基于相圖下的細(xì)胞折射率與厚度雙波長(zhǎng)解耦方法

廖景榮，冒菲菲，王馨云，王子琦，徐媛媛*，薛雙雙，孫玉娟，王亞偉

（江蘇大學(xué) a. 機(jī)械工程學(xué)院；b. 物電學(xué)院，鎮(zhèn)江 212013）

細(xì)胞是生物的基本單位，其狀態(tài)關(guān)系著整個(gè)生命體的健康。而生物細(xì)胞的三維折射率分布中含有豐富的關(guān)于細(xì)胞的外表形態(tài)、內(nèi)部亞結(jié)構(gòu)和生化成分的信息［1］。因此，細(xì)胞折射率分布的精準(zhǔn)檢測(cè)對(duì)醫(yī)學(xué)診斷和生物學(xué)醫(yī)學(xué)研究具有十分重要的意義［2］。在醫(yī)學(xué)臨床診斷方面，光子晶體全內(nèi)反射（photonic crystal-total internal reflection，PC-TIR）生物傳感器利用細(xì)胞折射率作為唯一的對(duì)比參數(shù)，實(shí)現(xiàn)了單個(gè)前列腺癌細(xì)胞的檢測(cè)［3］；膀胱癌組織比正常膀胱組織的散射強(qiáng)度更強(qiáng)，說(shuō)明其折射率的檢測(cè)可用于膀胱癌癥的臨床診斷［4］；特別是癌癥早期檢測(cè)診斷時(shí)更加需要細(xì)胞相對(duì)折射率的精準(zhǔn)檢測(cè)，才能從光譜數(shù)據(jù)中精確定量地獲得細(xì)胞的形態(tài)信息［5］。因此，細(xì)胞折射率的檢測(cè)方法可成為細(xì)胞疾病診斷的一種有效方法。在生物學(xué)醫(yī)學(xué)研究方面，神經(jīng)元放電時(shí)，離子濃度的變化會(huì)引起細(xì)胞折射率的改變［6］；人宮頸癌（Hela）細(xì)胞在細(xì)胞周期的不同階段，其折射率會(huì)發(fā)生相應(yīng)的改變［7］。此外，細(xì)胞折射率分布的檢測(cè)還可用于細(xì)胞免疫學(xué)、細(xì)胞化學(xué)、細(xì)胞分子生物學(xué)等幾乎醫(yī)學(xué)的各個(gè)學(xué)科方面［8］。

血細(xì)胞無(wú)色透明的性質(zhì)使得普通顯微鏡很難對(duì)其結(jié)構(gòu)及內(nèi)部物質(zhì)進(jìn)行清晰的成像［9］，從而出現(xiàn)了若干成像新技術(shù)，如超分顯微、熒光顯微鏡、激光掃描共聚焦顯微、光學(xué)相干層析成像［10］、數(shù)字全息相位顯微和定量相位成像技術(shù)［11］等。在非光學(xué)領(lǐng)域有探針成像技術(shù)，如掃描探針顯微鏡［12］、原子力顯微鏡［13］和掃描隧道顯微鏡［14］等。此外，使用X射線(xiàn)輻射成像技術(shù)也可對(duì)生物細(xì)胞進(jìn)行結(jié)構(gòu)重建［15］。由于上述若干技術(shù)尚不能對(duì)活性細(xì)胞進(jìn)行快速成像，因此，近十年來(lái)定量相位顯微技術(shù)在活性細(xì)胞快速顯微成像中脫穎而出，發(fā)展迅速。該技術(shù)融合了數(shù)字全息、光學(xué)顯微和現(xiàn)代數(shù)字圖像等技術(shù)，與傳統(tǒng)檢測(cè)方式相比，具有無(wú)損傷、無(wú)侵入、無(wú)電離輻射、無(wú)需染色、可實(shí)時(shí)、可定量等優(yōu)點(diǎn)，該方法已成為活性細(xì)胞顯微成像的一種主要技術(shù)。

對(duì)于類(lèi)球形均質(zhì)細(xì)胞，其形態(tài)結(jié)構(gòu)較為簡(jiǎn)單，折射率檢測(cè)比較容易，可應(yīng)用數(shù)字全息顯微技術(shù)［16］和灌水法［17］來(lái)檢測(cè)單介質(zhì)類(lèi)球形細(xì)胞的折射率。但是許多細(xì)胞不具有這樣的簡(jiǎn)單特征，往往為多介質(zhì)非球體，如白細(xì)胞，其折射率的檢測(cè)就相應(yīng)要困難。因此，多介質(zhì)非球體細(xì)胞折射率分布檢測(cè)技術(shù)的研究領(lǐng)域得到了國(guó)內(nèi)外眾多學(xué)者的關(guān)注。該類(lèi)檢測(cè)方法主要有正交相位成像熵層析法［18］、斷層相位顯微成像［19］、數(shù)字全息顯微成像［20］、掃描全息顯微成像［21］、定量相位成像法［22］、雙波長(zhǎng)法［23］、三波長(zhǎng)法［24］等。其中正交相位成像熵層析法是依據(jù)相位圖，通過(guò)最大熵方法迭代求出折射率的空間分布，但是空間網(wǎng)格的劃分產(chǎn)生了精準(zhǔn)度與速度的矛盾；斷層相位顯微成像、數(shù)字全息成像和掃描全息顯微成像等主要是利用衍射層析圖來(lái)解耦細(xì)胞折射率，由于采用的是多角度釆集吸收系數(shù)投影數(shù)據(jù)的實(shí)驗(yàn)方式，所以實(shí)驗(yàn)過(guò)程長(zhǎng)且計(jì)算量大；雙波長(zhǎng)法［25］和三波長(zhǎng)［24］法往往是基于定量相位成像或數(shù)字全息顯微成像方法來(lái)完成的，這些方法需要對(duì)相圖進(jìn)行特殊處理并做若干數(shù)學(xué)假設(shè)方能完成。此外，還有許多其他類(lèi)別的方法，如流式芯片檢測(cè)方法［26］、微球探針?lè)ǎ?7］、固體浸沒(méi)（solid immersion，SI）顯微方法［28］等，這類(lèi)方法存在著檢測(cè)對(duì)象的個(gè)性要求或者是實(shí)驗(yàn)平臺(tái)的特殊設(shè)計(jì)要求。Shan等［29］基于相位顯微成像的優(yōu)勢(shì)，利用統(tǒng)計(jì)色散關(guān)系（statistical dispersion relations，SDR）提出的SDR方法可在不需要厚度分布的情況下獲得細(xì)胞折射率的精準(zhǔn)分布結(jié)果，給該領(lǐng)域的研究帶來(lái)了新啟發(fā)。

綜上所述，基于細(xì)胞折射率分布檢測(cè)的重要意義，人們通過(guò)不斷的研究，已經(jīng)獲得了許許多多有效的細(xì)胞折射率的檢測(cè)方法，然而由于實(shí)驗(yàn)要求高、計(jì)算量大等主要因素的影響，折射率檢測(cè)方法的簡(jiǎn)單化、精準(zhǔn)化的研究仍然是人們努力的方向。由此，針對(duì)異形核細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)復(fù)雜、核的形態(tài)難以擬合的問(wèn)題，基于光傳輸理論和數(shù)學(xué)分析方法，本文提出了基于雙波長(zhǎng)三維相位成像下的折射率和厚度的解耦方法。該方法主要應(yīng)用相移和色散理論，基于相位顯微成像技術(shù)，利用相位分布和相位梯度分布特征及其與細(xì)胞結(jié)構(gòu)形態(tài)的關(guān)系，得到了雙波長(zhǎng)相位分布函數(shù)表示下的折射率和厚度分布的數(shù)學(xué)表達(dá)結(jié)果，由此利用穩(wěn)定的相位成像技術(shù)和比較簡(jiǎn)單的數(shù)學(xué)計(jì)算，可實(shí)現(xiàn)均質(zhì)和非均質(zhì)異形核細(xì)胞折射率和厚度分布的解耦。仿真實(shí)驗(yàn)的結(jié)果證明了該方法的有效性。

1 材料與方法

1.1 無(wú)核均質(zhì)細(xì)胞的折射率解耦方法

對(duì)于均質(zhì)無(wú)核細(xì)胞（如紅細(xì)胞），依據(jù)光強(qiáng)傳輸方程，當(dāng)光沿z軸透過(guò)樣品細(xì)胞時(shí)（為全文說(shuō)明方便，在此作外胞為球形，內(nèi)核為橢球形細(xì)胞模型，如圖1所示），在x-y面接收到的相位函數(shù)如下：

圖1 三維細(xì)胞模型Fig. 1 Three-dimensional cell modelR1為細(xì)胞質(zhì)半徑；a、b、c分別為細(xì)胞核沿x、y、z方向的半徑。R1 is the radius of cytoplasm; a, b, c is the radius of nucleus along x, y, z direction respectively.

式中，λi代表入射波長(zhǎng)，nci為不同光源下樣品由于色散原因的細(xì)胞質(zhì)的不同折射率，nmi為不同光源下環(huán)境液由于色散原因的不同折射率，h（x，y）為樣品厚度。

由式（1）可以看出，樣品的折射率與厚度信息相互耦合在相位信息中。在雙波長(zhǎng)相位顯微成像中，兩個(gè)波長(zhǎng)下的相移函數(shù)如下：

設(shè)不同波長(zhǎng)下折射率差為δn可得：

而當(dāng)選用色散系數(shù)高的環(huán)境液時(shí)，δnm>>δnc，由式（2）和式（3）可以得到：

由于環(huán)境液折射率可以預(yù)先得知，因此，由式（6）和式（7）分別可以得到細(xì)胞在不同波長(zhǎng)下的折射率，并且可以得到細(xì)胞厚度的分布，由此可實(shí)現(xiàn)均質(zhì)細(xì)胞折射率和厚度的解耦。

1.2 外胞類(lèi)球有核細(xì)胞的折射率解耦方法

成熟白細(xì)胞包括中性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞這幾類(lèi)，通常無(wú)色、球形、有核結(jié)構(gòu)，且由于表面張力等原因外胞多為類(lèi)球形，但核多為非球形（圖2）。

圖2 血細(xì)胞形態(tài)說(shuō)明圖Fig. 2 Illustration of blood cell morphology

在相位顯微成像中，如圖1所示，當(dāng)光沿z軸透過(guò)細(xì)胞樣品時(shí)，其相位將產(chǎn)生變化。根據(jù)相移理論，雙波長(zhǎng)下其相位表達(dá)式為：

式中，λ1、λ2為光的兩種不同的波長(zhǎng)，nh1、nh2分別為細(xì)胞核在兩波長(zhǎng)下的折射率，h1（x，y）、h2（x，y）為沿光軸方向細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核的厚度。對(duì)沿三個(gè)方向（x，y，z）相位成像的相位分布圖進(jìn)行梯度計(jì)算可得到其梯度分布圖，如圖3a～3c所示。依據(jù)圖3c的相位梯度分布可以找出非核區(qū)，即光僅通過(guò)細(xì)胞質(zhì)區(qū)的相位，此時(shí)相位分布可以由式（2）和式（3）表示，因此，在兩個(gè)波長(zhǎng)下細(xì)胞質(zhì)的折射率可由式（7）得到。

圖3 梯度分布Fig. 3 Gradient distribution（a）x軸方向梯度;（b）y軸方向梯度;（c）z軸方向梯度。(a) x-axis direction gradient; (b) y-axis direction gradient; (c) z-axis direction gradient.

針對(duì)外胞為類(lèi)球形的細(xì)胞，依據(jù)對(duì)相位圖分布外輪廓線(xiàn)的擬合結(jié)果，可以得到外胞半徑R1（圖1），其外胞厚度分布可以表示為：

其中x0、y0為樣品中心在坐標(biāo)系中的原點(diǎn)位置。

式（10）分別對(duì)x和y求偏導(dǎo)，可以得到如下表達(dá)式：

為求細(xì)胞核的厚度分布，上述式（8）對(duì)波長(zhǎng)求偏導(dǎo)后可以得到如下表達(dá)式：

式中，當(dāng)波長(zhǎng)滿(mǎn)足△λ=λ2-λ1<<λ1時(shí)，△φ=φλ2-φλ1，λ=λ1。

對(duì)方程組式（8）、式（9）求空間坐標(biāo)偏導(dǎo)，式中考慮細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核折射率不變，得到如下表達(dá)式：

式中，i對(duì)應(yīng)兩個(gè)波長(zhǎng)，。

選取特定點(diǎn)，確定其坐標(biāo)，從圖3a 、3b中選z軸截點(diǎn)較大處的細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核分界點(diǎn)，設(shè)其坐標(biāo)為（x1，y1），即滿(mǎn)足＝0。取其較小的截距視為細(xì)胞核厚度，即可得到h2（x1，y1）。由式（10）可以得到h1（x1，y1），將其結(jié)果代入式（12）可以得到△nh。如表達(dá)式（15）。

又因?yàn)椤鱪h-△nc=nh2-nh1-（nc2-nc1）=△nhc2-△nhc1，在式（11）中令可以得到其坐標(biāo)（x0，y0），將結(jié)果代入式（13），推導(dǎo)可以得到：

依據(jù)式（10）、（12）、（15）、（16）和（17）可以得到細(xì)胞核區(qū)的折射率、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核厚度參量的分布，即可求得nh、nc、h1、h2。

2 結(jié)果與分析

2.1 無(wú)核均質(zhì)細(xì)胞的仿真結(jié)果與分析

正常成熟的血紅細(xì)胞的形狀為雙凹圓盤(pán)狀，而且內(nèi)部無(wú)細(xì)胞核及其他細(xì)胞器，可被視為均質(zhì)細(xì)胞。為了說(shuō)明本文方法對(duì)無(wú)核均質(zhì)細(xì)胞折射率解耦的有效性，建立成熟紅細(xì)胞均質(zhì)模型，如圖4所示。該模型圖由式（18）鏡像組合而成，其中b為z軸方向半厚度。

圖4 紅細(xì)胞模型Fig. 4 Erythrocyte model

該紅細(xì)胞模型中半徑為4.00 μm，最大厚度為2.68 μm。光源波長(zhǎng)分別設(shè)置為532 nm和520 nm。在λ1（532 nm）下的折射率設(shè)置為nc1=1.410，λ2（520 nm）下的折射率設(shè)置為nc2=1.412。其環(huán)境液折射率在λ1下的折射率設(shè)置為nm1=1.451，λ2下的折射率設(shè)置為nm2=1.475。考慮到實(shí)驗(yàn)中噪聲的影響，在仿真實(shí)驗(yàn)中對(duì)相圖加入了35 dB的高斯白噪聲。

依據(jù)本文的方法，仿真實(shí)驗(yàn)得到雙波長(zhǎng)下的紅細(xì)胞相位分布，如圖5所示。圖5a和5b分別對(duì)應(yīng)波長(zhǎng)532 nm和520 nm下的相位分布。

圖5 仿真得到的紅細(xì)胞相位分布Fig. 5 Phase distribution of red blood cells obtained by simulation（a）λ1=532 nm；（b）λ2=520 nm。(a) λ1=532 nm; (b) λ2=520 nm.

依據(jù)本文的解耦理論，仿真計(jì)算得到其厚度和折射率分布如圖6和圖7所示。圖6b為結(jié)果與模型設(shè)置值在最大截面上的比較圖，其紅細(xì)胞厚度分布最大截面的最大相對(duì)誤差為3.989%。圖7b是過(guò)紅細(xì)胞中心的折射率曲線(xiàn)，計(jì)算得紅細(xì)胞折射率nc1與模型值的相對(duì)誤差為0.264%，折射率nc2與模型值的相對(duì)誤差為0.405%。由此說(shuō)明，本文的解耦方法對(duì)無(wú)核均質(zhì)細(xì)胞折射率解耦有效，并且可以得到較為精準(zhǔn)的厚度分布。

圖6 紅細(xì)胞厚度的仿真實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig. 6 Simulation results of red blood cell thickness（a）厚度3D分布；（b）圖（a）過(guò)y軸原點(diǎn)的厚度截面分布。(a) 3D thickness distribution; (b) Thickness section distribution across the y-axis origin of (a).

圖7 仿真得到的紅細(xì)胞折射率分布Fig. 7 Refractive index distribution of red blood cells obtained by simulation（a）折射率3D分布；（b）折射率曲線(xiàn)分布。(a) 3D distribution of refractive index; (b) Refractive index curve distribution.

2.2 有核細(xì)胞的仿真結(jié)果與分析

為了驗(yàn)證該方法的可行性，本文基于MATLAB數(shù)值仿真平臺(tái)進(jìn)行數(shù)值仿真實(shí)驗(yàn)。考慮到白細(xì)胞中為異形核，在此取細(xì)胞核為橢球形（圖1）。細(xì)胞質(zhì)外圍設(shè)半徑為8.0 μm，且其中心在坐標(biāo)原點(diǎn)，橢球核其長(zhǎng)、短半徑分別為3.5 μm和2.5 μm，光源波長(zhǎng)λ1=520 nm和λ2=532 nm，細(xì)胞質(zhì)在兩個(gè)波長(zhǎng)下的折射率分別為nc1=1.469和nc2=1.473，雙波長(zhǎng)下環(huán)境液折射率分別為nm1=1.451和nm2=1.467，細(xì)胞核折射率為nh1=1.483和nh2=1.520?？紤]到實(shí)際實(shí)驗(yàn)中的噪聲，在仿真實(shí)驗(yàn)相位圖中加入了30 dB的高斯白噪聲。

根據(jù)上述參數(shù)設(shè)置和定量相位成像原理，基于MATLAB平臺(tái)進(jìn)行仿真實(shí)驗(yàn)，得到兩個(gè)波長(zhǎng)下的相位分布，如圖8所示。

圖8 相位分布Fig. 8 Phase distribution（a）波長(zhǎng)λ1沿x軸方向的相位分布；（b）波長(zhǎng)λ1沿y軸方向的相位分布；（c）波長(zhǎng)λ1沿z軸方向的相位分布；（d）波長(zhǎng)λ2沿x軸方向的相位分布；（e）波長(zhǎng)λ2沿y軸方向的相位分布；（f）波長(zhǎng)λ2沿z軸方向的相位分布。 (a) Phase distribution of λ1 along the x-axis; (b) Phase distribution of λ1 along the y-axis; (c) Phase distribution of λ1 along the z-axis; (d) Phase distribution of λ2 along the x-axis; (e) Phase distribution of λ2 along the y-axis; (f) Phase distribution of λ2 along the z-axis.

依據(jù)本文的解耦理論，在高色散環(huán)境液中，δnm>>δnc即可以認(rèn)為△nc=0，仿真實(shí)驗(yàn)得到兩個(gè)波長(zhǎng)下的細(xì)胞質(zhì)折射率分別為nc1=nc2=1.466，兩個(gè)波長(zhǎng)下的細(xì)胞核折射率分別為nh1=1.490、nh2=1.545。誤差分析表明，波長(zhǎng)λ1下的細(xì)胞質(zhì)折射率相對(duì)誤差為0.175%，波長(zhǎng)λ2下的細(xì)胞質(zhì)折射率相對(duì)誤差為0.426%，細(xì)胞核仿真結(jié)果nh1與模型值的相對(duì)誤差為0.444%，nh2與模型值的相對(duì)誤差為1.436%。具體分析結(jié)果如表1所示。由此說(shuō)明，本文方法對(duì)于有核細(xì)胞解耦有效。

表1 誤差分析結(jié)果Tab. 1 Error analysis results

厚度分布仿真實(shí)驗(yàn)結(jié)果中細(xì)胞質(zhì)的直徑為h1（x，y）=15.764 μm，與模型值的相對(duì)誤差為1.475%，細(xì)胞核的厚度h2（x，y）分布如圖9所示。圖9b中紅色實(shí)線(xiàn)是過(guò)z軸在x-z最大截面上的厚度分布，其最大誤差發(fā)生在最大厚度值（4.784 μm）處，與模型值的相對(duì)誤差為4.32%。由此說(shuō)明，本文方法對(duì)異質(zhì)有核細(xì)胞的折射率解耦和厚度分布確定依然有效。

圖9 仿真得到的細(xì)胞核厚度分布Fig. 9 Nucleus thickness distribution obtained by simulation（a）2D厚度分布；（b）過(guò)胞核中心截面厚度分布。(a) 2D thickness distribution; (b) Thickness distribution across the center of the nucleus.

3 討論

當(dāng)今細(xì)胞折射率解耦技術(shù)主要可以分為厚度評(píng)估法和層析相位顯微法。厚度評(píng)估法主要是通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)構(gòu)設(shè)置或理論方法來(lái)對(duì)厚度進(jìn)行確定，繼而實(shí)現(xiàn)折射率解耦。這類(lèi)方法主要存在實(shí)驗(yàn)裝置設(shè)計(jì)復(fù)雜（如微流控自動(dòng)配對(duì)下的高通量細(xì)胞折射率的檢測(cè)方法）、實(shí)驗(yàn)方法會(huì)破壞細(xì)胞的原生狀態(tài)（如灌注介質(zhì)法會(huì)使細(xì)胞膨脹）、理論計(jì)算耗時(shí)長(zhǎng)（如對(duì)厚度進(jìn)行高斯-牛頓法求解下的非線(xiàn)性最小二乘迭代法求解折射率）等缺點(diǎn)。層析相位顯微法主要是通過(guò)光源或樣品的旋轉(zhuǎn)獲取眾多角度下的相位分布，從而進(jìn)行三維重建，由三維相位信息來(lái)確定折射率的分布。這類(lèi)方法雖然具有很高的精準(zhǔn)度，能夠在任何形態(tài)細(xì)胞中應(yīng)用，但是實(shí)驗(yàn)裝置復(fù)雜、實(shí)驗(yàn)時(shí)間長(zhǎng)、計(jì)算量大。本課題組提出的最大熵重建方法雖然避免了多角度相位成像，但是重建過(guò)程仍然需要一定的計(jì)算時(shí)間。傳統(tǒng)基于相位圖下的多波長(zhǎng)細(xì)胞折射率解耦方法往往需要許多假設(shè)條件，如對(duì)細(xì)胞折射率的預(yù)判或者是假設(shè)細(xì)胞為球體，尚不適應(yīng)非球形核的細(xì)胞。對(duì)此，本文所提出的基于三維相位顯微成像下的雙波長(zhǎng)細(xì)胞折射率和厚度解耦方法，主要利用無(wú)損三維相位顯微成像的相位信息，基于雙波長(zhǎng)相移數(shù)學(xué)表達(dá)，依據(jù)色散和相位梯度的特征分析，實(shí)現(xiàn)單介質(zhì)和雙介質(zhì)外胞類(lèi)球形血細(xì)胞折射率和厚度的解耦。本方法通過(guò)數(shù)值仿真驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明了其可行性。與基于正交相位圖下的兩波長(zhǎng)和三波長(zhǎng)傳統(tǒng)解耦方法相比較，本文方法對(duì)細(xì)胞核形態(tài)沒(méi)有要求，但是傳統(tǒng)方法由于利用的是正交相圖的邊緣輪廓作為分析依據(jù)［30］，這種情況下只有細(xì)胞核是球形時(shí)才能夠得到精準(zhǔn)結(jié)果，如果不是球形細(xì)胞核形態(tài)，只能近似到球形模型處理，此時(shí)得到的結(jié)果與真實(shí)情況比較必然存在著較大的誤差，所以本文的解耦方法具有較高的精準(zhǔn)性。本方法可對(duì)均質(zhì)細(xì)胞（如紅細(xì)胞）和外胞類(lèi)球形細(xì)胞（如白細(xì)胞五個(gè)亞類(lèi)）實(shí)現(xiàn)無(wú)損折射率和厚度分布的準(zhǔn)確解耦，因此在血細(xì)胞精準(zhǔn)分類(lèi)中具有重要的潛在應(yīng)用性，同時(shí)也適用于相位體亞結(jié)構(gòu)形態(tài)結(jié)構(gòu)的三維重建。