腫瘤抗原肽M1-10的抑瘤活性研究

黃文強(qiáng)，卜會(huì)銅，裴超柱，黃明敏，譚擁軍

（湖南大學(xué)生物學(xué)院，長(zhǎng)沙 410082）

全球疾病負(fù)擔(dān)研究顯示，大多數(shù)國(guó)家的惡性腫瘤發(fā)病率呈上升趨勢(shì)［1-2］，目前其主要的治療方式為化療和放療［3］。近年來(lái)，惡性腫瘤免疫治療這一新型治療方式備受關(guān)注［4］。腫瘤細(xì)胞通常特異性高表達(dá)一些蛋白或表達(dá)一些突變蛋白，這些蛋白質(zhì)可在胞內(nèi)降解成8至11個(gè)氨基酸組成的寡肽，通過(guò)人類(lèi)白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）呈遞到癌細(xì)胞表面，引發(fā)T細(xì)胞響應(yīng)而殺死細(xì)胞。這些寡肽被稱(chēng)為腫瘤抗原。開(kāi)發(fā)新的腫瘤抗原是提高腫瘤免疫治療水平的重要手段之一。目前，基于腫瘤抗原的腫瘤多肽疫苗已在多種惡性腫瘤中顯示出良好的抑瘤效果［5-6］，且與其他相關(guān)抗原［7］或免疫檢查點(diǎn)抑制劑共同使用時(shí)產(chǎn)生的治療效果更好［8-9］。

FOXM1是FOX轉(zhuǎn)錄因子家族的成員［10］，在許多惡性腫瘤如卵巢癌、乳腺癌、宮頸癌等中呈高表達(dá)，而在正常組織中不表達(dá)或低表達(dá)［11-14］，預(yù)示在多種惡性腫瘤中，F(xiàn)OXM1可能是腫瘤抗原的來(lái)源蛋白。目前針對(duì)FOXM1作為腫瘤藥物靶點(diǎn)的研究主要集中在對(duì)其轉(zhuǎn)錄活性功能進(jìn)行抑制，從而阻遏細(xì)胞生長(zhǎng)和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［15］，而以FOXM1蛋白為對(duì)象開(kāi)發(fā)抗腫瘤疫苗才剛剛起步。已有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXM1蛋白的特定肽段可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生HLA-A2限制性的細(xì)胞毒性T細(xì)胞響應(yīng)；對(duì)宮頸癌患者進(jìn)行臨床I期研究，將FOXM1（262～270）肽段與VEGFR1［12］、VEGFR2［12］、MELK［16］、HJURP［17］來(lái)源的四種抗原肽段聯(lián)合接種，引發(fā)T細(xì)胞響應(yīng)且未發(fā)現(xiàn)劑量毒性，患者臨床反應(yīng)良好，初步顯示其具有抗腫瘤療效。因此，以FOXM1蛋白為對(duì)象篩選腫瘤抗原并開(kāi)發(fā)抗腫瘤疫苗，是腫瘤免疫治療研發(fā)的有效策略。

本課題組圍繞FOXM1與惡性腫瘤開(kāi)展了分子機(jī)制研究和生物藥物開(kāi)發(fā)［18］。在此基礎(chǔ)上，我們篩選得到FOXM1肽段（719～728）作為腫瘤抗原肽，命名為M1-10。通過(guò)細(xì)胞試驗(yàn)和兩種小鼠乳腺癌模型開(kāi)展了M1-10的免疫原性和抑瘤活性分析，證實(shí)了該肽的抑瘤效果，獲得了一種新的腫瘤抗原肽。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

二氯樹(shù)脂、氨基酸購(gòu)于希施生物科技有限公司；二甲基甲酰胺（N，N-Dimethylformamide，DMF）、哌啶（Piperidine，PIP）、N，N-二異丙基乙胺（N，N-Diisopropylethylamine，DIEA）、O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯（O-Benzotriazole-N，N，N'，N'-tetramethyl-uronium-hexafluorophosphate，HBTU）、二氯甲烷（dichloromethane，DCM）、三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）、乙二硫醇（ethanedithiol，EDT）、三異丙基硅烷（triisopropylsilane，TIS）、無(wú)水乙醚、乙腈（色譜級(jí)）、無(wú)水乙醇、甲醇、異丙醇、吡啶等購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，不完全弗氏佐劑購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基（Dulbecco’s modified Eagle medium，DMEM）、RP1640培養(yǎng)基以及胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購(gòu)于GIBCO公司；乳腺癌4T1細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)（American type culture collection，ATCC）；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）、乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒以及Mouse IFN-γ ELISA試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司；小鼠淋巴細(xì)胞分離液、200目尼龍網(wǎng)購(gòu)自達(dá)科為公司；BALB/c小鼠購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，MMTVPyMT基因型小鼠購(gòu)自邦耀生物公司。

多肽合成儀購(gòu)買(mǎi)于希施生物科技有限公司；高效液相色譜儀購(gòu)買(mǎi)于廣州睿栢儀器科技有限公司；AKTA蛋白純化儀購(gòu)買(mǎi)于通用電器公司（General Electric Company，GE）；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)買(mǎi)于美國(guó)Thermo公司；倒置熒光顯微鏡購(gòu)買(mǎi)于日本Nikon公司；微孔板檢測(cè)儀（酶標(biāo)儀）購(gòu)買(mǎi)于上海美谷分子儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 抗原肽的篩選

使用抗原表位預(yù)測(cè)軟件NetMHCpan和IEDB對(duì)FOXM1的C端相關(guān)肽段進(jìn)行預(yù)測(cè)。篩選出與HLA-A2分子結(jié)合等級(jí)最高的抗原肽，通過(guò)分子模擬軟件Chimera 1.15繪制出抗原肽的分子結(jié)構(gòu)。從PDB數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.rcsb.org/）中查找HLA-A2所對(duì)應(yīng)的PDB文件并下載。通過(guò)三維分子模擬軟件PyMOL將篩選出的抗原肽擺放至HLA-A2分子結(jié)合口袋附近，并保存為PDB文件。通過(guò)分子對(duì)接軟件FlexPepDock預(yù)測(cè)出最優(yōu)的結(jié)合模型，再通過(guò)數(shù)據(jù)處理工具Rosetta計(jì)算出兩者結(jié)合的重要參數(shù)。

1.2.2 抗原肽的合成、純化及鑒定

使用固相多肽合成儀分別合成M1-10、HJURP、MELK、VEGFR1、VEGFR2五種抗原肽，將合成的抗原肽粗品在蛋白純化儀上使用C18柱反向?qū)游鲞M(jìn)行純化。對(duì)純化出的多肽進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，再用高效液相色譜儀進(jìn)行純度檢測(cè)，通過(guò)出峰面積百分比得出多肽質(zhì)量濃度。

各抗原肽的序列信息如下。M1-10：ILLDISFPGL；MELK-87-7N：EYCPGGNLF；HJURP-408：KWLISPVKI；VEGFR1-1084：SYGVLLWEI；VEGFR2-169：RFVPDGNRI。

1.2.3 抗原肽對(duì)預(yù)免疫后小鼠淋巴細(xì)胞的增殖、 干擾素γ釋放以及殺傷作用的影響

將年齡為5周左右的BALB/c健康小鼠（Mus musculus）隨機(jī)分成4組，分別注射PBS、M1-10、4種抗原肽（HJURP、MELK、VEGFR1、VEGFR2）、5種抗原肽（M1-10、HJURP、MELK、VEGFR1、VEGFR2），以上4組均與不完全弗氏佐劑混合注射，進(jìn)行預(yù)免疫試驗(yàn)。每周免疫1次，共3次。每種抗原肽的劑量為100 μg，注射方式為皮下注射。待預(yù)免疫結(jié)束后，將小鼠斷頸處死。在無(wú)菌的條件下取出小鼠的脾臟，分離出脾臟內(nèi)的淋巴細(xì)胞，使用含10% FBS的RP1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

采用CCK-8法測(cè)定抗原肽對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞增殖的影響。將上述分離的4組淋巴細(xì)胞分別接種到96孔板中，每孔3×105個(gè)細(xì)胞，之后使用對(duì)應(yīng)的4組抗原肽組合進(jìn)行刺激。每種刺激物的質(zhì)量濃度為100 μg/mL，置于37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。待培養(yǎng)時(shí)間結(jié)束，各孔加入10 μL CCK-8檢測(cè)試劑，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，之后使用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)定各孔的吸光值。

使用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定抗原肽對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞釋放干擾素γ的影響。將上述分離的4組淋巴細(xì)胞以每孔1.5×105個(gè)細(xì)胞分別接種到96孔板中，之后分別使用對(duì)應(yīng)的4組抗原肽組合進(jìn)行刺激。每種刺激物的質(zhì)量濃度為100 μg/mL，置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。待培養(yǎng)結(jié)束，將各孔的培養(yǎng)液分別轉(zhuǎn)移到1.5 mL的離心管中，500×g離心，吸取上清，保存?zhèn)溆谩Ｊ褂肕ouse IFN-γ ELISA試劑盒測(cè)定上述收集的上清中淋巴細(xì)胞釋放IFN-γ的量，按照試劑盒的說(shuō)明書(shū)中詳細(xì)的操作步驟進(jìn)行操作。

使用乳酸脫氫酶法（lactate dehydrogenase，LDH）測(cè)定淋巴細(xì)胞的細(xì)胞殺傷作用。在正常情況下，細(xì)胞中的乳酸脫氫酶不會(huì)釋放到胞外，而當(dāng)細(xì)胞受損或死亡時(shí)，其會(huì)在胞外富集，此時(shí)該酶的含量就與細(xì)胞的死亡數(shù)成正比。該試驗(yàn)采用的靶細(xì)胞為小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞，效應(yīng)細(xì)胞為上述分離得到的淋巴細(xì)胞。將靶細(xì)胞以每孔1×104個(gè)細(xì)胞接種到96孔板中，待細(xì)胞貼壁后，再分別加入上述分離的4組淋巴細(xì)胞，以靶效比（target effect ratio，T∶E ratio）為1∶25和1∶50進(jìn)行混合，同時(shí)設(shè)置靶細(xì)胞自然釋放孔、淋巴細(xì)胞自然釋放孔以及靶細(xì)胞最大釋放孔作為對(duì)照。將上述96孔板放入37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，按照乳酸脫氫酶試劑盒中步驟進(jìn)行操作，最后使用酶標(biāo)儀在490 nm處測(cè)定各孔的吸光值，計(jì)算殺傷率。

1.2.4 抗原肽在兩種動(dòng)物模型上的抑瘤效果

待健康狀況良好的BALB/c小鼠年齡達(dá)到5周左右時(shí)，分別注射PBS、M1-10、4種抗原肽（HJURP、MELK、VEGFR1、VEGFR2）、5種抗原肽（M1-10、HJURP、MELK、VEGFR1、VEGFR2），以上4組均與不完全弗氏佐劑混合注射，進(jìn)行預(yù)免疫試驗(yàn)，每周免疫1次，共3次。每種抗原肽的劑量為100 μg，注射方式為皮下注射。待3次免疫結(jié)束，間隔1周后，對(duì)免疫后的小鼠皮下接種5×105個(gè)4T1乳腺癌細(xì)胞，建立移植瘤模型，等腫瘤長(zhǎng)到可測(cè)量的大小時(shí)測(cè)量小鼠的體重和腫瘤大小。

待健康狀況良好的MMTV-PyMT原發(fā)乳腺癌雌性小鼠2周大時(shí)，取其尾尖裂解進(jìn)行基因型鑒定。其中正向引物為GGAAGCAAGTACTTCACAAGGG，反向引物為 GGAAAGTCACTAGGAGCAGGG。反應(yīng)體系：正向引物和反向引物各1 μL，模板2 μL，金牌mix酶16 μL。PCR反應(yīng)條件：98℃預(yù)變性5 min；98℃變性15 s；58℃退火20 s；72℃延伸10 s，共32個(gè)循環(huán)；最后72℃再延伸5 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳分離，觀察目的條帶。目的條帶大約為500 bp，即鑒定為陽(yáng)性。

取鑒定為陽(yáng)性的MMTV-PyMT原發(fā)乳腺癌雌性小鼠，待其生長(zhǎng)到5周左右開(kāi)始進(jìn)行預(yù)免疫試驗(yàn)，免疫方案和之前的一樣。免疫結(jié)束后，定期觀察小鼠乳腺部位腫瘤生長(zhǎng)的情況，期間做好小鼠體重變化和腫瘤體積變化的記錄。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有試驗(yàn)結(jié)果均采用Prism軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料使用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。試驗(yàn)得到的數(shù)據(jù)通過(guò)Two-way ANOVA或t檢驗(yàn)計(jì)算得到P值，其統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異用星號(hào)*表示，其中*P≤0.05，**P≤0.01，***P≤0.001。P＜0.05則認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗原肽M1-10的預(yù)測(cè)及分析

已有研究發(fā)現(xiàn)［19］，來(lái)源于FOXM1蛋白的FOXM1（709～728）肽段能夠顯著抑制腫瘤的生長(zhǎng)。于是我們使用該肽段進(jìn)行了抗原表位預(yù)測(cè)分析，共得到21種肽段，其中只有5種肽段能夠與HLA-A2分子結(jié)合。通過(guò)比較這5種肽段與HLA-A2的結(jié)合分?jǐn)?shù)，發(fā)現(xiàn)肽段FOXM1（719～728），即M1-10（ILLDISFPGL）與HLA-A2分子結(jié)合分?jǐn)?shù)最高（圖1a），結(jié)合等級(jí)也最強(qiáng)（圖1b，分?jǐn)?shù)小于0.5為強(qiáng)結(jié)合）。通過(guò)分子模擬軟件Chimera 1.15繪制出HLA-A2分子和抗原肽的分子結(jié)構(gòu)，之后通過(guò)分子對(duì)接軟件和數(shù)據(jù)處理工具Rosetta分析M1-10與HLA-A2分子的對(duì)接情況（圖1c）以及相關(guān)的結(jié)合參數(shù)。此外，本文對(duì)應(yīng)用于臨床I期研究的FOXM1（262～270）也進(jìn)行了上述的對(duì)接分析（圖1d），通過(guò)比較M1-10、FOXM1（262～270）與HLA-A2結(jié)合的相關(guān)參數(shù)，發(fā)現(xiàn)M1-10與HLA-A2分子的結(jié)合更強(qiáng)（表1）。

圖1 抗原肽M1-10的預(yù)測(cè)與分析Fig. 1 Prediction and analysis of antigenic peptides M1-10（a）抗原肽M1-10的預(yù)測(cè)分?jǐn)?shù)；（b）抗原肽M1-10與HLA-A2的結(jié)合等級(jí)；（c）抗原肽M1-10與HLA-A2的結(jié)合情況；（d）抗原肽FOXM1（262～270）與HLA-A2的結(jié)合情況。SB：強(qiáng)結(jié)合；WB：弱結(jié)合。(a) The predicted score of antigenic peptide M1-10; (b) The binding grade of antigenic peptide M1-10 to HLA-A2; (c) The binding of antigenic peptide M1-10 to HLA-A2; (d) Antigenic peptide FOXM1 (262～270) binding to HLA-A2. SB: Strong binder; WB: Weak binder.

表1 對(duì)接結(jié)合的重要參數(shù)Tab. 1 Important parameters of docking and combination

2.2 抗原肽的合成與鑒定

為了檢測(cè)多肽是否合成成功，我們對(duì)所合成的抗原肽進(jìn)行了質(zhì)譜分析以及純度檢測(cè)（圖2），結(jié)果顯示，M1-10、HJURP、MELK、VEGFR1、VEGFR2分別在1086、1084、998、1080、1074處有明顯峰圖。這與各個(gè)抗原肽的相對(duì)分子質(zhì)量一致，說(shuō)明合成成功，并且使用高效液相色譜對(duì)合成的抗原肽進(jìn)行純度檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)五種抗原肽的質(zhì)量濃度均在90%以上。

圖2 抗原肽的鑒定及純度檢測(cè)Fig. 2 Identification and purity detection of antigen peptides（a）M1-10；（b）HJURP；（c）MELK；（d）VEGFR1；（e）VEGFR2。(a) M1-10; (b) HJURP; (c) MELK; (d) VEGFR1; (e) VEGFR2.

2.3 抗原肽M1-10可在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)有效的免疫記憶

已有研究證實(shí)，致敏后的淋巴細(xì)胞再次受到同種抗原肽刺激時(shí)會(huì)發(fā)生增殖、分泌細(xì)胞因子干擾素γ以及分化為細(xì)胞毒性T細(xì)胞，從而對(duì)靶細(xì)胞進(jìn)行殺傷。因此，為了分析抗原肽M1-10是否能在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)免疫記憶，我們通過(guò)CCK-8試劑盒、Mouse IFN-γ ELISA試劑盒以及乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒，使用各組對(duì)應(yīng)的抗原肽組合，依次對(duì)預(yù)免疫后小鼠淋巴細(xì)胞的增殖情況、干擾素γ的釋放情況以及淋巴細(xì)胞的殺傷作用進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)使用抗原肽M1-10能顯著促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增殖，也可促進(jìn)淋巴細(xì)胞釋放細(xì)胞因子干擾素γ，當(dāng)M1-10與其他4種抗原肽聯(lián)用時(shí)，其展現(xiàn)的效果更加明顯（圖3a、3b）；此外，抗原肽M1-10也能促進(jìn)淋巴細(xì)胞分化為細(xì)胞毒性殺傷T細(xì)胞，并對(duì)4T1細(xì)胞進(jìn)行殺傷（圖3c）。細(xì)胞殺傷試驗(yàn)顯示，當(dāng)靶效比為1∶25時(shí)，各組的殺傷作用不太明顯，但當(dāng)靶效比為1∶50時(shí)，M1-10與其他4種抗原肽聯(lián)用時(shí)的殺傷率達(dá)到了30%，并且殺傷率可隨著效應(yīng)細(xì)胞的增多而上升。這些結(jié)果表明，使用抗原肽M1-10對(duì)小鼠進(jìn)行預(yù)免疫，可在小鼠體內(nèi)形成有效的免疫記憶。

圖3 抗原肽可促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖、釋放干擾素γ以及細(xì)胞殺傷作用Fig. 3 Antigenic peptides can promote lymphocyte proliferation, release interferon gamma, and cell killing （a）淋巴細(xì)胞增殖；（b）淋巴細(xì)胞釋放干擾素γ；（c）淋巴細(xì)胞的殺傷作用。(a) Proliferation of lymphocytes; (b) Interferon gamma release by lymphocytes; (c) Killing effects of lymphocytes.

2.4 抗原肽M1-10預(yù)免疫可明顯抑制BALB/c荷瘤小鼠腫瘤的生長(zhǎng)

試驗(yàn)分為4組，每組分別使用PBS、M1-10、4種抗原肽（HJURP、MELK、VEGFR1、VEGFR2）、5種抗原肽（M1-10、HJURP、MELK、VEGFR1、VEGFR2），均與不完全弗氏佐劑混合注射，對(duì)5周大的BALB/c小鼠進(jìn)行預(yù)免疫試驗(yàn)，每周免疫1次，共3次。每種抗原肽的劑量為100 μg，注射方式為皮下注射。待3次免疫結(jié)束，間隔1周后，進(jìn)行皮下植瘤（圖4a），觀察小鼠體重和腫瘤體積的變化。試驗(yàn)過(guò)程中，抗原肽無(wú)明顯毒性（圖4b），各試驗(yàn)組腫瘤體積均小于PBS對(duì)照組（圖4c）。試驗(yàn)終止時(shí)，收集各組皮下瘤觀察大?。▓D4d）并稱(chēng)重（圖4e）。以上結(jié)果表明，M1-10抗原肽預(yù)免疫能有效抑制腫瘤生長(zhǎng)，呈現(xiàn)出良好的抑瘤效果，5種抗原肽聯(lián)用時(shí)進(jìn)一步提升了腫瘤的免疫效應(yīng)。

圖4 抗原肽預(yù)免疫在BALB/c荷瘤小鼠模型中抑瘤效果的驗(yàn)證Fig. 4 Validation of antitumor effects of antigen peptide pre-immunization in BALB/c tumor-bearing mouse model （a）BALB/c小鼠預(yù)免疫過(guò)程；（b）BALB/c小鼠的體重變化；（c）BALB/c小鼠的腫瘤體積變化；（d）各組小鼠腫瘤的最終大?。唬╡）各組小鼠腫瘤的質(zhì)量。(a) Pre-immunization process of BALB/c mice; (b) Body weight change of BALB/c mice; (c) Tumor volume change of BALB/c mice; (d) Final tumor size of mice in each group; (e) The weight of tumor in each group of mice.

2.5 抗原肽M1-10預(yù)免疫可明顯抑制MMTVPyMT原發(fā)乳腺癌小鼠腫瘤的生長(zhǎng)

已有研究證實(shí)［20］，經(jīng)PCR和瓊脂糖凝膠電泳鑒定為陽(yáng)性的MMTV-PyMT原發(fā)乳腺癌小鼠會(huì)在乳腺部位自發(fā)形成腫瘤（圖5a），因此，我們?cè)诘?周分別將PBS、M1-10、4種抗原肽（HJURP、MELK、VEGFR1、VEGFR2）、5種抗原肽（M1-10、HJURP、MELK、VEGFR1、VEGFR2）與弗氏不完全佐劑混合，對(duì)鑒定為陽(yáng)性的MMTV-PyMT原發(fā)乳腺癌小鼠進(jìn)行皮下免疫，免疫3次后觀察小鼠腫瘤的生長(zhǎng)情況。試驗(yàn)過(guò)程中（圖5b），抗原肽無(wú)明顯毒性（圖5c）；此外，各抗原肽組與對(duì)照組相比呈現(xiàn)出較好的治療效果，其中5種抗原肽混合組的抑瘤效果最好（圖5d）。試驗(yàn)終止時(shí)，收集各組小鼠的腫瘤稱(chēng)重并對(duì)比大?。▓D5e、5f）。這些結(jié)果都表明，在MMTV-PyMT原發(fā)瘤小鼠模型中，抗原肽M1-10預(yù)免疫也能有效抑制腫瘤生長(zhǎng)，當(dāng)M1-10與其他4種抗原肽聯(lián)用時(shí)進(jìn)一步提升了腫瘤的免疫效應(yīng)。

圖5 抗原肽預(yù)免疫在MMTV-PyMT原發(fā)乳腺癌小鼠模型中抑瘤效果的驗(yàn)證Fig. 5 Validation of antitumor effect of antigen peptide pre-immunization in MMTV-PyMT primary breast cancer mouse model （a）MMTV-PyMT原發(fā)乳腺癌小鼠PCR鑒定結(jié)果。1為陽(yáng)性小鼠基因組，2為陰性小鼠基因組，3和4為試驗(yàn)鑒定鼠；（b）MMTV-PyMT原發(fā)乳腺癌小鼠預(yù)免疫過(guò)程；（c）MMTV-PyMT原發(fā)乳腺癌小鼠體重變化；（d）MMTV-PyMT原發(fā)乳腺癌小鼠腫瘤體積變化；（e）每組小鼠腫瘤的質(zhì)量；（f）各組小鼠腫瘤的最終大小。(a) PCR identification results of MMTV-PyMT primary breast cancer mice. 1 is positive mouse genome, 2 is negative mouse genome, 3 and 4 are experimentally identified mice; (b) Pre-immunization process of MMTV-PyMT primary breast cancer mice; (c) Body weight changes of MMTVPyMT primary breast cancer mice; (d) Tumor volume changes of MMTV-PyMT primary breast cancer mice; (e) Tumor weight of mice in each group; (f) Final tumor size of mice in each group.

3 討論

腫瘤的免疫療法是通過(guò)刺激和增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，從而對(duì)腫瘤進(jìn)行控制和殺傷的。目前主要的免疫療法分為三類(lèi)，即主動(dòng)免疫治療（DC疫苗、多肽疫苗等）、被動(dòng)免疫治療（抗體、效應(yīng)細(xì)胞等）、免疫檢查點(diǎn)治療（PD1、CTLA-4等）。腫瘤多肽疫苗就屬于主動(dòng)免疫治療，通過(guò)腫瘤特異性抗原和相關(guān)抗原誘發(fā)機(jī)體特異性免疫應(yīng)答。與其他腫瘤疫苗相比，肽疫苗因易合成、安全性良好、能特異性激活免疫細(xì)胞等優(yōu)點(diǎn)已成為研究的熱門(mén)［21］。

在本研究中，抗原肽M1-10來(lái)源于FOXM1，而FOXM1在多種惡性腫瘤中高表達(dá)，在正常組織中低表達(dá)或不表達(dá)，這意味著FOXM1可能是腫瘤抗原的來(lái)源蛋白。本文通過(guò)淋巴細(xì)胞增殖、干擾素γ釋放及細(xì)胞殺傷試驗(yàn)，證實(shí)了抗原肽M1-10可在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)免疫記憶。在細(xì)胞殺傷試驗(yàn)中，當(dāng)效靶比為1∶25時(shí)，殺傷作用無(wú)顯著性差異，可能是由于效應(yīng)細(xì)胞數(shù)目不夠，對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷力不足；但當(dāng)效靶比為1∶50時(shí)，每組的殺傷作用都明顯上升，說(shuō)明殺傷作用可隨著效應(yīng)細(xì)胞的數(shù)量增加而上升。在兩種小鼠腫瘤模型中，M1-10均顯示出了良好的免疫原性，可被抗原遞呈細(xì)胞上的MHC分子識(shí)別并結(jié)合，之后被T淋巴細(xì)胞的TCR受體所捕獲，形成肽-HLA-TCR復(fù)合體，誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化成細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（cytotoxiclymphocyte，CTL），從而對(duì)表達(dá)此類(lèi)抗原的腫瘤進(jìn)行殺傷。此外，我們還使用M1-10與來(lái)源于MELK、HJURP、VEGFR1、VEGFR2的4種抗原肽聯(lián)用進(jìn)行試驗(yàn)，以誘發(fā)更強(qiáng)的免疫應(yīng)答，結(jié)果也與細(xì)胞試驗(yàn)的情況一致，所產(chǎn)生的抑瘤效果比單獨(dú)使用抗原肽M1-10要好。

盡管肽疫苗具有較多的優(yōu)點(diǎn)，也具有較好的臨床效果，但也存在一定的不足。多肽疫苗由于其免疫原性強(qiáng)度有限和體內(nèi)不穩(wěn)定性等因素，使得它們易于被蛋白酶體所降解［22］。目前對(duì)于多肽的優(yōu)化有多種策略，如鑒定出多肽發(fā)揮功能的特異性位點(diǎn)之后，對(duì)該多肽的其他位點(diǎn)進(jìn)行氨基酸替換，從而優(yōu)化其水溶解性；此外，可將該線(xiàn)性多肽制備成環(huán)狀多肽［23］，又或者將這些混合的抗原肽制備成相應(yīng)的納米顆粒，進(jìn)一步提高多肽的免疫原性和穩(wěn)定性，更好地誘發(fā)機(jī)體免疫。