工鏡檢CTCs陽性檢出率高了8.83%。

3 討論

Metafer系列軟件是具有多種功能的玻片掃描平臺，已廣泛應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)、毒理學(xué)、病理學(xué)、細(xì)胞遺傳診斷等領(lǐng)域。Metafer系列軟件版本有Metafer 4和Metafer 5，Metafer 4被應(yīng)用于臨床產(chǎn)前診斷染色體核型分析［10］和輻射生物學(xué)的微核檢測［11］，而Metafer 5被用于臨床CTCs檢測的適用性能研究還暫未報(bào)道。

SE-iFISH循環(huán)腫瘤細(xì)胞富集技術(shù)不依賴CTCs的形態(tài)、大小以及細(xì)胞表面標(biāo)志物（EpCAM、CK18/19、PD-L1等）的表達(dá)。使用SE-iFISH法不僅能分離計(jì)數(shù)CTCs，還能對CTCs進(jìn)行分型。該方法具有高度的敏感性和特異性［12］。Li等［13］的研究顯示，納入的進(jìn)展期胃癌患者其SE-iFISH技術(shù)CTCs總檢測率為90.50% ，而CellSearchTM系統(tǒng)檢測率僅為54.80%。隨著二代測序技術(shù)的發(fā)展，CTCs的簡單計(jì)數(shù)將不再能滿足臨床及試驗(yàn)研究的需要，臨床需要更深入的基因分子數(shù)據(jù)用于腫瘤耐藥性分析及前瞻性藥物敏感性分析，以指導(dǎo)臨床用藥及患者預(yù)后判斷。研究顯示，腫瘤細(xì)胞內(nèi)核型異倍體數(shù)目高低與腫瘤的惡性程度成正相關(guān)［14-15］，同時(shí)，腫瘤細(xì)胞內(nèi)的癌基因KRAS及抑癌基因TP53的突變頻率較正常細(xì)胞高［16-18］。本研究在采用SE-iFISH法富集待檢測的循環(huán)腫瘤細(xì)胞基礎(chǔ)上，整合使用Metafer 5玻片自動掃描系統(tǒng)，建立全自動掃描平臺，通過自動對焦、實(shí)時(shí)圖像處理、自動尋找等獲得高質(zhì)量的熒光圖像和位置數(shù)據(jù)，然后掃描整張載玻片，最后進(jìn)行自動化判別CTCs，為進(jìn)一步的腫瘤單細(xì)胞基因組分析奠定了基礎(chǔ)；同時(shí)，全自動掃片不僅降低了人力和時(shí)間成本，還避免了人為經(jīng)驗(yàn)缺失引起的錯(cuò)誤檢測結(jié)果。

既往研究證實(shí)，熒光背景、曝光強(qiáng)度、觀察物鏡性能及觀察物鏡倍數(shù)是影響CTCs自動判定的重要影響因素［19］。一方面，在載玻片和蓋玻片上有熒光雜質(zhì)、纖維等較多非特異性熒光背景影響情況下，Metafer 5玻片自動掃描系統(tǒng)不能通過Rhodamie、FITC、TexRed、DAPI 四種熒光準(zhǔn)確對焦，從而導(dǎo)致掃描范圍面積變小。同時(shí)，本研究結(jié)合DAPI、Rhodamie、FITC、TexRed 四種熒光染色劑的發(fā)光特點(diǎn)，通過比對后最終選定亮藍(lán)色的DAPI為區(qū)域性對焦的染料，一定程度上解決了本系統(tǒng)對于區(qū)域性自動掃描的對焦問題。不僅如此，本研究通過改進(jìn)制備CTCs的標(biāo)準(zhǔn)操作流程，進(jìn)一步調(diào)整了DAPI的使用順序，使DAPI更容易穿透細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，與細(xì)胞核的DNA結(jié)合更牢固，熒光顯微鏡下DAPI在藍(lán)色熒光通道下更明亮，實(shí)現(xiàn)了更精準(zhǔn)的區(qū)域化對焦。另一方面，Metafer 5玻片自動掃描系統(tǒng)在使用過程中可出現(xiàn)因臨床樣本多樣化導(dǎo)致漏篩CTCs的風(fēng)險(xiǎn)。既往研究發(fā)現(xiàn)，對于CD45強(qiáng)表達(dá)的細(xì)胞，載玻片熒光背景非特異性染色較強(qiáng)，小細(xì)胞核CEP8探針較多，可能是因?yàn)樘结樰^弱的橙色熒光被紅色熒光掩蓋，導(dǎo)致軟件識別時(shí)被漏掉［20］。為了避免強(qiáng)紅色熒光背景和非特異性染色導(dǎo)致曝光不夠，引起系統(tǒng)錯(cuò)判CTCs細(xì)胞或丟失視野中其他細(xì)胞的情況，軟件設(shè)置了一個(gè)最低曝光時(shí)間，但同時(shí)也可能因曝光時(shí)間低，導(dǎo)致一些弱表達(dá)EpCAM抗體的腫瘤細(xì)胞因背景紅色熒光曝光時(shí)間過低而丟失。因此，在保證CTCs計(jì)數(shù)準(zhǔn)確的前提下，本研究設(shè)置了合理的紅色熒光曝光時(shí)間為0.040 s。為在臨床使用中保障檢測的準(zhǔn)確性，可經(jīng)人工核查分析整張樣片的熒光表達(dá)情況。基于本研究結(jié)果，我們認(rèn)為，弱表達(dá)EpCAM抗體的腫瘤細(xì)胞檢測丟失可能與患者血液樣本中的蛋白含量、樣片保存時(shí)間、規(guī)范采血、中央運(yùn)輸樣本等各個(gè)環(huán)節(jié)有關(guān)。為獲得精確的檢測結(jié)果，必須建立標(biāo)準(zhǔn)化的制備CTCs流程和質(zhì)量控制體系，如采血標(biāo)本要正確保存、運(yùn)輸，制作樣片的試劑質(zhì)量要有保證，操作環(huán)境需要保持潔凈等。同時(shí)，通過10×PA物鏡以及20×PA物鏡分別在人工鏡檢和Metafer 5玻片自動掃描系統(tǒng)中各判讀10張樣本，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用10×PA鏡頭掃描的圖片更為清晰、掃描效率更高，提示該鏡頭更能有效輔助識別CTCs。

綜上所述，Metafer 5玻片自動掃描系統(tǒng)具有高特異性、高敏感性、重復(fù)性好和完全自動化的特點(diǎn)，規(guī)范了CTCs的判別標(biāo)準(zhǔn)，有效緩解了工作人員長期在暗室中的視力損傷問題，將工作人員從繁冗的閱片工作中解脫出來，適用于臨床應(yīng)用。但Metafer 5玻片自動掃描系統(tǒng)須根據(jù)各實(shí)驗(yàn)室實(shí)際檢測條件精準(zhǔn)優(yōu)化設(shè)備參數(shù)，以保障檢測的靈敏度及準(zhǔn)確性。不僅如此，Metafer 5玻片自動掃描系統(tǒng)仍需大量的新鮮臨床標(biāo)本進(jìn)一步驗(yàn)證其適用性，根據(jù)臨床實(shí)際掃片過程中發(fā)現(xiàn)的問題來更新軟件參數(shù)，優(yōu)化軟件程序，提高軟件的通用性和正確率。